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人参皂苷Rg1促进神经干细胞增殖的实验研究
目的 探讨人参皂苷Rg1是否对神经干细胞的增殖具有促进作用.方法 从大鼠脑组织分离神经细胞,在培养液中加入10 μg·L-1表皮生长因子(EGF)和10 μg·L-1碱性成纤维细胞生长因子(bFGF),使形成富含神经干细胞的神经球.在培养液中加入人参皂苷Rg1,观察其对神经干细胞增殖的促进作用.采用大鼠缺血性中风后遗症模型,观察人参皂苷Rg1对大鼠神经功能恢复的影响.结果 在表皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子培养条件下可出现明显的神经球.在2 μmol·L-1浓度下人参皂苷Rg1可以增加神经细胞中神经球的数量,表明人参皂苷Rg1可以促进神经干细胞的生存和增殖.2 μmol·L-1浓度下人参皂苷Rg1可以显著促进神经球的形成.缺血性中风大鼠给与人参皂苷Rg1后其横木行走评分增加,在第14天实验中,中剂量和高剂量组行走评分分别为(4.09±0.49)分和(4.74±0.62)分,而模型对照组为(3.41±0.67)分,差异均有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01).免疫组化显示对大脑组织的细胞增殖也有促进作用.结论 人参皂苷Rg1对神经干细胞增殖的促进作用,表明其在神经系统损伤性疾病的康复中有潜在的治疗价值,值得进一步研究.
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体外培养的人源神经干-祖细胞超微结构分析
目的 研究神经干细胞的超微结构.方法 利用无血清培养技术从人胚脑组织中分离培养神经干-祖细胞,扫描及透射电镜观察单个神经干-祖细胞及神经球的超微结构.结果 所得神经干-祖细胞体外培养呈典型的神经球样生长.神经球内部由细胞以及无定形结构的物质构成,根据电子密度的不同可分明细胞和暗细胞.相邻细胞间存在细胞连接,部分相邻细胞间以及连接处的胞膜内侧可见小囊泡样结构,部分相邻细胞间还可见胞膜融合.扫描电镜下可见单个神经干-祖细胞呈球形,表面不光滑.透射电镜下可见神经干-祖细胞胞核大,胞质少,核质比高,多种细胞器不发达,多数细胞中自噬小体多见.神经干-祖细胞间存在明显的异质性,包括高尔基复合体、核糖体、溶酶体、神经微幺幺及微管等在不同神经干-祖细胞中的含量和分布均不一致.单个细胞的细胞核多呈球形,也可见.肾形和分叶状,而神经球中细胞核欠规则.神经干-祖细胞常染色质多,异染色质少;单个核仁多见,两个或以上核仁罕见.结论 人胚胎来源的神经干-祖细胞及神经球超微结构中见到的自噬小体、相邻细胞间以及相邻处的胞膜内侧的小囊泡样结构、相邻细胞间的胞膜融合现象,可为研究腩肿瘤干细胞的超微结构奠定基础.
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体外培养的神经干细胞球的超微结构
目的探讨体外培养的神经干细胞球的超微结构. 方法采用常规透射电镜结合硝酸镧示踪染色、钌红染色和单宁酸染色等技术,观察体外培养的大鼠脑神经干细胞球的超微结构. 结果神经球中细胞之间连接较为松散,不存在紧密连接结构,神经干细胞增殖活跃,并可见神经球中有部分干细胞分化为具有突起和轴突样结构的细胞,甚至出现髓鞘样结构. 结论揭示了体外培养的神经干细胞球的超微结构.
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人乳牙牙髓干细胞体外表达和分泌胶质细胞源性神经营养因子的研究
目的 研究人乳牙牙髓干细胞(SHED)表达和分泌胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)的能力及规律,为进一步探讨SHED治疗帕金森病的作用机制提供依据.方法 通过酶消化法体外分离培养人乳牙牙髓中的干细胞,当传代至第3代时,加入神经干细胞的特殊培养基Neurobasal A和细胞因子进行神经球诱导培养,通过Real-Time PCR、免疫荧光和ELISA等方法,分别从mRNA和蛋白水平检测体外培养SHED和神经球中GDNF的表达.结果 Real-Time PCR检测结果显示,在mRNA水平,SHED和神经球中都有GDNF的表达.在蛋白水平,免疫荧光结果可见SHED和神经球中都有GDNF的表达;采用ELISA法在培养第3天的SHED培养液和神经球的培养上清中均可检测到GDNF,并随着时间的延长,培养液中GDNF浓度明显升高.结论 SHED具有表达和分泌GDNF的能力.
关键词： 人乳牙牙髓干细胞 神经球 胶质细胞源性神经营养因子 -
成年大鼠嗅球神经干细胞的培养和鉴定
目的 建立成年大鼠嗅球神经干细胞分离培养和鉴定方法,探索新的成年神经干细胞种子来源.方法 用无血清方法分离培养成年大鼠嗅球来源的神经干细胞;用克隆培养、BrdU整合的方法检验培养细胞的干细胞特性;用免疫荧光细胞化学的方法检测BrdU、神经干细胞标记物Nestin和SOX2,分化的细胞标记物Tuil、GFAP、NG2的表达.结果 从成年大鼠嗅球能够分离、培养出具有自我更新、增殖的神经球.构成神经球的细胞呈Nestin和SOX2阳性,它们分化后产生Tujl阳性的神经元、GFAP阳性的星形胶质细胞、NG2阳性的少突胶质细胞.结论 成年大鼠嗅球存在神经干细胞,能够在体外进行培养、增殖、分化,是神经干细胞的新的种子来源.
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五味子木脂素诱导胶质瘤神经球细胞凋亡的机制研究
目的 研究五味子木脂素诱导人脑胶质瘤SHG-44神经球细胞凋亡的作用机制.方法 四甲基偶氮唑蓝法分析检测五味子木脂素对SHG-44神经球细胞增殖的影响;Annexin V/PI分析凋亡率;酶联免疫吸附法法检测培养上清中bax、bcl-2和caspase3蛋白分泌的变化,蛋白质印迹法检测神经球bcl-2蛋白表达变化.结果 50、100、200 mg·L-1五味子木脂素作用24、48和72 h时,均能明显抑制SHG-44神经球细胞的增殖,作用呈剂量依赖性.Annexin V/PI结果显示,五味子木脂素可诱导SHG-44神经球细胞明显凋亡,作用亦呈剂量依赖性.酶联免疫吸附法结果显示,不同浓度五味子木脂素作用后,bcl-2蛋白分泌明显下调使bax/bcl-2比例升高,caspase3蛋白分泌增加.蛋白质印迹结果显示,SHG-44神经球表达bcl-2蛋白明显下降.结论 五味子木脂素通过下调bcl-2的表达和分泌,使抑制凋亡因素减弱而促凋亡因素占优势,使caspase3活化,进而引起SHG-44神经球细胞发生凋亡.
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一种新的将神经球分散为单细胞悬液的方法
目的 比较3种将神经球打散成单细胞悬液的方法对神经干细胞活性的影响.方法 将16～20周人胚胎神经干细胞体外培养扩增形成神经球,分别用胰蛋白酶消化法、巴斯德管吹打法和消化振荡法,将神经球打散成单细胞悬液,通过台盼蓝染色测定细胞活性及接种后增生情况,观察3种方法对神经干细胞活性的影响.结果 消化振荡法打散神经球,细胞存活率(96.20%)和再次成球率(19.24%)都较其他2种方法高,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 消化振荡法对人胚胎神经干细胞的活性影响较小,是一种有效、安全的将神经球打散成单细胞悬液的实验方法.
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神经干细胞分离培养方法的介绍
在成体的许多组织中发现了多能干细胞,这些干细胞可以进行自我复制,参与组织的正常修复.神经干细胞在体外能分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞,并具有多向分化潜能.成体神经干细胞和胚胎干细胞都能分化成成体神经系统中的各种神经细胞.神经干细胞具有自我更新能力,因此神经干细胞可以应用于神经损伤或者神经疾病的修复.本文概述了神经干细胞体外分离培养的方法及其生长影响因子.
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中性蛋白酶Ⅱ消化法在神经元诱导培养中的应用
[目的]建立中性蛋白酶Ⅱ(DispaseⅡ)对神经球的分散、消化及消化后神经元的诱导培养方法.[方法]取15d胎鼠的脑组织,经剪碎、研磨、血清培养基培养得到的神经球,培养2d后观察细胞贴壁情况,并换成诱导剂培养液培养3d,用DispaseⅡ消化已培养的神经球,后期将经DispaseⅡ消化后的细胞继续进行培养、诱导、鉴定.[结果]用DispaseⅡ消化神经细胞后体外培养并诱导,神经球能够诱导分化成神经元,并能形成典型的神经元细胞网状,经NSE鉴定阳性.[结论]利用DispaseⅡ消化的方法能够将神经球消化成单个细胞,消化后的细胞能够继续培养并向神经元分化.
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神经球方法体外无血清含生长因子培养的神经干细胞主要向神经胶质细胞分化
背景:体外分离培养出神经干细胞并掌握其生物学特性是神经干细胞移植研究的前提.目的:采用神经球方法分离培养胎鼠皮质神经干细胞,并观察其生长和分化特性.方法:利用无血清悬浮方法分离培养胚胎来源的神经干细胞,用免疫细胞化学的方法检测神经干细胞及其分化细胞的标志物.结果与结论:体外无血清含生长因子的培养液培养胎鼠皮质神经干细胞,可得到悬浮生长的神经球,但悬浮生长的神经球可以发生融合,免疫细胞化学显示神经球呈巢蛋白表达阳性,神经干细胞可以分化为神经元,神经胶质细胞和少突胶质细胞,但主要向神经胶质细胞分化.说明在血清含有生长因子的而培养条件下,利用神经球方法可以分离培养出胎鼠皮质神经干细胞.
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神经干细胞体外培养鉴定及诱导分化的表型特征
背景:神经干细胞促进受损中枢神经系统结构和功能再修复具有广阔的应用前景,而进行神经干细胞体外培养鉴定及诱导分化表型的研究是实现这一应用的基础.目的:观察神经干细胞在体外培养条件下的生物学特性和分化表型特点.方法:从新生小鼠海马、嗅球提取神经干细胞.选取 3 代后稳定的神经干细胞采用 BrdU 进行标记,并进行BrdU+巢蛋白+Hochest33258免疫荧光复合染色对神经干细胞进行鉴定.体外诱导促使神经干细胞贴壁分化,对分化产生的子代细胞进行BrdU、β-微管蛋白Ⅲ、胶质纤维酸性蛋白、Hochest33258复合免疫荧光染色确定分化表型.结果与结论:来源于新生鼠海马及嗅球的细胞连续传代培养后可形成稳定悬浮的类球状细胞团,且 BrdU+巢蛋白免疫荧光双染阳性.神经干细胞体外诱导贴壁分化后可产生β-微管蛋白Ⅲ、胶质纤维酸性蛋白阳性的子代细胞.以上结果表明体外培养的神经干细胞具有很强的自我增殖更新的能力,在培养过程中趋向于形成稳定的神经球,经体外诱导通过不对称细胞增殖、分化产生神经元和星形胶质细胞等细胞表型.
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新生小鼠海马、嗅球及皮质神经干细胞的分离培养及鉴定
背景：从体外分离培养出高纯度、生物学性能均一的神经干细胞，建立起一套完整的神经干细胞培养体系，是进行神经干细胞研究的基础。
目的：建立新生小鼠海马、嗅球、皮质组织神经干细胞的分离培养体系，并对其生物学特性进行分析。
方法：分离新生昆明小鼠海马、嗅球、皮质组织，采用机械分离和胰酶消化法提取原代神经干细胞。采用无血清培养技术、机械吹打和酶消化法进行传代培养神经干细胞。以体积分数为10%的胎牛血清诱导分化神经干细胞。对神经干细胞及其分化产物行CD133、巢蛋白、β-微管蛋白Ⅲ、胶质纤维酸性蛋白免疫荧光染色鉴定。
结果与结论：从新生小鼠海马、嗅球、皮质可提取出具有自我更新和多向分化能力的神经干细胞，经巢蛋白、CD133免疫荧光染色检测呈阳性；神经干细胞经胎牛血清诱导后可分化为β-微管蛋白Ⅲ、胶质纤维酸性蛋白阳性细胞，并证实染色阳性细胞为神经元和星形胶质细胞。该实验建立了一套神经干细胞体外分离培养、纯化、鉴定、诱导分化方案，为后续神经干细胞研究的顺利进行奠定了实验基础。 -
不同代次大鼠脂肪间充质干细胞增殖及成神经球的能力比较
背景：脂肪间充质干细胞是一组具有多向分化潜能的干细胞，体外在一定条件下可分化为神经干细胞。目的：观察不同代次大鼠脂肪间充质干细胞体外培养增殖能力及诱导成神经球的潜力。
方法：取SD大鼠脂肪体外分离培养出脂肪间充质干细胞并传代扩增，分别在P3、P6、P10、P20时观察其形态学变化、测定增殖速度。流式细胞仪检测定不同代次细胞表型及细胞周期。将脂肪间充质干细胞诱导为神经球，计数成神经球率。
结果与结论：脂肪间充质干细胞主要呈长梭形，不同代次的脂肪间充质干细胞均具有很强的体外增殖能力；除P3细胞其他代次细胞均高表达CD29、CD44、CD73，低表达CD45、CD34。细胞周期中G0/G1期细胞所占比例P3为93.4%、P6为92.7%、P10为92.4%、P20为86.0%。P6、P10诱导成神经球率均显著高于P20(P<0.05)，P3细胞较难诱导成神经球。提示以脂肪间充质干细胞作为种子细胞时，应注意选择适宜的扩增代数，以便在获得足够纯度细胞的同时保留细胞佳的分化潜力。 -
五味子木脂素与顺铂抑制SHG-44神经球细胞的生长
目的：研究五味子木脂素和顺铂对人脑胶质瘤 SHG-44神经球细胞生长的作用。方法 MTT法分析检测五味子木脂素和顺铂对SHG-44神经球细胞生长的影响；ELISA法检测细胞培养上清中bcl-2及caspase 3蛋白的变化。结果50、100、200 mg/L五味子木脂素作用24、48、72 h，均能明显地抑制SHG-44神经球细胞的生长，作用呈浓度依赖性；10 mg/L顺铂作用后也可明显抑制神经球细胞的生长，作用呈时间依赖性。 Elisa结果显示，药物作用后bcl-2蛋白水平明显下调，而caspase 3蛋白水平明显上调。结论五味子木脂素和顺铂都可以通过下调抗凋亡蛋白bcl-2的水平，进而抑制SHG-44神经球细胞的生长。
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Aβ1～42促进体外培养神经干细胞增殖与存活
目的 探索β-淀粉样蛋白1-42(Aβ1～42)对神经干细胞(neural stem cells,NSCs)增殖的影响.方法 体外培养新生小鼠神经干细胞,实验分为溶媒对照组、阳性组及Aβ1-420.5、0.1、0.02μmol/L 3个剂量组,通过对神经球的形态观察、神经干细胞分化试验、BrdU标记试验、特异性蛋白质免疫细胞化学染色和MTT比色法鉴定NSCs,并以这些指标来判断物质的促NSCs增殖作用.结果 在Aβ1～420.1 μmol/L剂量组中有大量神经球生成,与对照组有显著差异(P≤0.01),神经干细胞BrdU标记、特异性蛋白质(nestin)免疫细胞化学染色均呈阳性.结论 低浓度(0.1 μmol/L)Aβ1～42可促进体外培养的NSCs增殖、分裂.
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顺铂对胶质瘤神经球的凋亡诱导作用及其机制
目的:研究顺铂对人脑胶质瘤SHG-44神经球的诱导凋亡作用,探讨其诱导凋亡的机制.方法:培养人脑胶质瘤SHG-44神经球,将其分为对照组和顺铂组,对照组细胞给予干细胞培养液,顺铂组细胞在对照组基础上给予10 mg·L-1顺铂作用24、48和72 h后,MTT法检测SHG-44神经球生长抑制率;倒置显微镜观察2组细胞凋亡情况;ELISA法检测2组SHG-44神经球分泌Bax、Bcl 2和caspase-3蛋白水平.结果:与对照组比较,10 mg·L-1顺铂作用SHG-44神经球24、48和72 h时的细胞生长抑制率均明显升高(P＜0.01).倒置显微镜下,顺铂组神经球数量明显减少,并可见到明显的凋亡小体.与对照组比较,10mg·L-1顺铂作用SHG-44神经球72 h,培养上清中Bax和Bcl-2分泌量均降低,caspase-3分泌量增加,Bax/Bcl-2比值明显升高(P＜0.05或P＜0.01).结论:顺铂可以明显地抑制SHG-44神经球生长,其机制可能是通过上调Bax/Bcl-2比值,使促凋亡因素占优势,从而使神经球发生凋亡.
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五味子提取物对脑胶质瘤神经球细胞增殖的抑制作用
目的:探讨五味子提取物对脑胶质瘤神经球细胞生长的作用,并初步探讨其可能的机制.方法:培养脑胶质瘤SHG-44细胞,将其置入干细胞培养液[神经培养基加入B27添加物、表皮生长因子(EGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)]中进行培养,3代以后用于实验.将脑胶质瘤SHG-44细胞分为对照组,50、100和200 mg·L-1五味子提取物组,MTT法检测各组神经球细胞的增殖抑制率,酶联免疫吸附实验检测五味子提取物作用后神经球培养上清中Bcl-2、Bax和caspase-3蛋白表达水平.结果:MTT法检测,与对照组比较,50、100和200 mg·L-1五味子提取物组SHG-44神经球细胞24、48和72 h时增殖抑制率均升高(P＜0.01);酶联免疫吸附实验,不同浓度五味子提取物作用神经球48 h后,培养上清中Bcl-2和Bax蛋白表达水平均下降,以Bcl-2蛋白表达水平下降更为明显,与对照组比较,100和200 mg·L-1五味子提取物组Bcl-2蛋白表达水平明显下降(P＜0.05或P＜0.01);与对照组比较,不同浓度五味子提取物组Bax/Bcl-2值均升高(P＜0.05或P＜0.01),50 mg·L-1五味子提取物组培养上清中caspase-3蛋白水平较对照组明显升高(P＜0.01).结论:五味子提取物可能是通过上调Bax/Bcl-2值后促凋亡因素占优势,使神经球细胞凋亡而抑制胶质瘤神经球细胞的生长.
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胶原凝胶三维支架对神经干细胞增殖和分化的影响
目的:观察胶原凝胶三维支架对大鼠胚胎神经干细胞增殖和分化的影响.方法:将大鼠胚胎神经干细胞接种于胶原凝胶三维支架中,通过倒置显微镜观察胶原凝胶中神经干细胞生长和增殖的情况.以悬浮培养作为对照组,采用免疫荧光鉴定胶原凝胶中神经于细胞标志物,并检测神经干细胞分化成不同神经细胞的比例.以CCK-8方法检测不同胶原凝胶浓度对神经干细胞活力的影响.结果:胶原凝胶三维支架中的神经干细胞可以增殖并形成神经球,这些神经球表达神经干细胞标志物,并且可以分化形成神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞.与悬浮培养的神经球相比,三维培养中形成的神经球其分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的比例无差异.CCK-8检测表明胶原浓度为0.5mg/ml时适合神经干细胞生长.结论:本实验表明浓度为0.5 mg/ml的胶原凝胶三维支架适合神经干细胞的增殖和分化,三维培养的神经干细胞在脊髓损伤治疗中具有潜在的应用前景.
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神经球石蜡包埋和巢蛋白免疫组化染色
目的应用细胞团石蜡包埋技术,检测神经球内部的神经干细胞标记物巢蛋白(nestin)表达.方法从孕17 d的SD大鼠胚胎大脑海马部位分离,培养神经干细胞,石蜡包埋神经球,通过免疫组化方法检测神经球内部的nestin表达.结果培养中的神经球均显示nestin阳性表达,但阳性细胞比例和细胞团中阳性细胞所处部位有较大差异.结论细胞团石蜡包埋技术检测神经球内部的nestin表达,能全面反映神经球中神经干细胞存在的比例,可作为优化培养技术的实验基础.
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成年小鼠神经干细胞培养、鉴定以及多不饱和脂肪酸含量的测定
目的:探讨成年小鼠大脑室下区神经干细胞(neural stem cells,NSCs)体外分离培养和鉴定的方法,测定体外培养的神经干细胞多不饱和脂肪酸n6/n3的比例和二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid,DHA)含量.方法:取8～10周龄的C57BL/6小鼠室下区细胞,进行体外悬浮培养,观察NSCs形成情况,免疫荧光鉴定NSCs干细胞特性及体外分化能力,气相色谱鉴定NSCs的多不饱和脂肪酸含量中n6/n3比例及DHA含量.结果:体外培养的细胞可以增殖,并可以连续传代;免疫荧光显示神经干细胞呈抗巢蛋白阳性,神经干细胞在分化培养基培养时可分化为NeuN、TuJ1、GFAP、O4阳性细胞;神经干细胞的多不饱和脂肪酸含量较鼠尾高.结论:采用无血清培养基成功获得成年小鼠室下区的神经干细胞,具有增殖、自我更新和分化的能力;神经干细胞的n3多不饱和脂肪酸含量明显高于鼠尾中的含量,且DHA多不饱和脂肪酸占较高比例.
