中国组织工程研究杂志
Chinese Journal of Tissue Engineering Research 중국조직공정구여림상강복
- 主管单位： 中华人民共和国卫生部
- 主办单位： 中国康复医学会,《中国组织工程研究与临床康复》杂志社
- 影响因子： 1.38
- 审稿时间： 1-3个月
- 国际刊号： 2095-4344
- 国内刊号： 21-1581/R
- 论文标题 期刊级别 审稿状态
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间充质干细胞分离方法的研究与进展
背景：间充质干细胞作为种子细胞广泛应用于组织工程和临床治疗，而安全、高效的分选方法是间充质干细胞建系的前提。
目的：综述近年来间充质干细胞分选方法的研究进展，比较各方法的优缺点，为安全、高效分离间充质干细胞提供理论依据。
方法：第一作者检索 CNKI 数据库(http：//epub.cnki.net/)和 PubMed 数据库(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/)的相关文献。中文检索词为“间充质干细胞、分离方法”；英文检索词为“mesenchymal stem cel s (mscs)，isolation methods”。查阅1965至2014年来间充质干细胞分离方法的相关文献，包括综述、临床研究和基础研究，终纳入52篇文献。
结果与结论：①全骨髓贴壁法可快速获得大量间充质干细胞，但需要进一步纯化。②梯度密度离心法选择密度为1.073 g/mL的介质在原代能得到相对较纯的间充质干细胞。③组织消化法适用于脂肪、脐带等组织进行消化分离，选用胶原酶Ⅱ消化效果更佳，但是均存在操作技术要求高的缺陷。④免疫磁珠法适用于研究表达特定细胞表面标记物的某一个间充质干细胞亚群的生物学特性。⑤各种分离方法相结合也是一种理想选择。⑥对于近年来出现的分离新方法，由于案例有限，其可靠性有待进一步研究。 -
间充质干细胞在关节软骨组织工程中的应用
背景：组织工程技术的发展为关节软骨缺损修复和功能重建提供了新的方法和思路。目的：探讨以间充质干细胞作为种子细胞在关节软骨组织工程中的应用和研究进展。
方法：由第一作者检索 PubMed 数据库中2000-01-01/2014-09-30有关间充质干细胞和关节软骨组织工程的文献，检索词为“articular cartilage defects, cartilage tissue engineering, mesenchymal stem cel s”。共检索到70篇相关文献，对其中49篇文献进行综述。
结果与结论：关节软骨缺损自身修复能力很有限，目前的临床治疗手段无法达到满意修复，而组织工程的发展为解决这个问题提供了新思路。在种子细胞选择方面，软骨细胞去分化能力有限，胚胎干细胞受到伦理、法律等方面的制约，而间充质干细胞因其自体来源、易扩增、具有软骨分化潜能而受到广泛重视。但目前应用组织工程方法修复关节软骨缺损的效果存在一定的争议，主要是远期功能距离临床应用存在一定差距，在修复组织结构和生物力学方面还需要进一步研究。 -
干细胞移植改善骨量：研究进展与应用前景
背景：研究表明骨量丢失会引发诸如骨质疏松性骨折等一系列疾病，因此寻求增加骨量治疗方法成为广大研究者的目标。
目的：对目前干细胞移植用于提高骨量的研究进行总结综述，以期尽早广泛应用于骨质疏松症的临床治疗。方法：由第一作者应用计算机检索 PubMed、中国期刊全文数据库(CNKI)1997年1月至2014年10月相关文献。在标题、摘要、关键词中以“to improve bone mass,regenerative medicine,bone marrow mesenchymal stem cel transplantation,stem cel therapy 或“改善骨量，再生医学，干细胞移植，干细胞治疗”为检索词进行检索。选择文章内容与干细胞治疗骨质疏松有关者，同一领域文献则选择近期发表在权威杂志文章，终选择28篇文献进行综述。
结果与结论：骨髓间充质干细胞易于获取和分离培养，可快速增殖，具有多向分化潜能。研究表明骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化可以明确提高骨量，在治疗骨科疾病方面取得较多成果。这种新的细胞治疗方法将有助于增加骨愈合的速度，减少治疗时间，为骨外科、整形外科、口腔颌面外科提供一个新的治疗选择，具有广阔的应用前景。 -
人类疾病干细胞移植实验：基础研究现状及进展
背景：随着干细胞培育技术的进步和发展，干细胞移植已经成为现今生物细胞学研究的热点之一。目的：对国内外开展的人类难治性疾病干细胞移植基础研究的现状及新进展作一综述。
方法：在标题和摘要中，以“induced pluripotent stem cel s, neural stem cel s, top-up between stem cel s, transplantation”或“干细胞，再生，移植”为检索词，检索中国期刊全文数据库(CNKI)、维普数据库、万方数据库和PubMed数据库中2008年1月至2014年10月关于干细胞移植动物实验的文章。同一领域文章则选择近期发表或发表在权威杂志上的文章。初检得到113篇文献，根据纳入标准，选择其中的50篇文献进行综述。
结果与结论：随着干细胞培育技术的进步，人类疾病的干细胞移植试验基础研究得到了推动和开展，并已取得了阶段性成果，这就为下一步更广泛、更深入地基础研究创造了条件。相信随着干细胞移植基础研究一系列难点问题的解决，将为人类疾病，尤其是难治性疾病的治疗带来希望。 -
骨髓间充质干细胞与人脐静脉内皮细胞的共培养
背景：将人脐静脉内皮细胞与骨髓间充质干细胞共培养来扩增骨髓间充质干细胞数量，同时促进血管生成，可能为骨组织工程和骨再生提供了一个很有前景的方法。
目的：对近年国内外关于人脐静脉内皮细胞与骨髓间充质干细胞共培养的研究及其相关进展进行综述。
方法：用计算机检索中国知网(2000年1月至2012年3月)、Web of Knowledge 数据库及PubMed数据库(1980年1月至2012年3月)关于干细胞共培养的文献。中文关键词为“人脐静脉内皮细胞、骨髓间充质干细胞细胞、细胞共培养、组织工程”，英文关键词为“ human umbilical vein endothelial cel s, bone Mesenchymal stem cel s,coculture, tissue engineering”。计算机初检得到135篇文献，排除因研究目的与本文无关及内容重复的研究103篇，共保留32篇文献做进一步分析。
结果与结论：通过查阅国内外文献，发现内皮细胞与骨髓间充质干细胞共培养的研究，都围绕着模拟体内环境、细胞与细胞之间的相互作用、共培养体系中培养基的选择、细胞比例的控制等对内皮细胞成血管作用和骨髓间充质干细胞骨生成作用的影响。很多研究对骨组织工程及骨再生治疗都具有重大的作用，但共培养中内皮细胞与骨髓间充质干细胞之间的作用机制以及在人体内的具体调控仍需要进一步的研究与分析。 -
内皮祖细胞与骨折愈合：培养与移植中的问题
背景：近年来，人们意识到血供可能是影响骨折愈合的一个因素，基于内皮祖细胞具有良好的血管化能力，将其应用于临床促进骨折愈合具有良好的应用前景。
目的：介绍内皮祖细胞在骨折愈合中的研究情况。
方法：以“内皮祖细胞、骨折、血管化、血管形成”为中文关键词，以“endothelial progenitor cel ，fracture， neovascularization，angiogenesis”为英文关键词，采用计算机检索1980年1月至2014年9月CNKI数据库、万方数据库和PubMed数据库相关文章，选择48篇内皮祖细胞与骨折愈合血管化相关的文章进行分析。结果与结论：大量的研究证明内皮祖细胞具有血管化能力以及促进骨折愈合的能力，因此将内皮祖细胞应用于组织工程支架可能会增强支架在体内的存活率，从而挽救一大部分骨折延迟愈合与不愈合患者。但是对于临床来说，使用内皮祖细胞进行大规模治疗仍然存在许多问题，如内皮祖细胞体外分离培养、扩增，移植细胞数量以及移植细胞所需要的支架材料的选择等，这些问题的解决依赖于更进一步的研究。 -
骨髓间充质干细胞移植治疗四肢骨折骨不连：实验成果与转化应用
背景：利用骨髓间充质干细胞在特定的诱导条件下可分化为成骨细胞的特性，直接在骨折骨不连部位进行自体骨髓间充质干细胞移植，这一新技术受到广大骨科临床医师的关注。
目的：总结分析采用骨髓间充质干细胞移植治疗四肢骨折骨不连的临床疗效。
方法：检索1998至2014年西文生物医学期刊文献数据及CNKI数据库有关骨髓间充质干细胞移植治疗四肢骨折骨不连的文献，英文检索词为“bone marrow stem cel s(BMSCs),stem cel transplantation(SCT), nonunions,tissue engineering”，中文检索词为“骨髓间充质干细胞，干细胞移植，骨不连”。排除内容重复和缺乏原创性文献，保留36篇文献做进一步分析。
结果与结论：将骨髓间充质干细胞移植到骨不连断端骨组织，可诱导其分化为成骨细胞来修复骨不连、骨缺损，为临床应用奠定了理论基础。骨髓间充质干细胞具有明确的骨缺损修复能力，众多研究表明采用骨髓间充质干细胞移植治疗四肢骨折骨不连是安全、有效的。 -
穴位注射骨髓间充质干细胞后心肌梗死大鼠血管细胞黏附因子1及迟发抗原4的表达
背景：目前认为骨髓间充质干细胞归巢是由黏附分子和趋化因子介导的，该过程有骨髓内皮细胞、造血干细胞、骨髓造血微环境及其分泌或表达的分子共同参与，黏附分子可能在其中起到重要作用。
目的：以血管细胞黏附因子1和迟发抗原4为指标探讨穴位注射骨髓间充质干细胞向心肌迁移、趋化的机制。方法：贴壁法培养骨髓间充质干细胞，以第3代为种子细胞，调整细胞浓度为1×1010 L-1。60只SD大鼠随机分为假手术组、模型组、心肌注射骨髓间充质干细胞组(以下简称心肌组)，穴位注射骨髓间充质干细胞组(以下简称穴位组)，每组15只。采用结扎左冠状动脉前降支方法复制心肌梗死模型，穴位组造模成功72 h后于心俞、至阳、膻中每穴位注入骨髓间充质干细胞0.3 mL，心肌组造模成功72 h后二次开胸，左前降支供血区域及周边心肌分6点均匀地移植骨髓间充质干细胞1.2 mL，4周后颈动脉插管，多道生理记录仪检测血流动力学指标，ELISA法检测血清血管细胞黏附因子1及迟发抗原4表达水平。
结果与结论：心肌组、穴位组大鼠心功能得到改善，两组血清血管细胞黏附因子1及迟发抗原4较模型组升高，心肌组和穴位组比较差异无显著性意义。结果说明血管细胞黏附因子1/迟发抗原4轴可能是穴位注射干细胞趋化机制之一。 -
接受干细胞移植重型β地中海贫血患者部分细胞因子水平与移植物抗宿主病的关系
背景：细胞因子在移植物抗宿主病的发生发展过程中起至关重要的作用，但目前缺乏其在重型β地中海贫血中的研究报道。
目的：探讨细胞因子与重型β地中海贫血患者造血干细胞移植后发生移植物抗宿主病之间的关系。
方法：采用液相芯片技术检测11例重型β地中海贫血移植物抗宿主病出现前，出现时，出现第4天，第7天，完全消失时白细胞介素6、白细胞介素8、白细胞介素12、肿瘤坏死因子α、巨噬细胞游走抑制因子的动态变化。
结果与结论：各时相白细胞介素6、白细胞介素12、肿瘤坏死因子α、巨噬细胞游走抑制因子水平差异有显著性意义，移植物抗宿主病出现时各细胞因子水平高，移植物抗宿主病出现第7天次之。各时相白细胞介素8水平差异有显著性意义，移植物抗宿主病出现第4天高。以上结果提示移植物抗宿主病发生前后白细胞介素6、白细胞介素8、白细胞介素12、肿瘤坏死因子α、巨噬细胞游走抑制因子动态水平变化在一定程度上反映移植后患者的免疫状态，可作为辅助诊断移植物抗宿主病的监测指标。 -
脐带间充质干细胞移植治疗类风湿性关节炎患者Th1/Th2、Treg的变化
背景：类风湿性关节炎是自身免疫性疾病，传统治疗方法很难有效解决患者免疫耐受机制缺失的问题。随着干细胞再生医学的发展，应用干细胞治疗免疫性疾病成为热点。目前国内外对于细胞移植治疗类风湿性关节炎少有报道。
目的：探讨脐带间充质干细胞对类风湿性关节炎患者Th1/Th2、Treg变化的影响，为类风湿性关节炎寻找新的治疗方法。
方法：180例类风湿性关节炎患者，其中27例为对照组，给予非类固醇抗炎药和抗风湿药，153例为治疗组，静脉输注细胞数为4×107的脐带间充质干细胞40 mL，用药方案与对照组相同，76例患者在第1次细胞治疗的三四个月后接受了2次脐带间充质干细胞治疗。随访治疗后3，6个月进行临床有效性评估(DAS28、HAQ、ACR20)、类风湿因子、抗CCP抗体、T细胞亚群、Th细胞因子检测。部分2次细胞治疗患者随访至8个月检测Treg、T细胞亚群。
结果与结论：①随访3个月时，细胞治疗组DAS28评分、HAQ评分、ACR20较对照组下降明显，差异有非常显著性意义(P <0.01)。②脐带间充质干细胞治疗3，6个月的DAS28评分、HAQ评分较治疗前明显下降(P<0.01)，2次治疗较1次治疗继续下降(P<0.01)。③治疗后3，6个月γ-干扰素水平较治疗前变化不明显，治疗后6个月白细胞介素4水平较治疗前逐渐上升(P<0.05)。④治疗后3，6个月Treg较治疗前明显上升(P<0.01)，同时治疗后Treg升高与ACR明显相关，尤其是ACR70百分率(P<0.05)；治疗后3个月CD4+Treg比率明显升高(P<0.05)，6，8个月时与治疗前相比也是升高趋势，但差异无显著性意义(P>0.05)。⑤治疗后6个月B细胞水平明显下降(P<0.05)；治疗后3，6个月类风湿因子较治疗前均明显下降(P<0.05)。⑥治疗后3，6个月抗CCP抗体和白细胞介素17水平变化不大。结果表明类风湿性关节炎患者给予脐带间充质干细胞治疗后Th1/Th2趋于平衡、Treg升高与临床实验指标及症状的缓解直接相关。因此按风湿病指南用药的同时，协同使用脐带间充质干细胞可改善类风湿性关节炎患者免疫网络效应、调整免疫耐受、改善病情。 -
超声微泡增效移植间充质干细胞的归巢机制
背景：国内外动物实验已证实超声联合微泡能够显著增强干细胞移植治疗缺血性心血管疾病，但对其作用机制仍不明确
目的：通过超声微泡体外作用于细胞，探讨超声联合微泡能够显著增强干细胞移植治疗缺血性心血管疾病的机制。
方法：体外分别培养大鼠血管内皮细胞和骨髓间充质干细胞于培养板中，随机各分为对照组、超声组、超声微泡组。对照组不做干预，超声组以频率1 MHz，输出功率1 W/cm2，持续辐照90 s；超声微泡组加入5μL含氟碳气体脂质体超声微泡(约2×1011 L-1)，以同样超声条件作用90 s。
结果与结论：超声微泡组血管内皮细胞上清液的血管内皮生长因子和基质细胞衍生因子1表达水平均比对照组显著增高(P<0.05)。超声组血管内皮生长因子表达水平为与对照组无差异；而基质细胞衍生因子1为较对照组明显降低(P<0.01)。骨髓间充质干细胞干预后CXCR4基因表达，超声微泡组、超声组较对照组均明显增强(P<0.01)，但超声微泡组和超声组无统计学差异(P>0.05)。说明超声(1 MHz，1 W/cm2)联合微泡作用90 s能够促进血管内皮细胞分泌细胞因子(血管内皮生长因子和基质细胞衍生因子1)，同时促进骨髓间充质干细胞CXCR4基因表达，是其增强移植干细胞归巢效应的机制之一。 -
酪氨酸羟化酶修饰人脐血间充质干细胞移植帕金森病大鼠纹状体内的多巴胺含量
背景：研究表明，干细胞治疗比药物治疗更接近于恢复患者的生理模式，细胞移植治疗已逐渐成为一种趋势。目的：观察酪氨酸羟化酶修饰的脐血间充质干细胞移植后帕金森病大鼠纹状体内多巴胺含量的变化。
方法：将酶切鉴定后的新构建质粒pEGFP-C2-TH经电穿孔法转染第3代脐血间充质干细胞，注射到帕金森病大鼠右侧脑室，对照组注入PBS。观察移植细胞在大鼠脑组织内的迁移情况，高效液相色谱仪检测大鼠纹状体内多巴胺的含量。
结果与结论：质粒pEGFP-C2-TH转染的脐血间充质干细胞移植后8周，细胞逐渐向脑室转移，12周时迁移至皮质，可表达酪氨酸羟化酶抗原，且实验组多巴胺含量明显高于对照组(P<0.05)。结果表明酪氨酸羟化酶修饰的脐血间充质干细胞经脑室移植对帕金森病大鼠具有明显的治疗作用。 -
三维培养小鼠骨髓间充质干细胞的生物学特性
背景：骨髓间充质干细胞具有自我更新和多向分化潜能而被用于多种疾病治疗及研究，但是在目前的培养条件下，其极易发生老化和自分化而失去应用价值。
目的：研究三维球体培养对骨髓间充质干细胞干性及衰老的影响。
方法：取3周龄 C57/B6小鼠，分离培养骨髓间充质干细胞，分别接种于包被有壳聚糖的培养板和普通培养板。培养5 d后分别收集两组细胞，流式细胞术检测细胞表型及干性相关标志分子，应用PI和Annexin-V染色检测细胞凋亡，β-Gal染色鉴定衰老。
结果与结论：小鼠骨髓间充质干细胞培养第3天就可以聚集成球状生长，球体状生长的细胞干性相关标志分子CD44和Sca-1表达高于普通培养细胞，PI和Annexin-V染色可见球体培养细胞凋亡明显减少，且通过β-Gal染色可见球体状态生长的细胞无明显衰老。上述结果表明，三维球体培养技术有益于维持间充质干细胞的干性，减少其凋亡并延缓衰老。 -
利用层粘连蛋白扩增罗曼鹤鸡骨髓间充质干细胞
背景：鸡骨髓间充质干细胞是胚胎发育学、免疫学和肿瘤学研究重要的细胞模型，但如何大规模扩增并使其保持良好的未分化潜能是鸡骨髓间充质干细胞应用中亟待解决的难题。
目的：建立扩增鸡骨髓间充质干细胞的层粘连蛋白培养体系。
方法：将体外分离得到的鸡骨髓间充质干细胞分别接种在包被层粘连蛋白培养皿和传统二维培养皿上。经过体外扩增，比较两种培养体系下，鸡骨髓间充质干细胞的形态特征、表面标志物、扩增性能和成脂分化潜能。结果与结论：层粘连蛋白培养体系和常规培养体系中骨髓间充质干细胞的形态学特征和表面标志物表达没有显著差异，但层粘连蛋白培养体系获得的骨髓间充质干细胞增殖能力和分化潜能都明显优于传统培养体系。可见层粘连蛋白培养体系能快速地扩增出大量增殖能力强和未分化性能良好的鸡骨髓间充质干细胞，为鸡骨髓间充质干细胞的进一步深入研究和应用提供生物学基础。 -
Toll样受体3对胚胎骨髓来源间充质干细胞免疫调节Th17细胞的作用
背景：课题组前期研究发现胚胎骨髓来源的间充质干细胞促进人Th17细胞增殖，但内在的调节机制尚需阐明。目的：探讨Tol 样受体3对胚胎骨髓来源间充质干细胞免疫调节Th17细胞的作用。
方法：应用免疫磁珠分离正常人 CD4+ T 细胞，单独或与胚胎来源骨髓间充质干细胞共培养4 d。实时定量PCR测定白细胞介素17、Tol 样受体3及MyD88相关基因的表达水平。
结果与结论：相对于CD4+T细胞单独培养组，间充质干细胞共培养组白细胞介素17 mRNA表达水平明显升高(3.59±0.11 vs.1.14±0.08，P <0.01)；进一步发现 Tol 样受体3 mRNA 亦相应升高(3.10±1.60 vs.0.94±0.01，P <0.05)。而且，相对于CD4+T细胞单独培养组，胚胎骨髓来源间充质干细胞共培养组促进了MyD88的表达(2.29±0.05 vs.1.85±0.31，P<0.01)。研究结果表明Tol 样受体3可能对胚胎骨髓来源间充质干细胞免疫调节Th17细胞发挥作用，为今后潜在的细胞治疗策略提供可能的实验依据。 -
优化培养基加快骨髓间充质干细胞的诱导分化
背景：研究发现骨髓间充质干细胞在一定的诱导条件下能分化成神经元、神经胶质等神经细胞，这一定程度上解决了种子细胞来源的难题。目前采用的诱导方法各有不同，所诱导分化的效率也不尽相同。
目的：观察不同抗氧化剂体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经样细胞分化的效果。
方法：将Wistar大鼠骨髓间充质干细胞分为4组，使用不同神经细胞诱导剂诱导分化，分别为未干预组、β-巯基乙醇组、维甲酸组、β-巯基乙醇联合维甲酸组，诱导5 h，12 h，1 d，3 d，5 d，7 d，10 d后，分别观察细胞形态变化及检测神经元细胞特异性抗原神经元特异性烯醇化酶、微管相关蛋白2阳性率表达差异。
结果与结论：未干预组骨髓间充质干细胞形态无明显改变，其他3组细胞逐渐变成纺锤形，并生出多个小突起，互相连接成网，呈现神经元样细胞形态；免疫细胞化学染色显示β-巯基乙醇联合维甲酸组在诱导10 d后其效率高，神经元特异性烯醇化酶、微管相关蛋白2表达阳性率分别是71.63%和79.72%。结果显示β-巯基乙醇联合维甲酸可加快诱导骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化。 -
富血小板纤维蛋白释放转化生长因子β1对骨髓间充质干细胞体外增殖的影响
背景：骨髓间充质干细胞是组织修复的理想细胞，能否提高其体外增殖的能力是促进组织修复的关键因素。目的：观察转化生长因子β1对骨髓间充质干细胞体外增殖的影响。
方法：兔耳中央动脉抽血，离心制备富血小板纤维蛋白，置于新鲜的DMEM培养液中，分别于37℃下静置7，14，21，28 d，收集富血小板纤维蛋白析出液，检测析出液中转化生长因子β1质量浓度。抽取兔骨髓进行体外培养骨髓间充质干细胞，将收集的富血小板纤维蛋白析出液配制成条件培养液作用于骨髓间充质干细胞，观察其对骨髓间充质干细胞增殖的影响。
结果与结论：转化生长因子β1质量浓度随着时间的递增而增高，21-28 d是质量浓度增长快阶段，在28 d时达到高峰；同一刺激浓度下，骨髓间充质干细胞增殖在0至1 d降低，1至2 d明显升高，2至3 d为平缓期，骨髓间充质干细胞增殖速度快的是150 ng/L组。实验证实了富血小板纤维蛋白析出液中转化生长因子β1的质量浓度随着时间的增加而增高，含有不同质量浓度转化生长因子β1的条件培养基对骨髓间充质干细胞增殖起到不同的促进作用，骨髓间充质干细胞在含有质量浓度为150 ng/L转化生长因子β1的条件培养基中培养两三天时，增殖速度为快。 -
促红细胞生成素促进内皮祖细胞增殖依赖于PI3K/Akt信号通路
背景：促红细胞生成素能促进组织损伤部位血管生成，与其促进内皮祖细胞增殖、分化密切相关，但促红细胞生成素促进内皮祖细胞增殖、分化的机制尚不清楚。
目的：观察促红细胞生成素对小鼠骨髓来源内皮祖细胞功能活性的影响，并初步阐明其信号机制。
方法：密度梯度离心法分离获取小鼠骨髓内皮祖细胞，鉴定后传代培养，以 PI3K 特异性抑制剂 LY294002作干预处理，实验细胞分为EGM-2组、促红细胞生成素处理组(培养液中促红细胞生成素浓度分别为1，5，10 U/mL)、促红细胞生成素+LY组(培养液中分别含有10 U/mL促红细胞生成素及10 mmol/L LY294002)、LY组(培养液中含10 mmol/L LY294002)、二甲基亚砜组(培养液中含1 mL/L二甲基亚砜)，分别采用CCK8试剂盒、流式细胞法检测细胞增殖和凋亡，采用ELISA法检测细胞裂解液内皮型一氧化氮合酶、血管内皮生长因子含量，Western blot法测定细胞裂解液中Akt及p-Akt表达。
结果与结论：促红细胞生成素能显著促进内皮祖细胞增殖，并随培养基中促红细胞生成素含量增加而呈现量效关系，而促红细胞生成素的促增殖作用可被 LY294002完全抑制。促红细胞生成素处理组细胞凋亡率明显低于促红细胞生成素+LY组。LY组、促红细胞生成素+LY组细胞裂解液中内皮型一氧化氮合酶、血管内皮生长因子含量显著低于促红细胞生成素处理各组。各组 Akt 表达无明显差异，而促红细胞生成素+LY 组 p-Akt表达显著低于促红细胞生成素各组。上述结果提示，促红细胞生成素能显著促进体外培养的内皮祖细胞的增殖、降低内皮祖细胞的凋亡率，其作用依赖于PI3K/Akt信号通路。 -
慢性腱病模型大鼠肌腱干细胞体外成脂和成肌腱的分化能力
背景：慢性腱病是一种常见的肌腱退行性病变，好发于运动员以及肌腱过度劳损的人群。由于慢性腱病的发病机制尚未阐明，临床上还缺乏有效的治疗手段。
目的：体外研究比较慢性腱病大鼠和正常大鼠来源肌腱干细胞成脂、成肌腱分化能力。
方法：从慢性腱病大鼠以及正常大鼠髌腱中分离培养原代肌腱干细胞，传代培养至第3代，体外观察细胞形态学变化。将两种来源肌腱干细胞(P3)单层培养至细胞融合，分为2组，成脂诱导组用成脂诱导培养基培养，对照组用基础培养基培养。成脂诱导分化21 d后，将两种来源肌腱干细胞的成脂诱导组和对照组分别行油红O染色定量分析。实时荧光定量PCR检测各组细胞成脂性基因C/EBPα和PPARγ2的mRNA的表达。将两种来源的肌腱干细胞体外单层培养至70%-80%融合时，行实时荧光定量PCR检测慢性腱病来源肌腱干细胞以及正常肌腱干细胞成肌腱相关基因Col1a1，Scx，Tnmd和Dcn的mRNA的表达。
结果与结论：肌腱干细胞体外培养至第3代时，正常肌腱来源的肌腱干细胞保持细长纺锤形的典型的干细胞形态，而慢性腱病来源的肌腱干细胞虽然形态发生改变，但仍保持纺锤形形态。肌腱干细胞(P3)体外成脂诱导分化21 d后，慢性腱病来源的肌腱干细胞胞体变大、变圆，可见大量油红O染色阳性的细胞，油红O染色阳性率显著高于正常大鼠(P=0.004)。实时荧光定量PCR结果显示，慢性腱病大鼠来源肌腱干细胞的成脂性基因(C/EBPα和PPARγ2)mRNA的表达均显著高于正常大鼠(P=0.004)，肌腱特异性基因Col1a1，Scx， Tnmd以及Dcn mRNA表达量均明显低于正常大鼠(P =0.009)。说明与正常大鼠来源的肌腱干细胞相比，慢性腱病来源的肌腱干细胞体外成肌腱分化的能力减弱，而成脂分化的能力增强，此结果为进一步揭示慢性腱病发病机制提供了细胞生物学依据。 -
小鼠胚胎成纤维细胞的分离培养及饲养层制备
背景：建立一种既可以大量制备，又易于保存并保持较高活性的饲养层细胞是人胚胎干细胞培养研究的重要环节。
目的：建立昆明小鼠胚胎成纤维细胞的佳分离培养方法，评价其用于人胚胎干细胞饲养层研究的可行性。方法：用不同浓度胰蛋白酶分步消化法体外分离和培养昆明小鼠胚胎成纤维细胞，观察其生物学特性，制备胚胎成纤维细胞饲养层，检测人胚胎干细胞在饲养层上培养的生长状态。
结果与结论：制备昆明小鼠胚胎成纤维细胞饲养层的佳胎龄为13.5 d。不同浓度胰蛋白酶分步消化法制备的胚胎成纤维细胞生长状态好，获得的成纤维细胞纯度高，增殖活跃。冻存2周，1，3，6个月内复苏的细胞存活率差异无显著性意义。小鼠胚胎成纤维细胞在第2-4代增殖旺盛，第5代以后细胞增殖活力明显下降。人胚胎干细胞在小鼠胚胎成纤维细胞长期传代后呈典型的未分化形态，碱性磷酸酶和过碘酸-雪夫染色均为阳性。结果表明建立的昆明小鼠胚胎成纤维细胞饲养层分离培养法可为人胚胎干细胞扩增提供稳定、优质的饲养层细胞。 -
新生小鼠海马、嗅球及皮质神经干细胞的分离培养及鉴定
背景：从体外分离培养出高纯度、生物学性能均一的神经干细胞，建立起一套完整的神经干细胞培养体系，是进行神经干细胞研究的基础。
目的：建立新生小鼠海马、嗅球、皮质组织神经干细胞的分离培养体系，并对其生物学特性进行分析。
方法：分离新生昆明小鼠海马、嗅球、皮质组织，采用机械分离和胰酶消化法提取原代神经干细胞。采用无血清培养技术、机械吹打和酶消化法进行传代培养神经干细胞。以体积分数为10%的胎牛血清诱导分化神经干细胞。对神经干细胞及其分化产物行CD133、巢蛋白、β-微管蛋白Ⅲ、胶质纤维酸性蛋白免疫荧光染色鉴定。
结果与结论：从新生小鼠海马、嗅球、皮质可提取出具有自我更新和多向分化能力的神经干细胞，经巢蛋白、CD133免疫荧光染色检测呈阳性；神经干细胞经胎牛血清诱导后可分化为β-微管蛋白Ⅲ、胶质纤维酸性蛋白阳性细胞，并证实染色阳性细胞为神经元和星形胶质细胞。该实验建立了一套神经干细胞体外分离培养、纯化、鉴定、诱导分化方案，为后续神经干细胞研究的顺利进行奠定了实验基础。 -
慢病毒载体介导绿色荧光蛋白转染大鼠牙髓干细胞
背景：对牙髓干细胞进行稳定高效安全的体外标记是示踪技术中首先需要解决的问题，也是牙齿再生体内研究的基础。
目的：探讨慢病毒载体介导绿色荧光蛋白转染大鼠牙髓干细胞的理想条件及方法，并确定其转染后是否保持干细胞特性。
方法：通过改良酶消化法获得大鼠牙髓干细胞，对其免疫表型及分化潜能进行鉴定，以感染复数为5，10，25，50和100的慢病毒载体介导绿色荧光蛋白作用24 h和48 h，倒置显微镜下检测转染率和荧光强度，并对大鼠牙髓干细胞感染前后的克隆增殖能力、细胞周期及牙向分化能力进行比较，评价感染对其生物学特性的影响。
结果与结论：流式细胞仪检测结果显示大鼠牙髓干细胞STRO-1和CD146表达阳性，CD34和CD45表达阴性，经相应诱导培养后可向成骨和成脂分化。当感染复数为50，作用时间为48 h时，转染效率高，荧光表达强；感染前后细胞增殖、克隆形成率及细胞周期等方面差异无显著性意义(P>0.05)，碱性磷酸酶阳性表达。说明感染复数为50作用48 h是慢病毒载体介导绿色荧光蛋白转染大鼠牙髓干细胞的理想条件，且不影响牙髓干细胞生物学特性，为大鼠牙髓干细胞的体内研究提供了可靠的示踪方法。 -
干细胞源性血管依从性与缺血态组织二次血流的重建
背景：探寻血管腔内修复术后二次肢体血流重建的方法也是该学科领域中迫切的研究课题之一。目的：探讨自体干细胞移植衍生的新生血管主导和完善缺血态组织二次血流重建效应的生物学机制。
方法：下肢动脉缺血性疾病患者42例，第1次血流重建方法选择血管腔内修复术，第2次血流重建方法选择自体外周血干细胞移植，于首次术后3个月实施，自体外周血干细胞移植后随访4年。
结果与结论：自体外周血干细胞移植后自觉小腿区静息痛明显减轻，间隙性跛行距离显著延长，保肢率100%；患者肢体局部血流量变效应指标皮温指数为1.6±0.3，经皮氧分压为(5.00±1.26) kPa，踝肱指数为0.9±0.2，光电容积微血流态指数为0.8±0.1，血氧饱和度为(79.4±20.4)%，数字减影血管造影评分为1.3±0.2，各项指标均较移植前有显著改善。移植后下肢局部血流量变效应指标与肢体局部症状变化指标呈正相关(0.6< r <0.7，P<0.05)。结果可见干细胞源性新生血管量及其供给组织的持久有效的血液灌注量是主导和完善缺血态组织二次血流重建效应的主要生物学机制。 -
胎盘来源细胞与母血、脐血细胞的嵌合
背景：胎盘中含有丰富的细胞群，因其中 CD34+细胞含量高而受到越来越多学者的关注，有望成为临床造血干细胞移植治疗血液病及其他恶性疾病的新来源。
目的：探索胎盘来源细胞的数量、集落形成能力及其与母体的嵌合程度。
方法：采用健康足月剖腹产妇的胎盘，灌注法及组织块消化法收集胎盘中细胞；流式细胞仪检测胎盘及脐血中 CD34+细胞比例；培养细胞集落，定期观察集落形态并计数；序列特异性引物 PCR 扩增技术及序列特异性寡核苷酸探针方法检测胎盘、脐血和母亲外周血的HLA类型；短串联重复PCR方法检测胎盘细胞、脐血细胞和母亲外周血细胞的嵌合情况。
结果与结论：胎盘中 CD34+细胞数量明显优于脐血，且胎盘具有体外多种集落形成能力，集落形成良好，同时胎盘提取细胞中含有母体来源成分。提示胎盘中细胞数量及其基本生物学特性使其有潜力成为临床造血干细胞移植的新来源。 -
SK-N-SH神经母细胞瘤干细胞培养及鉴定
背景：神经母细胞瘤是儿童较为常见的实体瘤，儿童肿瘤受环境因素影响小，其与发育的关系紧密。而悬浮法是一种有效并可靠的获得肿瘤干细胞的方法。
目的：采用悬浮法培养人神经母细胞瘤SK-N-SH，获得具有干细胞特性的克隆球，并对其生物学特性进行鉴定。
方法：采用无血清悬浮培养的方法，获得具有克隆性增生的肿瘤球，免疫荧光鉴定克隆球细胞是否具有干细胞特性；通过荧光素酶标记SK-N-SH神经母细胞瘤，将所得克隆球与普通培养肿瘤细胞种植在裸鼠背部，活体成像监测细胞在裸鼠体内的增殖特性。
结果与结论：悬浮培养法可将SK-N-SH神经母细胞瘤培养成克隆球，将无血清培养的克隆球免疫荧光检测分子生物学标记，显示强阳性表达，将其种植于裸鼠背部皮下显示其具有较强增殖与转移的生物学特性。提示悬浮法培养的 SK-N-SH神经母细胞瘤克隆球，分子生物学标记巢蛋白 Nestin强表达，胶质原纤维酸性蛋白、特异性神经元管蛋白(Tuj-1)弱表达，具有神经干细胞的特性，在裸鼠体内具有较强的增殖性与转移侵袭性。 -
人脐带间充质干细胞与乳鼠许旺细胞共培养向类神经元样细胞的分化
背景：间充质干细胞可以通过化学诱导或者共培养的方法分化为类神经细胞，但是对于间充质干细胞是与许旺细胞共培养分化为类神经元还是类许旺细胞，还存在争议。
目的：探索大鼠许旺细胞对人脐带间充质干细胞诱导分化作用。
方法：将1×109 L-1人脐带间充质干细胞通过Transwel 隔离小室与1×109 L-1SD乳鼠许旺细胞共培养2周，观察脐带间充质干细胞的形态变化，并用免疫荧光法检测其表型变化。
结果与结论：共培养2周后，部分间充质干细胞出现类似神经元的形态，且表达nestin，NF-200，β-Ⅲ-tubulin等神经元特异性标记物，不表达许旺细胞特异性表记物S100和胶质细胞特异性标记物MAB1580。提示人脐带间充质干细胞可以与大鼠许旺细胞非接触共培养分化为类神经元。 -
人脐带间充质干细胞联合番茄红素延缓比格犬的自然衰老
背景：实验室前期已初步表明干细胞联合番茄红素对D-半乳糖衰老模型小鼠的抗衰老作用显著，且能明显改变衰老机体的免疫功能。
目的：观察人脐带间充质干细胞联合番茄红素对自然衰老比格犬的抗衰老作用。
方法：选用自然衰老的健康比格犬(6至7岁龄)16只，随机分为衰老对照组和衰老治疗组，以健康青年犬(3至4岁龄)作为青年对照组。衰老治疗组给予人脐带间充质干细胞和番茄红素联合治疗，其余两组给予等量的DMEM/F12细胞培养液和等量葵花籽油。治疗过程中定期观察各组犬的一般状况，测定血清中超氧化物歧化酶活性、丙二醛浓度及谷胱甘肽过氧化物酶活性。治疗24周后处死全部动物，观察各器官组织结构的病理变化。
结果与结论：①治疗前，衰老对照组和衰老治疗组血清超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶活性均低于青年对照组，血清丙二醛浓度均高于青年对照组，差异有显著性意义(P均<0.05)，而衰老对照组和衰老治疗组之间差异无显著性意义(P >0.05)。②衰老治疗组经24周治疗后，比格犬皮毛明显光滑，活动力加强，食欲较好；与治疗前和衰老对照组比较，血清中超氧化物歧化酶活性从治疗第8周起显著升高，谷胱甘肽过氧化物酶活性从第6周起显著升高(P均<0.05)，血清丙二醛浓度从治疗第4周起显著降低(P均<0.05)。③实验结束后，与衰老对照组比较，衰老治疗组各组织器官结构清晰，基本无炎性浸润，无明显坏死及纤维化病变，与青年对照组组织器官表现基本一致。以上结果表明脐带间充质干细胞联合番茄红素治疗能不同程度提高自然衰老比格犬血清抗氧化物酶的活性，降低丙二醛浓度，且能促进修复改善组织器官结构及功能，故具有明显的抗衰老作用。 -
低氧条件下诱导人胚胎干细胞向血管内皮前体细胞的分化
背景：种子细胞的数量和质量是制约血管组织工程研究的重要瓶颈，而如何获取干细胞源内皮细胞是解决该瓶颈问题的关键。
目的：探讨添加血管内皮生长因子联合低氧环境是否能够协同高效诱导胚胎干细胞向内皮细胞定向分化。
方法：采用无血清培养基mTeSR?1维持培养人胚胎干细胞H9。通过添加血管内皮生长因子(50μg/L)联合低氧条件(体积分数为5%O2)诱导H9细胞向内皮细胞分化。采用免疫荧光染色技术、定量RT-PCR以及低密度脂蛋白摄取实验对人胚胎干细胞源内皮细胞进行表型和功能评价。
结果与结论：添加血管内皮生长因子联合低氧培养条件可促进H9细胞向内皮细胞方向分化。该胚胎干细胞源内皮细胞不但高水平表达内皮细胞的标志基因(kdr，pecam)和标记蛋白D31，而且还能够摄取低密度脂蛋白，形成类似微血管结构。提示血管内皮生长因子与低氧在诱导干细胞向内皮细胞分化过程中存在协同效应，可高效获得具有理想表型和功能活性的干细胞源内皮细胞。
