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冻存乳猪肝细胞的胶原凝胶培养研究
目的探索乳猪肝细胞的冻存以及培养条件和方法.方法采用两步法分离乳猪肝细胞,液氮冻存4个月后复苏,与鼠尾胶原液混合后接种培养,或将肝细胞接种于胶原被覆的培养瓶中,然后被覆上第2层胶原培养,观察培养细胞的形态、白蛋白mRNA的表达、尿素合成及天冬氨酸氨基转移酶(AST)的漏出量等.结果冻存肝细胞的活性维持较好,并成功地被固定于混合凝胶或三明治形凝胶中,较好地保持了尿素合成以及白蛋白mRNA表达能力.结论此冻存条件适合于猪肝细胞的长期保存,胶原凝胶可为肝细胞提供更接近体内的培养环境,较好地维持了肝细胞的功能和形态学特征.
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二维和三维培养的人皮肤成纤维细胞中生长因子mRNA表达的比较研究
探讨经二维或三维培养的人皮肤成纤维细胞在细胞因子表达能力方面是否有差异.以平面培养皿作为成纤维细胞二维培养系统,用胶原凝胶作为成纤维细胞三维培养系统,分别提取二维和三维培养的人皮肤成纤维细胞总RNA,采用RT-PCR方法检测两种培养系统中血管内皮细胞生长因子(VEGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)mRNA的表达.结果显示,虽然二维和三维培养的人皮肤成纤维细胞形态不同,但二维和三维培养的成纤维细胞均有VEGF/bFGF设计大小的条带显示,且两者条带相对灰度无明显差异.提示三维培养对人皮肤成纤维细胞的生长因子mRNA表达无明显影响.
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以牛胶原凝胶为支架构建人工真皮的研究
目的:制备成纤维细胞胶原凝胶(即真皮替代物),以研究细胞的生长、分化、增生及与真表皮间的相互作用,为研制大面积创面覆盖物--复合皮奠定基础.方法:①酶消化法培养胎儿成纤维细胞; ②制备细胞胶原凝胶,分为Ca-gel和Cf-gel组,接种后于不同时间观察两组细胞的形态变化和胶原凝胶的收缩情况;③细胞计数;④SEM观测胶原凝胶的表面是否有成纤维细胞附着;⑤HE染色.结果:①成纤维细胞形态及增殖情况:成纤维细胞胶原凝胶形成后呈半透明状,可出现较明显的细胞增殖,并可见凝胶收缩现象,但Ca-gel组较小;人工真皮质地与颜色近似真皮组织,有一定的弹性和抗拉性,不易脆.②细胞计数法所得两组生长曲线基本相似.Ca-gel和Cf-gel组细胞均具有典型的细胞增殖现象,Cf-gel组细胞在后期的增殖略快于Ca-gel组.③扫描显微镜下可见到凝胶表面有梭形的成纤维细胞出现,且成纤维细胞紧密贴附于凝胶上.④HE染色可见胶原呈较均一的淡红色网状分布,成纤维细胞分布于胶原凝胶内部和表面.结论:①培养好的细胞凝胶称之为真皮替代物,是进行皮肤器官型培养和制作复合皮的关键与基础,并可与培养的人工表皮膜片混合移植,起到促进表皮细胞的生长黏附和加速创面愈合的作用.②成纤维细胞在胶原凝胶中有着活跃的生物学特性,因此在研究成纤维细胞在创面愈合中的生物学行为以及在皮肤组织工程学的研究中,以胶原凝胶为支架的三维培养系统较脱细胞基质系统更为科学.
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血管内皮生长因子在鼠尾胶原凝胶诱导三维血管新生中的作用研究
背景:血管新生在组织工程研究中已引起了高度重视.血管内皮生长因子在二维平面培养中已证实能促进血管新生.目的:观察血管内皮生长因子在三维血管新生中的作用.方法:取SD大鼠骨髓,分离出内皮祖细胞.待细胞融合至70%～80%时添加鼠尾另一层胶原凝胶建立三维立体模型.实验组采用完全培养液含M199培养液、胎生血清加血管内皮生长因子及双抗;对照组培养液中不含血管内皮生长因子.培养第1,4,7,20天观察骨髓来源内皮祖细胞的体外培养和扩增情况并进行细胞鉴定.三维立体模型建立后第3,6,9,12天进行形态观察及定性定量分析.结果与结论:实验组内皮祖细胞在三维基质内向胶原基质内生长,24 h内即可出现向胶原内的出芽及浸润并逐渐形成分支样结构,对照组细胞生长慢,出芽慢,管状结构细小,向胶原内浸润的深度浅,网状结构稀疏,不完整.实验组新生血管数目显著高于对照组(P<0.01).取第3,6,9,12天的凝胶块检测,可见内皮素1、内皮型一氧化氮合成酶3表达阳性.结果表明,血管内皮生长因子能动员和诱导内皮祖细胞促进血管新生.鼠尾胶原凝胶可以诱导内皮祖细胞表现出血管新生中的迁移、增殖和发芽等步骤.
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复合壳多糖人工皮肤生物学功能初步研究
目的研制一种新型的胶原凝胶类人工皮肤.方法制备壳多糖-胶原-糖胺聚糖(GAGs)-成纤维细胞真皮替代物(DE),观察成纤维细胞(FB)在凝胶中的生长情况.研究不同含量壳多糖对FB和角质形成细胞(KC)生长的影响,不同含量壳多糖DE的抗感染能力以及DE裸鼠全层皮肤缺失移植试验,组织学研究其重建情况.随后在DE表面接种KC,先浸没培养,再气液界面培养,构建完整的人工皮肤.对DE和人工皮肤行组织学和电镜分析.结果FB在凝胶中2～9d呈指数增生.DE基质配方对FB的生长无抑制作用,但可促进KC的生长,对金黄色葡萄球菌的抑制作用随壳多糖含量增大而增强.DE移植后支持早期真皮重建和血管化.扫描电镜示DE有丰富的微孔结构.结论复合壳多糖人工皮肤是生物相容性好、有一定抗感染能力的新型胶原凝胶类活人工皮肤.
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神经干细胞联合胶原蛋白支架移植脊髓损伤大鼠脑细胞的凋亡
背景：目前的研究表明，从胚胎大鼠大脑皮质分离的神经干细胞在胶原蛋白凝胶中可增殖并分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。
目的：观察神经干细胞联合胶原蛋白支架移植对脊髓损伤后鼠大脑神经细胞凋亡的影响。
方法：取45只SD大鼠制作脊髓半切损伤模型，随机分为3组，造模1周后，细胞移植组大鼠运动皮质后部在脊髓损伤部位注入同种异体神经干细胞悬液，联合组在脊髓损伤部位注入同种异体神经干细胞结合胶原蛋白悬液，模型组不植入任何物质。
结果与结论：移植后1-8周，3组大鼠肢体运动功能均有不同程度恢复，且联合组移植后8周BBB运动评分明显高于其他两组(P <0.05)。移植后1周苏木精-伊红染色显示3组均可见少量凋亡细胞及Bcl-2抗凋亡蛋白阳性细胞，大量Bax阳性细胞；随时间的推移，3组Bax凋亡蛋白阳性细胞、Bcl-2抗凋亡蛋白阳性细胞逐渐减少，并且移植后8周联合组、细胞移植组Bax阳性细胞明显低于模型组(P<0.05)，Bcl-2抗凋亡蛋白阳性细胞高于模型组(P<0.05)，此时3组均无凋亡细胞。表明神经干细胞联合胶原蛋白支架移植可抑制脊髓损伤后鼠大脑神经细胞的凋亡，促进脊髓神经功能的恢复。 -
成纤维细胞／胶原凝胶复合支架促进中耳黏膜上皮细胞的增殖
目的：探讨植入成纤维细胞的胶原凝胶复合支架对中耳黏膜上皮细胞生长和增殖的影响。方法制备大鼠I型胶原凝胶，以7∶1∶1混合胶原、10×DMEM和新生牛血清。以1／9体积比接种成纤维细胞，构建成纤维细胞的胶原凝胶复合支架，冰冻切片观察成纤维细胞在凝胶中的生长形态。复合支架接种中耳黏膜上皮细胞，共聚焦显微镜观察成纤维细胞与上皮细胞的生长状态，酶消化计数上皮细胞在接种的不同时间点，细胞数量的变化。结果接种后3d成纤维细胞数量逐渐增加，细胞的突起在两极逐渐伸展延长。冰冻切片结果显示，成纤维细胞均匀地分布于凝胶中，细胞两极为两个较长的突起。接种于成纤维细胞／胶原凝胶复合支架上皮细胞增殖速度明显高于接种于单纯胶原凝胶组，比较上皮细胞在复合支架接种后3 d，6 h的细胞数量明显多于同时间点的胶原凝胶组（P＜0．05，P＜0．01）。共聚焦显微镜观察发现，上皮细胞在单纯胶原凝胶中，集聚生长形成岛型分布，在成纤维细胞／胶原复合支架上，与成纤维细胞交互分布，且细胞密度大于前者。结论植入成纤维细胞的胶原凝胶复合支架对上皮细胞增殖有明显的促进作用。
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Netrin-1诱导促性腺素释放激素神经元迁移的研究
目的:建立神经导向研究的模型,并鉴定netrin-1的神经导向功能.方法:用促性腺素释放激素(Gonadotropin-releasing hormone,GnRH)神经细胞为研究模型,建立双细胞团培养方法,用netrin-1诱导CmRH神经元亚克隆系NLT,观察细胞生长的诱导情况.结果:NLT细胞团在体外培养条件下,具有自发放射状迁移能力.在netrin-1诱导作用下,NLT细胞朝向netrin-1浓度梯度的方向生长,在靠近netrin-1细胞团的部位,netrin-1浓度梯度高,迁移出的细胞数目较多,约占总数目的68%,并且细胞迁移的平均距离较长为107.31μm;而在远离netrin-1细胞团部位,其netrin-1浓度梯度较低,迁移出的细胞数目相对较少约占32%,细胞迁移的平均距离较短为56.52μm.结论:netrin-1能诱导培养的NLT细胞发生明显的定向迁移,这为进一步深入研究netrin-1在神经系统中的功能和分子机制奠定了基础.
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胶原凝胶三维支架对神经干细胞增殖和分化的影响
目的:观察胶原凝胶三维支架对大鼠胚胎神经干细胞增殖和分化的影响.方法:将大鼠胚胎神经干细胞接种于胶原凝胶三维支架中,通过倒置显微镜观察胶原凝胶中神经干细胞生长和增殖的情况.以悬浮培养作为对照组,采用免疫荧光鉴定胶原凝胶中神经于细胞标志物,并检测神经干细胞分化成不同神经细胞的比例.以CCK-8方法检测不同胶原凝胶浓度对神经干细胞活力的影响.结果:胶原凝胶三维支架中的神经干细胞可以增殖并形成神经球,这些神经球表达神经干细胞标志物,并且可以分化形成神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞.与悬浮培养的神经球相比,三维培养中形成的神经球其分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的比例无差异.CCK-8检测表明胶原浓度为0.5mg/ml时适合神经干细胞生长.结论:本实验表明浓度为0.5 mg/ml的胶原凝胶三维支架适合神经干细胞的增殖和分化,三维培养的神经干细胞在脊髓损伤治疗中具有潜在的应用前景.
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中空纤维反应器管外腔胶原凝胶混合肝细胞培养
早期的生物人工肝是将培养液混悬肝细胞灌入中空纤维反应器管外腔,一般效果不好.后改将培养液混悬肝细胞或微载体肝细胞灌入中空纤维管内腔或先用胶原液在中空纤维管内腔壁涂层,再将培养液混悬肝细胞灌入中空纤维管内腔;使患者血(血浆)流过管外腔,通过中空纤维膜上的微孔,管内腔和管外腔发生物质交换,使血中的毒物被肝细胞解毒[1-2].近年来Excorp Medical公司推出将胶原凝胶混合肝细胞灌注中空纤维管外腔的生物人工肝反应器,效果尚待验证[3].本研究将胶原凝胶混合肝细胞灌注中空纤维反应器管外腔培养(凝胶混合法),与将培养液混悬肝细胞灌注腔壁涂有胶原层的中空纤维管外腔培养(单层凝胶法)对照,验证肝细胞功能.
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胶原凝胶固定培养大鼠肝细胞的功能与形态观察
目的探索混合胶原凝胶培养肝细胞的方法,观察培养鼠肝细胞的功能与形态特征.方法两步法分离大鼠肝细胞,与I型鼠尾胶原溶液混合接种于培养瓶,待胶原液形成凝胶后,加培养液常规培养,观察培养鼠肝细胞的形态学特征和尿素合成及酶漏出量.结果成功将大鼠肝细胞混合固定于胶原中,形成凝胶状进行培养.培养期间,始终能检测出鼠肝细胞合成分泌的尿素,而肝细胞乳酸脱氢酶漏出量较少,倒置相差显微镜下观察到典型的形态特征.结论混合胶原凝胶培养方法能为肝细胞提供更接近体内的培养环境,可能适用于生物人工肝研究.
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B 型超声引导下肝包膜下骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠肝损伤
目的探讨在 B 型超声引导下经皮向肝包膜下注射移植骨髓间充质干细胞（MSC）对大鼠肝损伤的治疗作用。方法四氯化碳（CCl4）皮下注射建立肝损伤大鼠模型。首次移植：手术开腹，在肝损伤大鼠肝包膜下注入1 mL 含MSC 胶原培养液（MSC 移植组）；在肝损伤大鼠和正常大鼠肝包膜下分别注入1 mL 不含 MSC 胶原培养液（分别为肝损伤对照组和正常对照组）。各组注入物均可在肝包膜下形成胶原凝胶。第2次和第3次移植：分别在首次移植后第3周和第4周在 B 超引导下经皮向上一次移植留在肝包膜下形成的凝胶囊腔内注射含 MSC 培养液（MSC 移植组）或不含 MSC 培养液（肝损伤对照组和正常对照组）。在第3次移植后1周，检测各组大鼠 Alb、ALT、TBil；称大鼠体重和肝重，计算肝指数。结果MSC 移植组血浆 Alb 水平（32．5±6．7）g/L 明显高于肝损伤对照组（24．5±7．4）g/L（P ＜0．05）；而 ALT（97．7±19．6）U/L、TBil（6．5±1．4）μmol/L 和肝指数（4．4±0．5）均明显低于肝损伤对照组的（321．8±27．4）U/L、（38．2±14．3）μmol/L 和（5．5±0．7）（均 P ＜0．05）。结论将胶原溶液注入大鼠肝包膜下可形成胶原凝胶囊腔；可在 B 型超声引导下多次经皮将 MSC 注入肝包膜下凝胶囊腔（移植到肝实质表面）；5周内3次移植 MSC 到肝包膜下可使肝损伤大鼠的肝功能得到明显改善。
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E-Cadherin和CD44v6对Tca8113细胞系侵袭性影响的实验研究
目的通过检测粘附分子在立体胶原凝胶培养系统中对口腔黏膜鳞状细胞癌(SCC)细胞侵袭性的影响,加深了解口腔癌细胞侵袭和转移的可能机制,并评估其作为口腔癌预后判断指标的可行性.方法应用免疫组织化学方法检测粘附分子E-cadherin(E-cad)和CD44v6在舌鳞癌细胞系TcRa8113细胞的表达;同时在体外建立鼠尾胶原凝胶三维立体侵袭系统,在此系统中观察粘附分子对Tca8113细胞侵袭胶原能力的影响.结果免疫组织化学检测显示,E-cad在Tca8113细胞有阳性表达,而CD44v6表达阴性;胶原凝胶侵袭实验表明:E-cad可以有效地减少Tca8113细胞在胶原凝胶中的浸润细胞数和程度(0.0＜P＜0.05).结论虽然粘附分子只是影响肿瘤侵袭和转移的重要因素之一,但体外实验表明:E-cad具有抑制肿瘤细胞胶原侵袭的作用,提示E-cad有可能成为一种较好的临床评判口腔黏膜鳞癌预后的有用指标.
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脑源性神经营养因子缓释胶原凝胶支架对神经干细胞生长和分化的影响
目的观察脑源性神经营养因子( BDNF )缓释胶原凝胶支架对神经干细胞生长和分化的影响。方法将BD-NF与胶原凝胶溶液混合,制备成 BDNF 缓释支架,采用ELISA法检测缓释支架中BDNF的释放曲线,然后将大鼠胚胎神经干细胞接种于缓释支架中作为实验组,并观察神经干细胞在缓释支架中的生长情况。以常规添加BDNF并悬浮培养的神经干细胞作为对照组,采用免疫荧光方法鉴定缓释支架中神经干细胞分化成不同神经细胞的比例,并用细胞活力检测试剂盒( CCK-8)检测不同培养组中神经干细胞的活力。结果ELISA结果显示缓释支架可以持续释放BDNF达到10 d,体外实验显示该缓释支架与神经干细胞有较好的生物相容性,CCK-8检测显示缓释支架中神经干细胞活力优于对照组(P<0.05),免疫荧光证实缓释支架中神经干细胞分化成神经元的比例要高于对照组( P<0.05)。结论BD-NF缓释胶原凝胶支架具有良好的生物相容性,可以促进神经干细胞生存并诱导其分化成神经元。
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转谷氨酰胺酶交联胶原凝胶构建三维角膜基质
目的 检测转谷氨酰胺酶交联胶原凝胶对三维培养的角膜基质细胞的影响,探讨可提高机械性能的组织工程角膜基质层新途径.方法 胶原酶消化法获取原代兔角膜基质细胞,以加入转谷氨酰胺酶与胶原凝胶交联为实验组,不加酶交联为对照组.倒置显微镜下每日观察细胞生长情况、Alamar-Blue试剂检测细胞增生、免疫荧光法检测凝胶内细胞波形蛋白、检测透光度、酶消化法检测胶原凝胶抗消化能力.结果 实验组细胞胶原凝胶内附着和生长优于对照组,细胞在凝胶内呈树枝状生长.2组细胞均随培养时间延长明显增生(P=0.000).共焦显微镜下见2组细胞胞浆波形蛋白均阳性表达,实验组细胞伪足更丰富.实验组透光度稍差于对照组.实验组抵抗胶原酶消化的能力显著增强.结论 酶交联的胶原凝胶对角膜基质细胞无毒性作用,重构的基质层结构更加稳定,有利于组织工程角膜基质层的构建.
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阻断抗体对人视网膜胶质细胞黏附于胶原凝胶的作用分析
研究证实视网膜胶质细胞存在于特发性黄斑裂孔眼视网膜前膜上.人视网膜胶质细胞能收缩的特性亦已被证明,且该特性被认为是引起特发性黄斑裂孔的病理机制.
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骨髓基质干细胞/胶原凝胶复合物原位构建工程化肝组织
目的 探讨大鼠骨髓基质干细胞(BMSCs)与胶原凝胶材料复合后原位植入肝内的组织再生潜能.方法 将来源于雄性SD大鼠的BMSCs与液态鼠尾胶原复合后,原位植入雌性大鼠肝组织挖除部位,分别于植入后1、2周取材.采用苏木素-伊红(HE)染色对植入部位组织学特征进行观察,并采用免疫组化染色和FISH方法分别对白蛋白、CK19及SRY基因进行检测.结果 BMSCs与胶原凝胶复合后,细胞均匀的分布在整个BMSCs/胶原复合物中.体内植入后1周,观察到植入细胞分化出圆形、多角形等细胞形态.植入后两周,组织学显示植入部位形成肝细胞样的细胞集落,免疫组化染色显示这些细胞抗白蛋白抗体染色(Alb)阳性.此外,植入部位还形成由上皮样细胞围成的管状结构,抗CK19抗体染色提示这些上皮样细胞为胆管上皮细胞.原位杂交证实植入部位细胞主要来自植入的雄性大鼠的骨髓基质干细胞.结论 BMSCs与胶原复合后原位植入肝内可形成类肝样组织.该方法经进一步研究有望用于肝脏病损的修复治疗.
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兔髁状突软骨细胞的体外培养及其鉴定研究
随着生物工程技术的发展,使生物工程软骨移植软骨细胞成功应用于动物试验,如1996年,曹宜林等[1]用PGA与PLA共聚物在体外预制成人耳形状,移植软骨(chondrocyte)埋植入裸鼠皮下,成功的再造了具有人耳廓形态的软骨.Shigeyuki w等[2]在胶原凝胶上种植软骨细胞,用于修复大面积关节缺损.软骨组织工程广阔的应用前景,越来越引起人们的研究兴趣,但作为种子细胞之一的软骨细胞因其自身的哪生物学特性,仍不能使该技术应用于临床.如何进行体外培养条件的改进,以延长软骨细胞的生物学功能,仍在探索中.我们通过对兔髁状突软骨细胞体外培养,观察其生物学特性,并对其进行软骨细胞的特异性鉴定,探索软骨细胞能否在体外进行大量增殖,并为软骨组织工程提供充足的种子细胞.
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胶原蛋白在医学中的应用研究现状
脱钩原是脊椎动物的主要结构蛋白,也是细胞外基质的主要成分之一.由于其无毒、无致畸、无致突变性能,生物相容性好,在体内可以降解成无毒天然产物,故一直是医学界关注和研究的焦点.目前胶原蛋白按剂型可分为胶原海绵、胶原膜、胶原凝胶、胶原微粒等.因各自特殊的机械、化学和生物学特性,应用也不尽相同.本文就胶原剂型及其在医学中的应用做一阐述.
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鼠尾肌腱胶原蛋白的提取及凝胶的制备
为了探索鼠尾肌腱胶原蛋白在实验医学中的应用,用简单的方法溶解新鲜大白鼠鼠尾肌腱,从中提取较纯的胶原蛋白,制成胶原凝胶.将提取的胶原蛋白液进行定性、定量鉴定.结果:提取液主要为Ⅰ型胶原蛋白;72小时37℃恒温培养箱内培养无细菌生长;紫外分光光度计测定,吸收高峰为230nm;氨基酸成分主要为甘氨酸:占40%,脯氨酸:14.3%.显微镜下见:相互交织的胶原原纤维结构组成的网状结构;纤维均匀,有规则横纹.胶原蛋白液在37℃恒温下,可制成凝胶,用于培养细胞;用磷酸液冲洗胶原蛋白凝胶可成固体片状,制成胶原膜,用作医用材料.
