中国组织工程研究杂志
Chinese Journal of Tissue Engineering Research 중국조직공정구여림상강복
- 主管单位： 中华人民共和国卫生部
- 主办单位： 中国康复医学会,《中国组织工程研究与临床康复》杂志社
- 影响因子： 1.38
- 审稿时间： 1-3个月
- 国际刊号： 2095-4344
- 国内刊号： 21-1581/R
- 论文标题 期刊级别 审稿状态
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肿瘤干细胞的分离与纯化研究进展
随着肿瘤干细胞学说的日趋成熟,针对干细胞的靶向治疗已成为新的理论,分离与纯化肿瘤干细胞是研究的重要组成部分.目前国内外主要根据肿瘤干细胞已知的细胞表型和生物学特性,用流式细胞仪分选法、磁性激活细胞分选法和旁群细胞分选法来分离与纯化肿瘤干细胞,为肿瘤的临床诊断与治疗提供了依据.
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人脐血间质干细胞静脉输注对60Co γ射线照射小鼠脾脏细胞生物学效应的影响
背景:研究发现,脐血间质干细胞对辐射损伤有一定的防护作用.目的:实验拟观察脐血间质干细胞静脉输注对照射小鼠脾脏细胞生物学效应的影响,验证其防辐射损伤作用.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2007-04/10在广东医学院实验动物中心完成.材料:将体质量(20.0±1.5)g的雌性昆明种小鼠随机分为正常对照组、单纯照射对照组、60Coγ射线照射前静脉注射脐血间质干细胞组,每组30只.新鲜脐带血来源十本院妇产科健康产妇.方法:以无菌塑料采血袋按密闭式方法采集足月新生儿脐带血80～140 mL,无菌条件下将脐带血液采集到含有ACD-B保养液的无菌采血袋内,并按照卫生部检测血液的标准检测每一份脐带血液,采集、分离间质干细胞.60Co γ射线照射小鼠,通过尾静脉将分离获得的人脐血间质干细胞输注入小鼠体内,细胞数≥1×108份,照射后当天再次输注人脐血间质干细胞.主要观察指标:应用流式细胞仪检测脾脏细胞的凋亡指数和免疫参数.结果:与单纯照射组相比,60Co γ射线照射前静脉注射脐血间质干细胞组的G0/G1期细胞比例F降,而S、G2M期细胞比例均有不同程度的升高.经照射后,小鼠脾细胞的凋亡率明显增加,脐血间质干细胞对细胞的凋亡有一定保护作用,同时能够提高细胞的增殖率.单纯照射组的NK细胞、CD4+和CD8+标记率明显低于正常对照组,而脐血间质干细胞能显著地提高它们的活性.结论:脐血间质干细胞静脉输注对辐射造成的脾细胞损伤有一定保护作用,可促进脾脏细胞的分裂增殖,加速脾脏细胞的修复.其作用机制可能与提高NK细胞活性和CD4+、CD8+数量有关.
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脑源性神经营养因子基因修饰骨髓间充质干细胞治疗坐骨神经损伤
背景:对周围神经损伤的治疗,目前希望能提高损伤局部的脑源性神经营养因子浓度来促进神经的修复再生.目的:观察坐骨神经损伤大鼠体内植入脑源性神经营养因子基因修饰的骨髓间充质干细胞后神经纤维的再通及运动功能的恢复情况.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2007-05/2008-05在福建省神经病学研究所完成.材料:无菌条件下取2月龄F344雄性大鼠股骨、胫骨制备骨髓间充质干细胞.利用构建好的慢病毒载体PNL-BDNF-IRES2-EGFP制备脑源性神经营养因子基因修饰的骨髓间质干细胞.方法:将60只成年SD大鼠经钳夹制作成右坐骨神经损伤模型,随机分为磷酸盐缓冲液组,骨髓间质干细胞组,脑源性神经营养因子基因修饰骨髓间质干细胞组.在损伤处分别注射磷酸盐缓冲液2 μ L,骨髓间质干细胞混悬液2 μ L和脑源性神绛营养因子基因修饰骨髓间质干细胞混悬液2 μL.主要观察指标:在术后2,4周,通过辣根过氧化物酶示踪观察损伤侧L4,5脊髓前角存活的神经细胞数目,通过测量坐骨神经功能指数值观察大鼠损伤侧肢体运动功能恢复情况,同时应用荧光激发及免疫组化技术检测骨髓间质干细胞存活和脑源性神经营养因子表达情况.结果:脑源性神终营养因子基因修饰骨髓间质干细胞组损伤侧L4,5脊髓前角细胞的存活数目多于磷酸盐缓冲液组和骨髓间质干细胞组,并且神经功能恢复也比其他两组好.骨髓间质干细胞组和脑源性神经营养因子基因修饰骨髓间质干细胞组可观察到神经损伤处有较多的骨髓间质干细胞存活,并且脑源性神经营养因子基因修饰骨髓间质干细胞组脑源性神经营养因子表达明显比骨髓间质干细胞组多.结论:脑源性神经营养因子基因修饰骨髓间质干细胞对周围神经损伤后神经纤维的再通及功能恢复有促进作用.
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同种异基因大鼠间充质干细胞移植对体内CD4+CD25+T细胞的影响
背景:间充质干细胞的免疫抑制作用近年来逐渐得到证实并开始应用丁临床,但相关研究成果主要来源于体外细胞实验.目的:观察同种异基因大鼠骨髓间充质干细胞从静脉输入后对体内CD4+CD25+调节性干细胞的影响.-设计、时间及地点:以动物为对象的对照观察实验,于2008-03/09在南方医科大学珠江医院移植免疫研究所完成.材料:Wistar大鼠6只用于制备骨髓间充质干细胞,SD大鼠20只作为输注骨髓间充质干细胞的受体鼠.方法:从Wistar大鼠骨髓分离培养间充质干细胞,取第3～5代细胞进行实验.①体外淋巴细胞增殖实验:首先将间充质干细胞悬液从尾静脉注入SD大鼠体内10 d后脱臼处死,取大鼠脾脏制备脾淋巴细胞.实验分5组:分别为脾淋巴细胞/骨髓间充质干细胞为1:10,1:50,1:100+ConA 5 μg组,脾淋巴细胞+ConA 5μg组(增殖组),单纯淋巴细胞组(空白组),检测共培养体系中CD4+CD25+/CD4+T淋巴细胞比率.②体内注射骨髓间充质干细胞实验:将5×109L-1,5×108 L-1,5×107L-1间充质干细胞及PBS静脉输入SD大鼠体内,10 d后取受体鼠胸腺、脾脏、外周血检测CD4+CD25+/CD4+T淋巴细胞比率.主要观察指标:①淋巴细胞增殖体系中CD4+CD25+CD4+比率的变化.②SD大鼠胸腺、脾脏、外周血CD4+CD25+/CD4+比率的变化.结果:①体外淋巴细胞共培养体系中,1:10组T细胞亚群CD4+CD25+/CD4+细胞百分率较增殖组显著升高(P<0.01).②体内输注间充质干细胞达5×109L-1的受体鼠外周血和脾脏CD4+CD25+/CD4+T细胞比率上升,与输注PBS组相比有显著差异(P<0.05),而在胸腺中各组比率无明显差异.结论:岛浓度同种异基因大鼠间充质干细胞不仪可以在体外实验中增加CD4+CD25+/CD4+T细胞比率,静脉输入后仍具有相同作用.
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羊膜负载骨髓干细胞与角朊细胞对放创性全厚皮肤缺损创面胶原合成的影响
背景:人羊膜含胶原、糖蛋白、蛋白多糖和整合素等多种成分,它表达多种生长因子mRNA及其相关蛋白,有利于细胞的生长繁殖,能负载猪骨髓间充质干细胞与角朊细胞良好生长.目的:拟验证人羊膜负载骨髓间充质干细胞与角朊细胞对放创性全厚皮肤缺损创面胶原合成的影响.设计、时间及地点:同体对比观察.实验于2007-06/12在解放军第二军医大学顶防医学院全军复合伤研究所,创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室完成.材料:贵州小香猪8只,3～6月龄;雌雄不限,体质量7～16 kg.方法:贵州小香猪8只,每只背部脊柱两侧均有放创性全层皮肤缺损圆形创面(Φ3.67 cm)各3个,共48个创面.将经处理的人羊膜分别负载自体骨髓骨髓间充质干细胞和角朊细胞,移植到其左侧24个创面作为实验组(人羊膜负载两种细胞移植组);右侧前16个创面用单纯无种植细胞的人羊膜敷盖;后8个创面用单纯油纱布敷盖.单纯人羊膜处理组和油纱布敷盖组作为对照组.主要观察指标:用图像分析法测算7～21 d各组创面活检组织胶原含量.结果:移植15～21 d,3组创面胶原均增加,以人羊膜负载两种细胞移植组创面胶原沉积明显,与单纯人羊膜处理组和油纱布敷盖组创面相比,差异均有显著性意义(P<0.01).结论:人羊膜负载自体骨髓间充质干细胞和角朊细胞植入可明显促进放创性全厚皮肤缺损创面愈合过程中胶原的合成.
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自体外周血CD34+细胞移植后巨细胞病毒感染的检测
背景:巨细胞病毒活动性感染,尤其是巨细胞病毒肺炎死亡率极高,并易合并细菌、真菌、原虫等感染,直接影响患者的长期存活.因此,寻找一种早期、敏感的巨细胞病毒检测方法显得特别重要.目的:探讨酶联免疫吸附法、免疫组织化学法及流式细胞仪检测在自体外周血造血干细胞移植后巨细胞病毒感染的早期诊断价值.设计、时间及地点:对比观察,病例来自2002/2005南方医科大学南方医院.对象:选择行自体外周血CD34+细胞移植的系统性红斑狼疮(16例)和天疱疮(3例)患者19例,其中男5例,女14例,年龄11～38岁.所有受试者均无糖尿病、哮喘、荨麻疹、湿疹、炎症性肠病和其他风湿病.方法:分别于移植前、移植后3,6,12,24个月进行外周血采集.主要观察指标:应用酶联免疫吸附法、免疫组织化学法及流式细胞仪检测19例接受自体外周血造血干细胞移植患者移植前、移植后3,6,12,24个月时的抗巨细胞病毒抗体及巨细胞病毒抗原.结果:19例患者均进入结果分析.血清学检测显示,全部标本抗巨细胞病毒IgG全部阳性,阳性率100%.抗巨细胞病毒IgM阳性3例,阳性率3.2%.免疫组织化学法检测巨细胞病毒抗原阳性14例,阳性率14.7%.流式细胞仪检测巨细胞病毒抗原阳性13例,阳性率13.7%.4种检测巨细胞病毒感染方法的阳性率存在显著差异(x2=261.929,P<0.01).结论:自体外周血造血干细胞移植后存在不同程度的巨细胞病毒感染,临床上开展流式细胞仪检测巨细胞病毒感染具有重要意义.
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腺病毒介导骨形态发生蛋白2基因转染诱导脂肪间充质干细胞向成骨细胞的定向分化
背景:在众多的骨生长因子中,骨形态发生蛋白2具有著促进骨缺损修复和骨折愈合的效果.骨修复是一个阶段性过程,不需要转染的目的基因长久表达,因此利用腺病毒载体将目的基因导入脂肪间充质干细胞来促进骨愈合比较理想.目的:观察腺病毒介导的骨形态发生蛋白2基因转染后大鼠脂肪间充质干细胞的分化情况.设计、时间及地点:细胞学体外对照观察,于2008-01/10在北京大学第三医院中心实验室完成.材料:清洁级3周龄雄性Lewis大鼠24只,由北京大学实验动物学部提供.腺病毒载体Ad-BMP2、Ad-GFP由靳小兵博士构建扩增.方法:胶原酶消化法分离培养大鼠脂肪间充质干细胞,传至第3代分为Ad-BMP2转染组、Ad-GFP转染组和未转染组.各转染组分别向培养液中加入对应的腺病毒液,转染复数MOI=100.主要观察指标:转染后脂肪间充质干细胞碱性磷酸酶活性,von Kossa染色结果,Western blotting法检测骨桥蛋白和骨形态发生蛋白2的表达.结果:与未转染组比较,转染后7,14,21d Ad-GFP转染组细胞碱性磷酸酶活性无明显变化;Ad-BMP2转染组细胞碱性磷酸酶活性明增高(P<0.01),且随时间延长碱性磷酸酶活性增加更为显著.Ad-BMP2转染组von Kossa染色出现黑色钙结节,免疫细胞化学染色结果示胞浆内有大量黄染颗粒,骨桥蛋白、骨形态发生蛋白2均呈明显强阳性表达.Westernblotting检测结果显示Ad-BMP2转染组脂肪间充质干细胞骨桥蛋白、骨形态发生蛋白2表达水平增高,Ad-GFP转染组中未检测到骨桥蛋白、骨形态发生蛋白2的表达.结论:大鼠脂肪间充质干细胞经腺病毒介导的骨形态发生蛋白2基因转染后,可定向分化为成骨细胞.
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富血小板血浆诱导人骨髓基质干细胞的体内异位成骨
背景:近年来的研究发现,结合组织工程技术利用经诱导转化的骨髓基质干细胞能成功地在动物体内再生出骨组织,并在大型哺乳动物负重骨缺损的修复实验中取得了较好的修复效果.目的:观察富血小板血浆诱导培养人骨髓基质干细胞在体内的成骨特性,探讨采用富血小板血浆诱导培养的人骨髓基质干细胞与珊瑚羟基磷灰石材料体内异位成骨的可行性.设计、时间及地点:配对样本观察,于2007-10/2008-04在中山大学组织工程实验室完成.材料:4周龄BALB/C裸鼠14只,体质量22～24 g,麻醉后将裸鼠两侧股部切开,于股部肌间隙内制成肌袋模型.方法:14只裸鼠左侧肌袋内植入珊瑚羟基磷灰石复合富血小板血诱导培养的人骨髓基质干细胞,作为实验组;右侧背部肌袋内植入单纯珊瑚羟基磷灰石材料为对照组.主要观察指标:分别于植入后4,8,12周对比观察两组裸鼠活动及进食情况;X射线平片观察阻射率;苏木精-伊红染色观察骨形成情况.结果:14只裸鼠均进入结果分析.①植入材料后裸鼠活动及进食均正常,伤口愈合良好.材料随植入时间的延长无明显吸收,而材料周围的肌肉组织等软组织由外向内逐渐长入材料孔隙内有所增多.②随时间延长两组X射线平片阻射影像密度逐步增加.植入材料后4,8,12周实验组与对照组相比,差异有非常显著性意义(P<0.01).③植入材料后4周,实验组可见珊瑚羟基磷灰石表面有细胞生长,孔隙内有结缔组织长入;对照组仪见珊瑚羟基磷灰石表面有细胞生长.8周时珊瑚羟基磷灰石表面有新生骨形成,孔隙内和孔隙边缘可见骨样组织沉积和少量软骨样组织形成;对照组仅见少量纤维结缔组织长入.12周时珊瑚羟基磷灰石材料表面有较多成熟编织骨形成,部分区域可见髓腔样结构形成,并有血管长入;对照组仍未见新骨及骨样组织形成.结论:富血小板血浆诱导培养人骨髓基质干细胞与珊瑚羟基磷灰石材料在裸鼠体内能够良好的成骨,随时间的延长,成骨特性越明显;体内采用肌袋包裹的方法能有效增加血运及促进组织工程骨血管化生成,促进成骨.
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葡萄糖对人脐带间充质干细胞生长与代谢的影响
背景:目前对人脐带间充质干细胞的研究主要集中干细胞生物学特性与组织分化等领域的研究,对细胞代谢途径调控的报道还很少.目的:考察了不同起始浓度的葡萄糖对人脐带间充质干细胞生长和代谢特征的影响.设计、时间及地点:对比观察实验,于2008-02/06在北京工业大学生命科学与生物工程学院病毒与药理研究室完成.材料:采集产妇遗弃健康足月分娩胎儿脐带4份.方法:①从人脐带组织Wharton's Jelly中成功分离出人脐带间充质干细胞,采用流式细胞仪对分离培养的第3代人脐带间充质干细胞免疫分型进行分析.②将细胞以2.5×107L-1.接种于24孔板中,在含有不同起始葡萄糖浓度(0.31,2.78,6.12,21.58 mmol/L)、体积分数为0.10 FBS的DMEM培养基中培养,每隔24 h取样计数.③将细胞以2.5×108L-1的密度接种于25 cm2方瓶中培养96 h后,收集不同葡萄糖浓度作用后的细胞,采用流式细胞仪进行细胞周期分析.④将细胞以2.5×108L-1密度接种于含有不同起始葡萄糖浓度DMEM培养基75 cm2方瓶中,培养96 h后,离心收集上清和细胞,分别用干细胞代谢物检测与酶活性分析.主要观察指标:①人脐带间充质干细胞细胞形态和表面抗原表达.②细胞生长情况.③细胞周期检测.④细胞胞内外营养物、代谢副产物及酶活性的测定分析.结果:①采用流式细胞仪对人脐带间充质干细胞进检测,阳性表达的有CD13,CD29,CD44,CD105,CD147,CD90,CD71,表达率均高于90%,而造血干细胞特有标记CD34,CD45及白细胞抗原HLA-DR、CD38呈阴性表达.②葡萄糖能促进人脐带间充质干细胞的生长,但当培养基中缺失葡萄糖时,细胞也可维持生长,在120 h细胞达到高密度11.6×107L-1.⑨细胞群体在G0/G1期的分布比例显著高于S期和G2/M期,随着葡萄糖浓度的增加,细胞群体处于G0/G1期的比例逐渐降低,S期相应增加.④当葡萄糖浓度为21.58 mmol/L时,己糖激酶与丙刚酸激酶活性分别比缺失葡萄糖时增加了39.7%和64.3%,而谷氨酰胺、丝氨酸、亮氨酸等氨基酸的比消耗速率却随着葡萄糖浓度的增加而显著降低.结论:当培养基中缺失葡萄糖时,细胞可利用氨基酸等营养物维持生长;随着葡萄糖浓度的增加,细胞周期分布和葡萄糖代谢途径关键酶活发生改变,从而影响了人脐带间充质干细胞的生长与代谢特征.
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大鼠脂肪干细胞与细菌纤维素膜的复合培养
背景:国外一些研究表明细菌纤维素作为组织工程支架材料在组织工程方面有很大的应用潜力,但国内在这方面的报道非常少.目的:以大鼠脂肪干细胞作为组织工程种子细胞,考察其与细菌纤维素复合培养的效果.设计、时间及地点:观察性实验,于2007-0912008-08在吉林大学约学院生物工程实验中心和吉林大学第一医院耳鼻咽喉-头颈外科研究所完成.材料:细菌纤维素膜由天津科技大学天津市工业微生物重点实验室制备,材料的平均孔径为0.6-2.8μm,孔隙率为90%.方法:取3周龄Wistar大鼠腹股沟部脂肪垫,以Ⅱ型胶原酶消化获得大鼠脂肪干细胞,采用含有体积分数为0.1新生牛血清的DMEM培养液进行培养.将处十对数生长期的细胞,以3.0×108L-1的密度种植于细菌纤维素膜上,采用含有体积分数为0.1新生牛血清的DMEM培养液继续培养,分别于培养的不同时间取细胞-材料复合物,冰冻切片.采用免疫荧光染色方法对生长于细菌纤维素膜上脂肪干细胞的生物学特征进行测定.主要观察指标:①体外培养大鼠脂肪干细胞形态.②苏木精-伊红染色观察脂肪干细胞在细菌纤维素膜上的生长情况.③免疫荧光染色标记蛋白-CD29在复合物上脂肪干细胞中的表达.结果:体外原代培养72 h的脂肪干细胞以长梭形为主,7 d后梭形细胞逐渐增多融合,细胞对数生长期为第3～9天.细胞-支架复合物在培养第10天经苏木精-伊红染色后可见细胞呈单层生长于细菌纤维素膜表面,细胞与细菌纤维素膜接触紧密,未见深入细菌纤维素膜内部生长的细胞.免疫荧光技术分析结果表明,标记蛋白-CD29在细菌纤维素膜上的脂肪干细胞有特异性表达.结论:生长于细菌纤维素膜上的脂肪干细胞不仅能够增殖,而且仍然保持着干细胞的生物学活性.
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骨髓间充质干细胞向成骨细胞诱导分化的超微结构改变
背景:目前尚缺乏骨髓间充质干细胞及其诱导分化后成骨细胞超微结构特点的观察.目的:采用全骨髓培养-贴壁筛选法分离培养骨髓间充质干细胞,诱导其向成骨细胞方向分化,利用光镜和电镜观察诱导和未诱导分化细胞的细微和超微结构特点.设计、时间及地点:观察实验,于2007-03/2008-04在河北医科大学人体解剖教研室和白求恩国际和平医院骨科完成.材料:成年新西兰大白兔由自求恩国际和平医院实验动物中心提供.Hitachi S-3500N型扫描电镜和Hitachi-7500型透射电镜.方法:从新西兰大白兔骼后上嵴处抽取骨髓.经原代及传代培养后,取部分第3代细胞加入诱导剂,诱导剂为10 mmol/Lβ-甘油磷酸钠,10-8 mmol/L地塞米松,50 mg/L维生素C.培养2周后,诱导和未加诱导的骨髓间充质干细胞进行碱性磷酸酶、骨形态发生蛋白和钙化结节检测.主要观察指标:光镜观察骨髓间充质干细胞及其诱导分化后成骨细胞的一般形态学特征;电镜观察骨髓间充质干细胞和成骨细胞的超微结构特点.结果:培养的第3代骨髓间充质干细胞,其碱性磷酸酶染色呈强阳性反应;钙化结节染色和骨形态发生蛋白免疫组织化学检测,均呈现阴性结果.经向成骨细胞诱导分化后,其碱性磷酸酶染色,钙化结节染色和骨形态发生蛋白免疫组织化学检测,均呈现阳性反应.光镜和扫描电镜观察显示,骨髓间充质干细胞大部分呈长梭形,少量呈星形;经向成骨细胞诱导分化后,细胞体积增大,更加饱满,似鱼群样排列.透射电镜观察显示,骨髓间充质干细胞的细胞器较丰富,向成骨细胞诱导分化后,其线粒体明显增多,出现较多的基质小泡、髓样体和空泡状结构.结论:骨髓间充质干细胞成骨诱导分化后细胞的超微结构表现为胞浆中出现增多的基质小泡、髓样体和空泡状结构.
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TAT-PDX1融合蛋白诱导人胎肝间充质干细胞向胰岛β细胞分化
背景:PDX1是决定胰岛β细胞功能的关键因子,应用穿膜蛋白TAT将PDX1蛋白导入细胞内,若能发挥诱导分化作用将使干细胞治疗糖尿病向临床应用更进一步.目的:观察TAT-PDX1融合蛋白诱导人胎肝间充质干细胞向胰岛B细胞分化的能力.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2007-05/2008-03在郧阳医学院附属太和医院湖北省胚胎干细胞研究重点实验室完成.材料:流产胎儿来源于肝功能正常、HBsAg(-)的健康产妇,TAT-PDX1融合蛋白由美国佛罗里达大学医学院唐东启博上惠赠.方法:采用贴壁法体外分离培养人胎肝间充质干细胞,传至第3代加入20 mol/L TAT-PDX1融合蛋白诱导,分别于第4,6,8,10天向诱导细胞中加入含葡萄糖的DMEM/F12培养基.主要观察指标:诱导后细胞形态变化及双硫腙染色结果,RT-PCR检测胰岛β细胞特异基因的表达,放射免疫法测定胰岛素累积分泌量.结果:人胎肝间充质干细胞易于体外分离和扩增,加入TAT-PDX1融合蛋白诱导后细胞由梭形逐渐变圆,并形成胰岛样细胞团,双硫腙染色呈棕红色.诱导第4,6,8,10天细胞序贯表达胰岛β细胞特异基因,NeuroD基因先出现,随后消失,Nkx2.2,Pax4,Nkx6.1,ISL-1基因随后依次出现.诱导后胰岛素累积分泌量逐渐增加,葡萄糖刺激后2～4周细胞胰岛素基础分泌量和刺激后胰岛素分泌量均显著增加,且可以维持在较高水平.结论:TAT-PDX1融合蛋白能诱导人胎肝间充质干细胞向胰岛β细胞分化.
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胎儿骨髓源性胚胎后亚全能干细胞分离培养及向肝细胞的诱导分化
背景:目前研究认为在胚胎发育后的多种组织中存在一类干细胞群体,可分化为不同胚层的组织细胞;但又不同于胚胎干细胞,随着妊娠期间胚胎的发育胚胎干细胞会逐渐失去部分分化潜能,会出现一些特殊表型或分子标记,如CD105,称其为胚胎后亚全能干细胞.目的:根据胚胎后亚全能干细胞表达CD105的特性分离胎儿骨髓源性胚胎后亚全能干细胞,经体内外诱导使其分化为肝细胞样细胞并检测其功能.设计、时间及地点:动物随机分组,细胞分子生物学实验,于2003-03/2005-03在天津市第三中心医院卫生部人工细胞工程技术研究中心完成.材料:取22周龄左右胎儿股骨和胫骨骨髓分离出胚胎后亚全能干细胞.以雌性成年SCID鼠作为干细胞移植的受体.CD105免疫磁珠为德国Miltenyi Biotec产品.鼠抗人白蛋白抗体为美国Sigma产品.碱性成纤维细胞生长因子、肝细胞生长因子为英国PEPROTECH产品.方法:利用密度梯度离心结合免疫磁珠方法分离胎儿骨髓CD105(+)胚胎后亚全能干细胞,体外培养,用含30 μg/L肝细胞生长因20 μg/L碱性成纤维细胞生长因子的诱导培养基将其向肝细胞样细胞诱导分化.将24只SCID鼠随机分为干细胞治疗组和对照组,每组12只,均按800 mg/kg的剂量向腹腔内注射D-氨基半乳糖制备肝损伤模型.造模次日,干细胞移植组鼠在肝原位输注106左右CD105(+)细胞,对照组分别输注106左右的CD105(-)细胞或同等体积的培养液.主要观察指标:于干细胞移植后2,7d,1,3个月对肝脏组织行免疫组化检测人源白蛋白表达.结果:免疫磁珠筛选后的细胞免疫细胞化学检测CD105呈弱阳性表达:细胞在对数生长期的倍增时间为30 h左右:约传10代后进入衰退期.SCID鼠移植胚胎后亚全能干细胞3个月后在小鼠肝脏中可见有点状或小灶状的人白蛋白表达,对照组未见表达.结论:来源于胎儿骨髓的胚胎后亚全能干细胞可以在肝脏微环境下转化为肝细胞样细胞.
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甲状腺激素对大鼠骨髓间充质干细胞分化为少突胶质细胞的影响
背景:如何为脱髓鞘疾病的细胞替代治疗提供丰富的少突胶质细胞来源是急需解决的问题.目的:实验拟采用表皮生长因子及碱性成纤维细胞因子诱导骨髓间充质干细胞向神经干细胞方向分化,撤退细胞因子后,用甲状腺激素诱导神经干细胞向少突胶质细胞分化.设计、时间及地点:细胞观察实验,于2007-08/12在泸州医学院神经生物学研究室完成.材料:普通级SD大鼠5只用于骨髓间充质干细胞的培养.方法:采用密度梯度离心法从大鼠骨髓中分离培养骨髓间充质干细胞,传至第4代,用含碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、N2辅助因子、甲状腺激素T3的DMEM/F12诱导液诱导向神经干细胞分化.诱导后4 d,更换成含胎牛血清、甲状腺激素T3的DMEM/F12分化液,诱导向少突胶质细胞分化.主要观察指标:骨髓间充质干细胞生长情况和形态变化,采用SABC法进行免疫细胞化学检测神经细胞特异性标志的表达.结果:原代细胞接种3 d后多数贴壁,传代后细胞贴壁速度加快,增殖能力更强.诱导液处理第4天,圆形细胞聚集成簇.换成分化液后,细胞伸出树枝状细长突起,交织成网,形成少突胶质细胞样细胞.骨髓源性细胞簇表达巢蛋白阳性,示神经干细胞;从细胞簇分化的细胞,多数细胞表达半乳糖脑苷脂,部分细胞表达髓鞘碱性蛋白,示少突胶质细胞,少数细胞表达微管相关蛋白2阳性,示神经元.结论:甲状腺激素在体外可诱导骨髓间充质干细胞向少突胶质细胞分化.
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大鼠骨髓间充质干细胞分化成脂肪细胞的定向诱导
背景:研究表明骨质疏松症可能是间充质干细胞分化失衡后过多地向脂肪细胞分化所致.因此,探讨骨髓间充质干细胞成脂分化的影响因素对骨质疏松症防治具有重要意义.目的:分析骨髓间充质干细胞在体外定向分化为脂肪细胞的适宜诱导条件.设计、时间及地点:以细胞为对象,重复观察测量实验,于2007-10/2008-07在广东医学院药理教研室完成.材料:1月龄SD雄性大鼠由广东医学院实验动物中心提供.方法:无菌条什下分离大鼠股骨,密度梯度离心法与贴肇培养法相结合分离、纯化骨髓间充质干细胞并存体外进行培养.第3代骨髓间充质干细胞完全汇合后,利用内含0.1 mmoL/L3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、0.1 mmoL/L吲哚美辛、1μmol/L地塞米松、不同浓度胰岛素及胎牛血清的DMEM定向诱导骨髓间充质干细胞分化为脂肪细胞.主要观察指标:①倒置显微镜下观察骨髓间充质干细胞形态特征.②油红○染色检测骨髓间充质干细胞成脂肪分化情况.结果:①倒置显微镜下观察,传3代后可获得均一性较高的骨髓间充质干细胞.②体积分数为0.05和0.1胎牛血清均能获得较好的成脂分化效果,胎牛血清体积分数增至0.2反而抑制骨髓间充质干细胞成脂分化(P<0.01).③10mg/L胰岛素可获得较好的成脂分化效果,胰岛素质黾浓度提高到20,40 mg/L并不能增加骨髓间充质干细胞的成脂分化效果(P>0.05).④低糖(含葡萄糖1 g/L)和高糖(含葡萄糖4.5 g/L)DMEM对骨髓间充质干细胞的成脂分化无影响(P>0.05).结论:骨髓间充质干细胞经内含0.1 mmoL/L3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、10mg/L胰岛素、0.1 mmoL/L吲哚美辛,1 μmoL/L地塞米松、体积分数为0.1胎牛血清的DMEM分化诱导液定向诱导可获得较好的成脂分化效果.
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人胰岛素样生长因子Ⅰ基因修饰成肌细胞移植对心肌梗死大鼠心肌细胞胰岛素样生长因子Ⅰ及p16INK4a和细胞核增殖抗原表达的干预
目的:检测人胰岛素样生长因子Ⅰ基因修饰的鼠骨骼肌成肌细胞移植后,心肌梗死大鼠心肌组织胰岛素样生长因子Ⅰ含量的变化,以及心肌细胞细胞核分裂抑制因子p16INK4a和细胞核增殖抗原蛋白的表达.方法:人胰岛素样生长因子Ⅰ基因修饰的鼠骨骼肌成肌细胞、未转染的正常鼠骨骼肌成肌细胞均由实验室前期制备.健康雄性SD大鼠90只,取12只作为假手术组,剩余大鼠结扎冠状动脉左前降支建立心肌梗死模型,结扎后24 h存活36只,随机分为对照组和实验组,18只/组.造模后24 h,实验组在动物后肢局部分多点注射总量为0.1 mL的人胰岛素样生长因子Ⅰ基因修饰的鼠骨骼肌成肌细胞悬液,(2～4)×1010L-1细胞;对照组和假手术组给予等量示转染的正常鼠骨骼肌成肌细胞悬液.应用ELISA法检测血浆和心肌组织胰岛素样生长因子Ⅰ的表达,免疫组化染色检测心肌细胞细胞核分裂抑制因子p16
、细胞核增殖抗原蛋白的表达.结果:①细胞移植后1,2,4周,假手术组血浆和心肌组织内鼠胰岛素样生长因子Ⅰ的表达无明显变化(P>0.05);与假手术组比较,实验组和对照组血浆中鼠胰岛素样生长因子Ⅰ的质量浓度均显著降低(P<0.01),心肌组织中鼠胰岛素样生长因子Ⅰ的含量均明显升高,于第2周达峰值(P<0.01),且实验组较对照组升高更为显著(P<0.01).②细胞移植后1,2,4周,假手术组和对照组大鼠血浆和心肌组织内均未检测到人胰岛素样生长因子Ⅰ的表达;实验组于第1周即表达人胰岛素样生长因子Ⅰ,含量显著高丁其余两组(P<0.01).③细胞移植后1周对照组p16INK4a阳性细胞达峰值,显著高于其余2组(P<0.01),然后迅速降低;第2,4周实验组p16INK4a阳性细胞率与假手术组基本相似(P>0.05).④细胞移植后第1周,实验组细胞核增殖抗原阳性细胞达峰值,显著高于其余2组(P<0.01),随时间延长明显减少;第2周对照组与假手术组细胞核增殖抗原阳性率基本相似(P>0.05),而实验组仍显著高于假手术组,并持续到第4周(P<0.01).结论:人胰岛素样生长因子Ⅰ基因修饰的鼠骨骼肌成肌细胞植入心肌梗死大鼠体内1周后.能有效合成和分泌胰岛素样生长因子Ⅰ,明显抑制心肌梗死早期心肌细胞p16INK4a表达,同时还可以促进细胞核增殖抗原表达,在局部持续1个月发挥促进细胞增殖的作用. -
脂质体介导胞嘧啶脱氨酶基因转染鼠骨髓间充质干细胞
背景:自杀基因独有的旁观者效应,可显著提供肿瘤细胞杀伤效果,同时还与放射治疗、免疫摹因治疗联合应用,并克服了基因转导效率低的缺陷.胞嘧啶脱氨酶(cytosine deaminase,CD)即可产生强大的旁观者效应.目的:观察脂质体介导真核表达载体CD基因转染鼠骨髓间充质干细胞的效果及其基因表达.设计、时间及地点:细胞学基因水平实验,于2007-05/12在大连理工大学干细胞与组织工程研发中心完成.材料:SPF级C57BL纯系小鼠6只,由大连医科大学实验动物中心提供.连接产物转化感受态大肠杆菌DH5 α由大连理工大学干细胞与组织工程研发中心提供.LipofectamineTM 2000脂质体为Invitrogen产品.方法:取连接产物转化感受态大肠杆菌DH5 α,提取质粒DNA,对质粒pIRES2-AcGFP1-CD进行Xhol和BamHI双酶切,用于转染.取小鼠双侧下肢股骨和胫骨,贴壁法分离纯化骨髓间充质干细胞,传至第3代制成单细胞恳液,加入荧光标记的CD44,CD45,CD90,CD105抗体后,采用Lipofectamine 2000介导法转染第3代骨髓间充质干细胞.主要观察指标:重组质粒的鉴定,流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞表面标记表达,细胞转染后CD基因的表达.结果:质粒pIRES2-AcGFP1-CD酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后,于1.0～1.5 kb处有一条带出现,符合CD基因长度.细胞表面标记CD45呈阴性,CD44,CD90,CD105呈阳性.pIRES2-AcGFP1-CD基因转染36 h后,荧光倒置相差显微镜下可见小鼠骨髓间充质干细胞有绿色荧光蛋白的表达,48 h后细胞仍有荧光表达,且强度明显增强.结论:脂质体介导的CD基因在鼠骨髓间充质干细胞中成功表达,于转染48 h后达峰值.
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壳聚糖介导真核双表达质粒pIRES-hVEGF121cDNA/hBMP-4转染兔骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化
背景:发展一种安全有效的方法来促进骨缺损是修复重建外科面临的重要问题,自体骨移植仍是目前优先考虑的选择,但供区有限且不可避免地对供区造成新的损害;同种异体骨移植存在免疫排斥反应;非骨性材料移植物在临床实践中的并发症仍居高小下.目的:探讨壳聚糖介导真核双表达质粒pIRES-hVEGF121cDNNhBMP-4转染兔骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的可行性.设计、时间及地点:细胞基因工程学体外实验,于2007-09/2008 04在安徽医科大学与中国医科大学完成.材料:清洁级新西兰大白兔8只,南安徽医科大学实验动物中心提供.壳聚糖介导的真核双表达质粒pIRES-hVEGF121cDNNhBMP-4为课题组自行构建.方法:无菌条件下抽取兔骨髓,Percoll法体外分离培养骨髓间充质干细胞,通过换液和贴壁吹打法进行纯化扩增.第3代骨髓间充质干细胞80%融合后,按1×108L1密度接种,实验组采用壳聚糖介导的真核双表达质粒pIRES-hVEGF121cDNA/hBMP-4进行转染,对照组不转染质粒,继续以含10%FBS的L-DMEM普通培养基进行培养21 d.主要观察指标:碱性磷酸酶及茜素红染色检测细胞分化情况,扫描电镜观察细胞结构变化.结果:转染14 d后实验组碱性磷酸酶染色呈强阳性表达,茜素红染色出现大量棕红色的钙结节,电镜观察细胞内含有大量碱性磷酸酶的小泡,细胞周围大量基质分泌;对照组碱性磷酸酶与茜素红染色均呈阴性,电镜干细胞内几乎没有含碱性磷酸酶的小泡.结论:兔骨髓间充质干细胞在体外经壳聚糖介导的真核双表达质粒pIRES-hVEGF121cDNA/hBMP-4转染后,可定向分化为成骨细胞.
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白细胞介素3与白细胞介素6对人脐血单个核细胞体外扩增及黏附分子和趋化因子受体4表达的影响
背景:体外扩增脐血造血细胞对增加脐血造血细胞数量及植入能力至关重要,合适的细胞因子组合介导的体外扩增不仅能使造血细胞数鼙增加,而且能够上调和归巢有关的黏附分子和趋化因子受体4的表达.目的:实验拟观察白细胞介素3和白细胞介素6在人脐血单个核细胞体外扩增中的作用及对扩增后黏附分子和趋化因子受体4表达的影响.设计、时间及地点:随机区组开放性实验,于2007-03/12在广西壮族自治区人民医院及广州医学院附属广州市第一人民医院血液实验室完成.材料:10份足月顺产健康新生儿脐血标本.方法:将自新鲜脐血标本分离的单个核细胞接种于含有不同细胞因子组合的无血清无基质培养体系中培养7d,根据不同细胞因子组合实验分组为:对照组(无细胞因了组)、干细胞因子+FLT3配基+促巨核细胞生成因子组(A组)、干细胞因子+FLT3配基+促巨核细胞生成因子+白细胞介素6组(B组)、干细胞因子+FLT3配基+促巨核细胞生成因子+白细胞介素3(C组)、干细胞因子+FLT3配基+促巨核细胞生成因子+自细胞介素6组+白细胞介素3(D组).主要观察指标:在0,7 d检测有核细胞数,CD34+细胞数及CD34+CXCR4+,CD34+CD62L+,CD34+CD49d+的细胞数和集落形成单位数.结果:与对照组相比,A,B,C,D组均可有效的扩增脐血造血细胞(P<0.05),C,D两组扩增效果均优于A,B组,差异显著(P<0.05),但A,B两组之间无明显区别(P>0.05),D组能有效的扩增脐血细胞,并优于C组(P<0.05).A,B,C,D组细胞因子组合均可提高脐血CD34+细胞上CD49d,CD62L和趋化因子受体4的表达, A,B两组之间差异不显著(P>0.05),但均优于C组(P<0.05),D组CD34+CXCR4+,CD34+CD62L+和CD34+CD49d+的细胞数扩增倍数优于A,B,C组(P<0.05).结论:白细胞介素6组+白细胞介素3可协同扩增脐血细胞,并能促进和归巢有关的CD49d,CD62L及趋化因子受体4表达.
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抗坏血酸、β-甘油磷酸钠和地塞米松联合诱导大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞的分化
背景:成骨细胞来源于骨髓中的间质干细胞,但骨髓间充质干细胞经过高度扩增后,细胞群会出现生长速率减慢等变化,并出现没有分裂倾向的扁平状细胞.目的:进一步验证在一定诱导条件下,体外分离培养的大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞的定向分化情况.设计、时间及地点:细胞学体外对照观察,于2007-03/10在南方医科大学解剖实验室完成.材料:4周龄SD大鼠3只.由南方医科大学实验动物中心提供.成骨诱导过程所使用的抗坏血酸、地塞米松、β-甘油磷酸钠为美国Sigma公司产品.方法:采用密度梯度离心+贴壁筛选法体外分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞,融合后用EDTA及胰蛋白酶消化,按1:3传代培养.取生长良好的第2代骨髓间充质干细胞,调整细胞数量为1×107L-1,分为2组:对照组加入含体积分数为0.1胎牛血清的DMEM-LG培养基,诱导组加入成骨诱导液进行培养,成骨诱导液为含50 mg/L抗坏血酸、0.1 μmmol/L地塞米松、0.5 mmol/L β-甘油磷酸钠、体积分数为0.1胎牛血清的DMEM-LG培养基.主要观察指标:骨髓间充质干细胞的生物学特性,成骨诱导前后细胞碱性磷酸酶活性,诱导后矿化结节的形成.结果:刚接种的骨髓间充质干细胞呈圆形;原代培养24 h后大部分细胞贴壁生长,呈短梭形、三角形、多边形;72 h时贴壁细胞分裂增殖,逐渐呈长梭形;至第5天可见明显细胞集落形成:第9～10天细胞达80%以上融合;传代后细胞贴壁和增殖速度加快.呈有规则的方向性排列.与诱导前比较,骨髓间充质干细胞成骨诱导7d后碱性磷酸酶活性明显提高(P<0.05).连续成骨诱导20 d后.诱导组可见多个散在分布的圆形不透明钙化结节,对照组未见矿化结节沉积.结论:在抗坏血酸、β-甘油磷酸钠和地塞米松联合诱导下,大鼠骨髓间充质干细胞可定向分化为成骨细胞.
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生长因子对骨骼肌肌源性干细胞增殖的影响
背景:单纯应用差速贴壁法获得的原代肌源性干细胞数量少,生长速度较慢,不利于获取满足实验及将来临床所需的细胞数量.目的:观察碱性成纤维细胞生长因子和胰岛素样生长因子1在体外对体外培养肌源性干细胞增殖的作用,探索体外大量培养肌源性干细胞的方法和条件.设计、时间及地点:观察对比实验,于2007-09/2008-04在武汉大学人民医院泌尿外科实验室完成.材料:2周龄体质量50～80 g的SD大鼠20只.方法:采用改良差速贴壁培养法分离大鼠骨骼肌肌源性干细胞:取新生大鼠肌肉标本分离细胞;维持总的贴壁时间基本不变,减少贴壁次数,取第2代肌源性干细胞进行体外成肌分化.主要观察指标:以免疫细胞化学法及免疫荧光法鉴定肌源性干细胞.以MTT比色实验检测5,10,20,40,80 μg/L的碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子1及胰岛素样生长因子1+碱性成纤维细胞生长因子对肌源性干细胞增殖的影响.以流式细胞仪检测碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子1和胰岛素样生长因子1+碱性成纤维细胞生长因子对细胞周期的影响.结果:肌源性干细胞原代培养70 h后开始贴壁,呈规则的圆形.1周后细胞数量增多,细胞展开呈纺锤性.免疫细胞化学染色法和细胞免疫荧光法显示肌源性干细胞呈结蛋白、干细胞抗原1和CD34阳性.传代细胞加入碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子1后肌源性干细胞的增殖活性增强,两种细胞因子作用强度相近,随着两种细胞因子浓度的提高促细胞增殖作用逐渐提高,在达到有效浓度后作用趋于饱和.两种细胞因子作用机制不同,碱性成纤维细胞生长因子主要是增加G2M期的细胞比例,通过缩短细胞周期达到增殖作用,胰岛素样生长因子1则主要增加S期细胞的比例,通过活化由G0期到G1期转化的进入有丝分裂细胞来达到增殖作用.结论:胰岛素样生长因子1和碱性成纤维细胞生长因子都具有刺激肌源性干细胞增殖的作用,两者联合作用既可以增加早期由 G0期进入G1期的数量,又可以减短细胞有丝分裂周期,从而达使促增殖效果更快、更强.
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人胎儿肝脏来源C-kit+细胞的特征
背景:在成年动物肝脏中干细胞含量很少,且体外大量扩增并保持未分化状态的问题仍然没有很好的解决,许多科研者预测胚胎肝干细胞可能具有诱人的临床应用价值.近年来C-kit被选择作为研究肝干细胞的共同标志,并发现C-kit抗原参与肝干细胞的生长和发育.目的:对胎儿肝脏来源的C-kit+细胞进行分离培养,观察其体外生长和分化的特征.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2005-10/2008-03在南京大学医学院和国家生物医药技术重点实验室完成.材料:肝脏C-kit+细胞来源于32例流产胎儿,由南京大学医学院附属鼓楼医院提供.Percoll分离液为Pharmacia公司产品,Ficoll分离液为天津灏阳生物制品科技有限责任公司产品,表皮生长因子、肝细胞生长因子为R&D公司产品.方法:无菌状态下取出胎儿肝脏,以胶原酶消化法和机械分离法获得胎儿肝脏来源单细胞悬液,分别采用1.070g/mL Percoll分离液和1.077 g/mL Ficoll分离液进行密度梯度离心,吸取界层细胞,添加含体积分数为0.1 FBS、20 μg/L肝细胞生长因子、40 μg/L表皮,上长因子的DMEM/F12新鲜培养基诱导9 d.主要观察指标:胎儿肝脏中C-kit+细胞计数,界层细胞形态、生长特征、表型及C-kit标志的鉴定,界层细胞诱导分化结果.结果:未经分离的新鲜胎儿肝脏细胞中 C-kit+细胞所占比例仪为1.28%,使用Percoll和Ficoll分离液获取的界层细胞分布在二角形区域内的C-kit+细胞所占比例显著增加,分别为74.21%和72.15%,但绝对数量仍然有限.两种分离液获取的界层细胞在形态、生长状况方面基本相似,免疫细胞化学染色鉴定后大体可分为4类:第1类细胞为C-kit+细胞集落,第2类细胞既呈CD29+、CD90+、CD34+、C-kit(间充质干细胞表型特征),又较弱地表达细胞角蛋白 19(胆管细胞特异性标志),第3类细胞较强地表达细胞角蛋白19,不表达C-kil抗原,第4类细胞高表达CD45,微弱表达CD34、CD90、C-kit.诱导后,界层绌胞角蛋白19呈强阳性表达,不表达C-kit、白蛋白、甲胎蛋白及细胞角蛋白18.结论:胎儿肝脏中的C-kit+细胞数量很少,Percoll和Ficoll分离液均可提高C-kit+细胞的得率.胎儿肝脏中可能存在的一类间充质-胆管细胞的中间态细胞,这种细胞可能有促进C-kit+细胞生长的作用.间充质干细胞可向胆管细胞分化.
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CD4+CD25+T细胞的扩增及其功能分析
背景:CD4+CD25+T细胞增殖能力低,且在人外周血中仅占单个核细胞的4%左右.若能在体外高效扩增CD4+CD25+T细胞,并保持其免疫调节特性,将会对临床移植产生积极的影响.目的:观察C57BL/6小鼠来源的CD4+CD25+T细胞体外增殖情况及其扩增后的功能变化.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2007-10/2008-05在南方医科大学珠江医院血液科完成.材料:SPF级C57BL/6及BALB/C雄性小鼠购白南方医科大学动物所.小鼠白血病细胞EL9611由珠江医院血液科惠赠.方法:利用免疫磁珠法分选小鼠CD4+CD25+T细胞;以抗鼠CD3ε单抗、抗鼠CD28单抗、鼠重组白细胞介素2及辐射过的BALB/C小鼠脾细胞为共刺激因子,通过实时定量RT-PCR检测扩增后CD4+CD25+T细胞FoxP3基因mRNA表达变化,以确定增殖效率;3H-TdR掺入法检测扩增后的CD4+CD25+T细胞对CD4+CD25T细胞增殖的影响:LDH释放法检测扩增后的CD4+CD25+T细胞对CD4+CD25T细胞杀伤小鼠白血病细胞EL9611的影响,以CD4+CD25T细胞为效应细胞,以EL9611细胞为靶细胞.结果:经免疫磁珠分选可获得高纯度及较强活性的CD4+CD25+T细胞.扩增后CD4+CD25+T细胞FoxP3基因mRNA的表达平均为扩增前的5.46倍,高可达14.39倍.扩增后CD4+CD25+T细胞可明显抑制CD4+CD25T细胞的增殖,且随着CD4+CD25+T细胞数的增加,这种抑制增殖的能力也逐渐增强,当两者比例为1:1时抑制率大,达62.05%.与单纯CD4+CD25+T细胞对EL9611细胞杀伤率比较,效靶比为10:1时扩增后的CD4+CD25+T细胞联合CD4+CD25-T细胞的杀伤率无明显变化(t=2.199,P>0.05):效靶比为5:1时扩增后的CD4+CD25+T细胞联合CD4+CD25-T细胞的杀伤率则明显降低(t=5.839,P<0.05).结论:单抗加异源性抗原能宵效扩增CD4+CD25+T细胞;扩增后的CD4+CD25+T细胞比新鲜分离的CD4+CD25+T细胞能更有效地抑制CD4+CD25-T细胞的增殖,其对CD4+CD25-T细胞杀伤白血病细胞的作用则取决于其与CD4+CD25-T细胞的相对比例.
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过敏性紫癜患儿外周血树突状细胞功能变化及黄芪的体外干预
背景:树突状细胞在过敏性紫癜发病机制中可能具有重要的地位.已有报道黄芪在体内可以纠正过敏性紫癜患儿的Th1/Th2失衡,但目前关于黄芪在树突状细胞水平对过敏性紫癜病免疫功能调节的影响尚不清楚.目的:观察过敏性紫癜患儿外周血树突状细胞功能变化及黄芪对其的影响.设计、时间及地点:病例对照分析,于2005-10/2007-12在青岛大学医学院附属医院儿科研究所完成.材料:急性期过敏性紫癜患儿外周静脉血28份作为过敏性紫癜组,以门诊体检的健康同龄儿童外周静脉血18份作为正常对照组.黄芪水提剂由四川百利药业有限公司提供.方法:采用密度梯度离心法获取过敏性紫癜患儿及健康儿童外周血单个核细胞,获取的外周血单个核细胞体外经重组人粒-巨噬细胞集落刺激因子、重组人白细胞介素4、重组人肿瘤坏死因子α以诱生树突状细胞,并培养8 d,其中过敏性紫癜组又分成2组:对照组和黄芪干预组.主要观察指标:ELISA法检测过敏性紫癜患儿及健康儿童血浆γ-干扰素和白细胞介素4水平及培养上清液中白细胞介素10,12,18水平,流式细胞仪检测树突状细胞表面CD83、CD86(B7-2)和CD80(B7-1)的表达率.结果:过敏性紫癜患儿急性期外周血中Th1型细胞因子γ-干扰素水平减少,Th2型细胞因子白细胞介素4水平增加,γ-干扰素/白细胞介素4比值明显降低.过敏性紫癜患儿外周血单个核细胞经诱导培养的树突状细胞表面CD86表达率较正常对照组明显升高,且两组CD86表达率与血浆白细胞介素4水平皆呈显著正相关,与γ-干扰素,白细胞介素4比值皆呈显著负相关;CD80表达率明显低于正常对照组,且两组CD80表达率与血浆γ-干扰素水平及γ-干扰素/白细胞介素4比值均呈显著正相关.过敏性紫癜患儿树突状细胞分泌白细胞介素12水平低于正常对照组(P<0.05),而白细胞介素10,18水平均高于正常对照组(P<0.05),两组树突状细胞分泌白细胞介素12水平与血浆γ-干扰素水平皆呈显著正相关(P<0.01),与γ-干扰素/白细胞介素4比值皆呈正相关(P<0.01,P<0.05);白细胞介素10分泌水平与其血浆白细胞介素4水平皆呈显著正相关(P均<0.01),与γ-干扰素/白细胞介素比值皆呈负相关(P<0.01,P<0.05):白细胞介素18分泌水平与其血浆白细胞介素4水平皆呈显著正相关(P均<0.01),与γ-干扰素/白细胞介素4比值皆呈负相关(P<0.01,P<0.05).黄芪干预组树突状细胞表面CD83、CD86和CD80的表达率与对照组差异不显著,树突状细胞分泌白细胞介素12水平高于对照组(P<0.01),白细胞介素10,18水平均低于对照组(P<0.05,P<0.01).结论:①过敏性紫癜患儿外周血树突状细胞存在明显功能紊乱,表现为CD86表达率升高、CD80降低,白细胞介素12分泌减少、白细胞介素10和白细胞介素18增加,上述变化与Th1/Th2失衡关系密切.②黄芪主要是通过改变过敏性紫癜患儿树突状细胞分泌细胞因子的水平来调节其功能.
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活体磁共振示踪磁标记大鼠神经干细胞
背景:要将神经干细胞替代治疗神经系统疾病应用于临床,必须解决一个重要问题,就是植入人脑内神经干细胞的存活、迁移、识别和动态监测.目的:拟建立菲立磁体外标记胎鼠神经干细胞的方法及检测于段,观察标记细胞移植后在活体上磁共振信号的改变.设计、时间及地点:MRI动态评估,体内实验,于2005-01/08在武警医学院附属医院完成.材料:孕13～18 d SD胚胎大鼠10只用于分离、培养大鼠胚胎源性神经干细胞,健康成年清洁级SD大鼠32只,用于制作局灶性脑缺血再灌注模型.方法:分离培养大鼠胚胎源性神经干细胞,使用菲立磁一多聚赖氨酸复合物标记神经干细胞.制作局灶性脑缺血再灌注模型,将菲立磁-多聚赖氨酸复合物标记的神经干细胞分别移植入模型大鼠左侧脑内,右侧移植未标记的神经干细胞.主要观察指标:对标记细胞进行普鲁士蓝染色、电镜观察.细胞活体移植后1,5,14 d体内磁共振示踪.结果:菲立磁可以高效率地标记神经干细胞,普鲁上蓝染色显示菲立磁-多聚赖氨酸复合物标记神经干细胞胞质内出现细小的蓝色铁颗粒,电镜结果显示非立磁-多聚赖氮酸复合物标记的神经干细胞胞质内含有许多包裹铁颗粒的囊泡.磁共振成像检查发现脑内移植的标记细胞在磁共振上呈明显的低信号改变,移植第5天低信号物质沿胼胝体腹侧迁移.在移植第14天,对称平行的两个针道已经基本看不见,病灶侧侧脑室部位低信号物质向对侧迁移,左侧侧脑室部位低信号物质基本看不见.结论:菲立磁经多聚左旋赖氨酸转染后可体外标记神经干细胞,标记后体内移植的神经干细胞可以在磁共振上产生明显的低信号改变.
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黄芩苷作用于脑微血管内皮细胞和星形胶质细胞对神经干细胞分化的影响
背景:实验室前期研究表明黄芩苷可以提高体外培养的神经干细胞分化为神经元的比例.但考虑到体内实验中血脑屏障的存在,黄芩苷能否通过血脑屏障主要细胞成分而发挥诱导神经干细胞定向分化为神经元的能力还不清楚.目的:分别将大鼠脑微血管内皮细胞、星形胶质细胞与神经干细胞共培养,观察在模拟体内复杂微环境条件下,黄芩苷能否定向诱导神经干细胞向神经元分化并促进分化神经元的成熟.设计、时间及地点:细胞水平的体外对照观察,于2007-09/2008-03在天津中医药大学中医药研究院中药药理学重点实验室和南开大学医学院完成.材料:取孕14 d SD大鼠,用以分离培养神经干细胞.方法:利用Transwell装置,分别将脑微血管内皮细胞、星形胶质细胞和神经干细胞共培养.用含有10 μmol/L黄芩苷的培养基作用 7 d,并设置空白对照组.以β-tubulinⅢ标记未成熟神经元,MAP-2标记成熟神经元,胶质纤维酸性蛋白标记星形胶质细胞.主要观察指标:应用细胞免疫荧光化学染色检测神经干细胞分化后β-tubulinⅢ、MAP-2和胶质纤维酸性蛋白阳性细胞比例,以实时荧光定量反转录-聚合酶链反应技术检测黄芩苷对脑微血管内皮细胞和星形胶质细胞血管内皮细胞生长因子、神经生长因子和血小板衍生生长因子mRNA表达的影响.结果:与脑微血管内皮细胞共培养条件下,与空白对照组比较,黄芩苷可显著增加β-tubulinⅢ阳性细胞比例(P<0.05).与星形胶质细胞共培养条件下,与空白对照组比较,黄芩苷对β-tubulinⅢ、MAP-2和胶质纤维酸性蛋白阳性细胞比例均无明显影响(P>0.05).与脑微血管内皮细胞、星形胶质细胞共培养条件下,与空白对照组比较,黄芩苷可显著增加MAP-2阳性细胞比例(P<0.01).黄芩苷作用于脑微血管内皮细胞48 h,可以显著上调血小板衍生生长因子基因表达(P<0.01);作用72 h可显著上调星形胶质细胞血管内皮细胞生长因子、神经生长因子和血小板衍生生长因子基因表达(P<0.01).结论:黄芩苷作用于脑微血管内皮细胞可诱导神经干细胞向神经元分化,黄芩苷同时作用于脑微血管内皮细胞和星形胶质细胞可诱导神经干细胞向神经元定向分化并促进其成熟,可能与黄芩苷调控脑微血管内皮细胞和星形胶质细胞生长因子分泌,改善微环境有关.
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改良Nash差速贴壁联合阿糖胞苷法体外分离培养大鼠嗅球及嗅黏膜源性嗅鞘细胞
背景:目前常用的嗅鞘细胞培养方法有差速贴壁法、化学抑制法、抗体亲和吸附法、补体法等,各自均存在优缺点,单一使用某种方法时细胞纯化率较低.目的:拟采用改良Nash差速贴壁+阿糖胞苷法体外分离纯化大鼠嗅球及嗅黏膜来源的嗅鞘细胞.设计、时间及地点:细胞学体外对照观察.于2007-11/2008-05在武汉大学人民医院骨科实验室和消化内科实验室完成.材料:10周龄Sprague-Dauley大鼠10只,由武汉大学人民医院实验动物中心提供,阿糖胞苷由武汉大学人民医院制备.方法:完整取大鼠双侧嗅球及剪取鼻中隔后1/3嗅黏膜,剪碎后胰酶消化,制成单细胞悬液,按1×109L-1密度接种于末包被的25 cm2玻璃培养瓶中,18～20 h后将细胞悬液转移至另一未包被的25 cm2玻璃培养瓶中(第1次差速贴壁),24 h后再将细胞悬液转移至经多聚右旋赖氨酸包被的25 cm2塑料培养瓶或经多聚右旋赖氨酸包被的6孔培养板中(第2次差速贴壁),接种培养48 h后半量换液以去除杂细胞.在差速贴壁培养后二三天,加入3.0～5.0 pmol/L阿糖胞苷去除残余成纤维细胞.主要观察指标:嗅鞘细胞的形态观察、分裂增殖情况、免疫荧光染色鉴定结果及纯度测定.结果:体外培养24 h嗅球源性嗅鞘细胞即可贴壁,而嗅黏膜源性嗅鞘细胞多在培养四五天后贴壁,两种来源的嗅鞘细胞形态相似,以双极或梭形细胞为主,少量为3极及多突起形多级细胞,同时夹杂扁平、煎鸡蛋形细胞.纯化培养10 d的嗅鞘细胞,胶质纤维酸性蛋白、神经生长因子受体p75免疫荧光染色及神经生长因子受体p75+hoechs免疫荧光双染后大部分双极或多极细胞膜、胞体、突起呈阳性,细胞纯度可达90%以上.结论:改良Nash差速贴壁+阿糖胞苷法可在体外成功分离培养出高纯度的嗅球及嗅黏膜源性嗅鞘细胞,嗅球源性嗅鞘细胞贴壁时间及分裂增殖程度优于嗅黏膜源性嗅鞘细胞.
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体外局部微环境下小鼠胚胎干细胞向神经前体细胞的定向诱导分化
背景:周围微环境能够调节胚胎干细胞在体外的诱导分化情况,可能与多种信号通路及细胞因子作用有关.目的:观察局部微环境对体外培养的小鼠胚胎干细胞向神经前体细胞定向诱导分化的影响.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2005-10/2006-04在上海第二医科大学发育生物学研究中心实验室完成.材料:清洁级孕13.5 d的C57BL/6昆明鼠6只,由中科院上海实验动物中心提供.携带LacZ标记基因的小鼠胚胎干细胞株S8由上海市发育生物学研究中心提供.方法:取孕鼠胚胎,采用组织块消化法制备小鼠胚胎成纤维细胞,经丝裂霉素C处理得到滋养层细胞.将携带LacZ标记基因的小鼠胚胎干细胞株S8解冻复苏,加入含白血病抑制因子的高糖DMEM培养基体外扩增培养,将细胞克隆吹打成单细胞悬液,加到滋养层细胞上,在37℃、体积分数为0.05的CO2培养箱中培养.胚胎干细胞传代后,再加入含全反式维甲酸的高糖DMEM培养基,以单纯加入高糖DMEM培养基作为空白对照,调整细胞浓度为3×108L-1,吹打法悬浮培养48 h,收集悬浮液,反复离心去上清,移入铺有明胶的培养皿中,培养9 d.主要观察指标:诱导前后细胞形态及生长状态变化,RT-PCR检测诱导后细胞向神经前体细胞的分化情况.结果:胚胎干细胞在含有白血病抑制因子的高糖DMEM培养基中能够保持未分化状态,克降生长良好:换用含全反式维甲酸的高糖DMEM培养基悬浮培养后,4.0～5.0 h聚集成团,形成圆球状的类胚体.加入全反式维甲酸的诱导组内胚层细胞呈多边形且数量较多,对照组内胚层细胞呈长梭形且数量少.诱导后细胞表达神经干细胞特异性标志巢蛋白,神经细胞特异性标志微管相关蛋白2呈弱表达,不表达神经胶质细胞特异性标志胶质纤维酸性蛋白.结论:体外培养的小鼠胚胎干细胞可保持末分化状态,具有不断增殖的能力,经白血病抑制因子与全反式维甲酸两步诱导后可分化为神经前体细胞.
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体外诱导骨髓基质干细胞向神经细胞分化及蛋白的差异表达
背景:骨髓基质干细胞移植对损伤脊髓有一定修复作用,较神经干细胞移植更为理想,但疗效并不稳定,可能与其移植微环境有关.目的:拟建立体外神经细胞微环境作用下骨髓基质干细胞的分化模型,观察其分化过程中蛋白表达的差异.设计、时间及地点:蛋白水平的观察对照实验.于2005-07/2007-05在哈尔滨医科大学基础医学院神经生物实验室完成.材料:Wistar成年大鼠及新生胎鼠.方法:取新生Wistar胎鼠脊髓,以培养神经细胞.从成年Wistar大鼠骨髓中分离骨髓基质干细胞进行体外培养和增殖,应用红色荧光蛋白PKH26标记骨髓基质干细胞.骨髓基质干细胞、神经细胞单独培养组分别将骨髓基质干细胞、神经细胞单独培养,共培养组、分层联合培养组分别将标记的骨髓基质干细胞与神经细胞在体外共培养及在双层培养皿中联合培养.主要观察指标:培养7 d后收集细胞分别进行神经特异性烯醇化酶和胶质纤维酸性蛋白免疫荧光检测.应用SELDI-TOF-MS技术筛选骨髓基质干细胞向神经细胞分化过程中变化明显的相关蛋白进行分析.结果:骨髓基质干细胞与神经细胞共培养和双层联合培养7 d后,骨髓基质干细胞呈类似神经细胞形态.免疫荧光检测结果示,共培养组骨髓基质干细胞的神经特异性烯醇化酶和胶质纤维酸性蛋白阳性率明显高于分层联合培养组(P<0.05),分层联合培养组明显高于单独培养对照组(P<0.05).骨髓基质干细胞在向神经细胞转化过程中有5种蛋白表达发生明显变化:在分层联合培养组TIP39_RAT和CALC_RAT表达增加,为原表达量的5.344和2.805倍:INSL6_RAT,PNOC_RAT和PCSK1_RAT表达下降,为原表达量的0.380,0.499和0.437倍.结论:在体外神经细胞微环境作用下,骨髓基质干细胞与神经细胞在共培养和双层联合培养时均能诱导分化成神经细胞,接触培养比非接触培养分化率高.骨髓基质干细胞在向神经细胞转化过程中与5种蛋白TIP39_RAT,CALC_RAT,INSL6_RAT,PNOC_RAT和PCSK1_RAT密切相关.
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脐血间充质干细胞体外扩增和向神经元样细胞的定向诱导
背景:骨髓间充质干细胞存在取材困难、供体有限,可能病毒污染等缺陷,限制了其临床应用,而目前已证实间充质干细胞不仅存在于骨髓,还存在于外周血,尤其是脐血.目的:探讨人脐血间充质干细胞的体外分离、扩增纯化方法及其神经分化潜能.设计、时间及地点:应用研究,体外细胞学观察,于2005-10/2007-10在南方医科大学神经生物学教研室完成.材料:新鲜脐血来自南方医科大学南方医院足月剖宫产新生儿脐带,取脐血前征得新生儿监护人的知情同意.方法:无菌条件下收集脐血,去除红细胞,采用低糖DMEM/F12进行培养:取扩增第3或4代的人脐血间危质干细胞,培养基中添加碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子和全反式维甲酸.主要观察指标:用流式细胞仪检测贴壁细胞的表面标志;用免疫组化法检测诱导后细胞神经元特异性烯醇化酶、巢蛋白、神经元特异性核内抗原和神经丝蛋白表达.结果:人脐血间充质干细胞强表达CD13、CD29、CD44和CD105,弱表达CD106,不表达CD34、CD11a、CD14、CD33和CD45.培养基添加神经营养因了诱导后的细胞呈现典型的神经元样表型,诱导后高表达巢蛋白、神经元特异性烯醇化酶、神经元特异性核内抗原和神经丝蛋白.结论:人脐血富含间充质干细胞,分离培养后于培养基添加神经营养因子能够分化为神经元样细胞.
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改良差速贴壁+无血清条件培养液纯化培养大鼠嗅鞘细胞
背景:细胞移植是脊髓损伤的一种有效治疗手段,嗅鞘细胞被认为是适合的种子细胞之一,但目前对其培养纯化的方法尚无公认标准.目的:运用改良差速贴壁法+含同源嗅鞘上清液的无血清条件培养液来纯化培养嗅鞘细胞,以期建立一种新颖、经济、简单、实用的纯化培养成年大鼠嗅鞘细胞的方法.设计、时间和地点:观察性对照实验.实验于2008-02/06在苏州大学干细胞与组织工程实验室完成.材料:健康成年SD大鼠6只.体质量150-180 g.方法:①无菌条件取大鼠嗅球组织,消化、离心去除上清液后,用含体积分数为0.2胎牛血清的DMEM/F-12培养基重悬,稀释的单细胞混悬液均分成3份,分别用于单纯改良差速贴壁、单纯无血清条件培养液纯化和改良差速贴壁+无血清条件培养液纯化的实验.②单纯改良差速贴壁:将单细胞混悬液以8000个/cm2密度种植于无包被的25 cm2培养瓶中.经12 h+24 h两次差速培养后,吸出细胞上悬液,计数板计算浓度后,按1×109L-1浓度重新种植于载有多聚赖氨酸包被盖玻片的35 mm培养皿中继续培养3周.⑧单纯无血清条件培养液纯化:将单细胞混悬液用预先收集并制备的含同源嗅鞘培养上清液的无血清条件培养液直接种植于载有多聚赖氨酸包被盖玻片的35 mm培养皿中,孵育两三天后再换成含体积分数为0.1胎牛血清DMEM/F12培养基继续培养3周.④改良差速贴壁+无血清条件培养液纯化:经12 h+24 h两次差速纯化,吸出上悬液接种于培养皿中继续培养2.0～3.0 d后,改换成无血清条什培养液,孵育36～48 h后再换成含体积分数为0.1胎牛血清DMEM/F-12培养基继续培养.以后视情况每3～5 d半量换液1次,培养3周.主要观察指标:运用倒置显微镜观察各组不同时间的嗅鞘细胞生长状况和形态学特征.采用GFAP、NGFRp75和Hoechst33258等抗体,于分离培养14 d后进行细胞免疫荧光染色并检测嗅鞘细胞的纯度.结果:①倒置显微镜观察:差速后3 d内有大量细胞贴壁生长,细胞形态较混杂,辨认嗅鞘细胞较困难.差速后再运用无血清条件培养液2 d后,可见纯度较高的典型嗅鞘细胞形态,以双极梭形和多极为主,细胞突起细长.伴少量扁平状"油煎蛋样"细胞.继续培养至14 d可见细胞立体感及折光性佳,数量和纯度高.培养3周后3组细胞开始老化,活力明显下降,成纤维等杂细胞开始挤占原嗅鞘细胞生长空间.②免疫荧光染色显示嗅鞘细胞特异性表达GFAP和NGFRp75,单纯差速后嗅鞘细胞纯度仅有72%～75%,单纯无血清条件培养液纯化后仅为48%～52%,改良差速贴壁+无血清条件培养液纯化组纯度可达88%～92%.结论:实验建立了完善的成年大鼠嗅鞘细胞培养纯化新方法.
