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人源化SCID-beige鼠模型的建立及口腔鳞癌荷瘤模型建立
目的:建立人源化SCID-beige小鼠模型,并将其应用于口腔鳞癌移植瘤模型的建立.方法:采用人外周血淋巴细胞腹腔注射的方法建立人源化SCID-beige鼠模型,评估其体内人源化免疫球蛋白水平,并采用常用的人舌癌细胞系建立荷瘤模型.结果:1、人源化SCID-beige鼠模型具有高水平的人源IgG;2、常用的人舌癌细胞系TCA8113、SCC9及SCC25均可成功建立荷瘤模型.结论:SCID-beige鼠可以用于人源化小鼠模型的建立,可以用于口腔鳞癌的相关免疫研究.
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丹皮酚对人舌癌Tca8113细胞增殖的影响
目的：探讨丹皮酚（paeonol）对人舌癌TCA8113细胞生物学行为的影响。方法用MTT法检测不同浓度的丹皮酚对TCA8113细胞增殖的抑制的作用；用ELISA实验检测细胞血管内皮生长因子（VEGF）蛋白的表达水平。结果MTT实验表明丹皮酚对TCA8113细胞的增殖有抑制作用，并随浓度增加抑制作用增强；ELISA实验提示丹皮酚抑制TCA8113细胞分泌VEGF蛋白。结论丹皮酚可以抑制TCA8113细胞增殖，抑制VEGF蛋白的分泌。
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Rac1基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定
背景:Rac1是通过信号转导来调节癌细胞的侵袭、增殖,它在各种肿瘤中都有表达.目的:构建RAC1基因RNA干扰慢病毒载体,并检测其干扰效率.方法:应用Western blot检测Rac1基因在舌癌细胞中的表达.针对筛选确定的Rac1基因RNAi有效靶序列,合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经AgeI和EcoRI双酶切后的pMagic4.1载体连接产生短发卡RNA慢病毒载体,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定后将质粒分别和包装质粒混合物共转染293T细胞,采用Real-Time PCR筛靶,将筛靶成功的质粒进行慢病毒包装,再感染Tca8113细胞.荧光定量PCR和Western blot检测鉴定Rac1基因表达的干扰效果以确定其生物活性.结果与结论:成功构建了RAC1干扰载体,Western blot检测显著抑制Rac1蛋白表达,经Real-time PCR检测pLVT447的抑制率达70%.成功的构建了Rac1基因RNAi慢病毒载体,为RNAi用于靶向Rac1的基因治疗舌癌(Tca8113)提供了有效的siRNA靶序列.
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不同体外环境下舌癌干细胞标志CD44及ESA和CXCR4的表达
背景:细胞生存的微环境与蛋白的表达密切相关,在不同的环境中癌干细胞标志的表达可能存在差异.目的:探讨癌干细胞标志CD44、ESA、CXCR4的表达是否会在不同的细胞生存环境中发生改变.方法:选取舌癌TCA8113细胞系,分别建立干细胞培养基、常规标准培养基以及在标准培养基中添加阿霉素的3种体外培养微环境,采用免疫组化及流式细胞术,检测不同培养环境中3种标志在舌癌细胞中的表达.结果与结论:免疫组化法检测显示,在所有培养环境中CD44、ESA强阳性表达,CXCR4在干细胞培养基环境中弱阳性表达,其余为阳性表达;流式细胞术检测CD44与ESA在所有培养环境中均高水平表达;与常规标准培养基环境比较,在干细胞培养基的微环境中CXCR4极低水平表达,将舌癌细胞从干细胞培养基转回常规标准培养基后,CXCR4的表达回升;在阿霉素干预的培养环境中,CXCR4表达水平升高.结果表明舌癌干细胞标志在不同体外微环境下的表达存在差异,需结合体内环境与肿瘤组织的表达情况来寻找癌干细胞标志.并且不同微环境模式可能富集不同性质的癌干细胞.
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EGCG抑制口腔鳞癌Tca8113细胞增殖和诱导凋亡的研究
目的:研究绿茶提取物表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)对人口腔鳞癌Tca8113 细胞生长抑制及促凋亡的作用.方法:应用MTT法检测不同浓度的EGCG对Tca8113细胞体外增值抑制作用;采用HE染色、Hochest33258染色法检测EGCG对Tca8113细胞凋亡的影响.结果:MTT法检测显示EGCG对Tca8113细胞有明显增殖抑制作用并呈现时间及浓度依赖性(P＜0.05); HE、Hochest33258染色显示,EGCG处理Tca8113细胞中出现了典型的凋亡形态学改变如核碎裂、核浓缩.结论:EGCG对Tca8113细胞的生长具有显著的抑制及促凋亡作用,且呈现时间及浓度的依赖性.
关键词： 表没食子儿茶素没食子酸酯 TCA8113 细胞凋亡 -
NF-kB信号通路在紫草素诱导Tca8113细胞凋亡中的作用机制
目的:探讨NF-kB信号转导通路在紫草素诱导Tca-8113细胞凋亡中的作用.方法:采用蛋白印迹法检测IkBa,磷酸化-IKBa、bcl-2及Bax蛋白的表达,采用EMSA方法检测NF-KB的DNA结合活性,采用酶联免疫吸附方法(ELISA)分析Caspase 3、8、9的活性.采用SPSS12.0软件包对数据进行单因素方差分析及t检验.结果:经过紫草素作用的癌细胞,磷酸化-IkBa蛋白及NF-kB的DNA结合活性均明显降低,Bcl-2蛋白表达显著减少.Caspase 3、8、9在紫草素诱导的细胞凋亡过程中被激活.泛Caspase阻断剂Z-Asp-CH2-DCB可以明显抑制紫草素引起的细胞凋亡(P=0.021.结论:紫草素诱导口腔鳞癌细胞的凋亡作用,至少部分通过抑制NF-kB信号通路活性,继而调节其下游调亡调控分子,包括bcl-2家族及Caspase家族等来实现.应用紫草素特异性抑制口腔鳞癌中高激活状态的NF-kB通路,可望成为口腔鳞癌防治的一条新的有效途径.
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MAb225影响Tca8113细胞放射敏感性的机制探讨
目的:探讨表皮生长因子受体单抗调控Tca8113细胞放射敏感性的作用机制.方法:以不同浓度的MAb225处理Tca8113细胞,采用流式细胞术和双荧光染色分析法,观察细胞放射后凋亡的变化;以碱性单细胞凝胶电泳法检测细胞在放射后DNA损伤修复的变化,应用流式细胞法分析细胞周期的变化,分光光度法检测细胞内GSH水平的变化.结果:应用0.5μg/ml MAb225或6Gy放射处理Tca8113细胞,可使细胞的凋亡提高1倍左右,而联合应用可使凋亡比例上升至5～6倍(F检验);MAb225处理的细胞放射后DNA损伤的修复慢于未处理组,两者的慧尾长度在放射后的30min内均有显著性差异(t检验,P＜0.05);流式细胞分析显示,G1期细胞比例上升而S期细胞比例下降;MAb225处理的细胞,其GSH水平明显低于未处理的细胞,两者间有显著性差异(t检验,P＜0.05).结论:MAb225影响细胞放射敏感性的机制与MAb225诱导放射后凋亡、抑制DNA修复、改变细胞周期再分配和影响GSH水平有关.
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吉西他滨对舌鳞癌细胞增殖和端粒酶活性的影响
目的:了解吉西他滨对舌鳞癌Tca 8113细胞增殖及端粒酶活性的影响.方法:采用噻唑蓝(MTT)和碘化丙锭(PI)染色法,检测细胞增殖抑制率和细胞周期变化;采用TRAP PCR ELISA法检测细胞端粒酶活性,PAGE-银染法显示端粒酶电泳图像.数据采用SPSS10.0中独立样本t检验法或单因素方差分析法进行统计学检验.结果:吉西他滨能够显著抑制Tca 8113细胞增殖,并具有时间和浓度依赖性,5.0μg/m1组72h增殖抑制率均值为72.2%,高于0μg/ml组(F=161.854,P＜0.05).细胞周期检测显示:吉西他滨作用72h后,S期细胞比例下降,5.0μg/ml组均值为18.1%,低于0μg/ml组38.5%(t=5.801,P＜0.05).TRAP PCR ELISA法检测细胞端粒酶活性(A值)随吉西他滨作用浓度增加和时间延长而下降:72h,0和5.0μg/ml组A值分别为1.32±0.12、0.28±0.02(F=811.208,P＜0.05).结论:吉西他滨能够有效抑制Tca8113细胞增殖,可以降低细胞端粒酶活性.
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舌鳞癌细胞系Tca8113 Fas表达水平与凋亡的关系
目的研究舌鳞癌Tca8113细胞Fas表达水平与细胞凋亡的关系,了解细胞凋亡的相关机制.方法采用脂质体法将含Fas基因片段的真核表达重组质粒pBK-Fas导入舌鳞癌Tca8113细胞,检测转染前后Fas mRNA表达水平、Fas蛋白阳性表达率和阳性表达强度.以及细胞凋亡指数,分析细胞凋亡的相关因素.结果 Fas转染不提高舌鳞癌Tca8113细胞Fas蛋白阳性表达率(P＞0.05),但能提高Fas mRNA表达水平、Fas蛋白表达强度,以及细胞凋亡指数.各项指标分别由转染前的0.201±0.015,31.02±4.63,0.88%±0.16%上升到0.399±0.073,54.32±6.38和10.21%±1.46%,统计分析均有显著性差异(P＜0.01).结论 Fas介导Tca8113凋亡与Fas蛋白阳性率可能无关,而与Fas蛋白阳性强度有关.Fas蛋白激活细胞凋亡可能存在阈值.只有Fas表达达到一定强度,细胞凋亡才被激活.
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P75神经营养因子受体在口腔鳞状细胞癌中的表达及意义
目的:研究口腔鳞状细胞癌中p75神经营养因子受体(p75NTR)的表达,探讨p75NTR作为预测口腔鳞状细胞癌预后指标及将其作为肿瘤干细胞标志物的可能性.方法:采用SP免疫化学方法,对舌鳞状细胞癌细胞系Tca8113及43例手术切除口腔鳞状细胞癌标本进行p75NTR表达的检测,另外选取5例癌旁组织及8例正常组织作为对照.应用SPSS16.0软件包,采用行×列表资料的x2检验进行统计学分析.结果:p5NTR在Tca8113细胞膜中阳性表达.43例口腔鳞状细胞癌组织中,p75NTR阳性表达33例,在癌旁组织及正常对照组中没有表达.p75NTR均定位于细胞膜上,于癌巢中分散分布,且常有聚集性分布趋势.p75NTR表达与临床分期(P<0.05)及有无淋巴结转移(P<0.05)相关.结论:p75NTR的表达可以作为预测口腔鳞状细胞癌预后的指标,但还不能将其单独作为肿瘤干细胞的标志物,其在肿瘤发生、发展中的作用及机制仍需进一步研究.
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E-Cadherin和CD44v6对Tca8113细胞系侵袭性影响的实验研究
目的通过检测粘附分子在立体胶原凝胶培养系统中对口腔黏膜鳞状细胞癌(SCC)细胞侵袭性的影响,加深了解口腔癌细胞侵袭和转移的可能机制,并评估其作为口腔癌预后判断指标的可行性.方法应用免疫组织化学方法检测粘附分子E-cadherin(E-cad)和CD44v6在舌鳞癌细胞系TcRa8113细胞的表达;同时在体外建立鼠尾胶原凝胶三维立体侵袭系统,在此系统中观察粘附分子对Tca8113细胞侵袭胶原能力的影响.结果免疫组织化学检测显示,E-cad在Tca8113细胞有阳性表达,而CD44v6表达阴性;胶原凝胶侵袭实验表明:E-cad可以有效地减少Tca8113细胞在胶原凝胶中的浸润细胞数和程度(0.0＜P＜0.05).结论虽然粘附分子只是影响肿瘤侵袭和转移的重要因素之一,但体外实验表明:E-cad具有抑制肿瘤细胞胶原侵袭的作用,提示E-cad有可能成为一种较好的临床评判口腔黏膜鳞癌预后的有用指标.
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Semaphorin 3A及其受体Neuropilin-1在舌癌组织及Tca8113中的表达
目的:观察Semaphorin 3A(SEMA3A)及其受体Neuropifin-1(Nrp-1)在舌癌组织及舌癌细胞系Tca8113中的表达.探讨其对舌癌中血管生成的意义.方法:应用免疫组织化学方法检测舌癌组织和癌旁组织中SEMA3A及Nrp-1的表达,应用免疫细胞化学检测SEMA3A及Nrp-1在Tca8113中的表达.并用Western印迹检测舌癌组织、癌旁组织及舌癌细胞系Tca8113中SEMA3A及其受体Nrp-1的表达情况.采用SPSS11.0软件包对数据进行X2检验.结果:免疫组织化学显示.17/20例舌癌组织SEMA3A呈阴性表达,18例Nrp-1呈阳性表达.19/20例癌旁组织中SEMA3A阳性表达,而Nrp-1均呈阴性表达.免疫细胞化学显示,SEMA3A在舌癌细胞中检测不到,而Nrp-1均呈阳性表达.Western印迹检测与此结果完全相符.SEMA3A及Nrp-1在舌癌及癌旁组织中的表达有显著差异(P<0.001).结论:SEMA3A及其受体Nrp-1在舌癌组织及细胞系中表达异常,提示其可能与肿瘤血管生成相关.
关键词： 舌癌 semaphorin 3A Neuropilin-1 TCA8113 -
人共刺激分子4-1BBL表达载体的构建及转染Tca8113细胞的研究
目的:克隆人肿瘤坏死因子配体超家族(tumor necrosis factor superfamily,TNFSF)成员4-1BBL基因,构建其真核表达载体,并检测4-1BBL基凶在Tea8113中的表达.方法:从淋巴细胞中提取RNA.用RT-PCR方法将4-1BBL的编码序列cDNA扩增.然后将该基因的编码序列插入真核荧光蛋白载体pEGFP-Cl质粒中.构建成终的表达载体pEGFP-Cl-4-1BBL.运用脂质体方法将pEGFP-Cl-4-1BBL转染Tea8113细胞.转染24h后,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达,RT-PCR和免疫印迹检测4-1BBL在该细胞中的表达.经G418筛选后.用有限稀释法建立稳定高表达的带有4-1BBL基因的Tca8113细胞系.结果:从淋巴细胞中提取的RNA经RT-PCR扩增出目的基因4-1BBL,其全长大小为768bp.测序鉴定该序列与GenBank中的序列丰廿同.转染pEGFP-Cl-4-1BBL载体的靶细胞Tca8113中,荧光显微镜下可见其表达绿色荧光蛋白,RT-PCR方法检测到目的基因4-1BBL的768bp大小的cDNA扩增产物.裂解的4-1BBL/Tea8113基因转染细胞膜蛋白中相对分子质量约27.5Kd的特异性条带.结论:转染4-1BBL基因细胞株的建立,为该基因功能的后续研究和单克隆抗体的研制奠定了基础.
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聚乙二醇-聚谷氨酸纳米微球介导双自杀基因对Tca8113细胞的杀伤作用
目的:观察聚乙二醇-聚谷氨酸(PEG-PBLG)纳米微球介导双融合自杀基因CDglyTK对舌鳞癌Tca8113细胞的杀伤作用,为口腔鳞癌的治疗探索新的途径和方法.方法:以PEG-PBLG纳米微球为载体介导携双自杀基因CDglyTK的真核表达质粒pcDNA3.1(+)-CDglyTK转染Tca8113细胞,通过RT-PCR检测CDglyTK的mRNA表达,MTT法描绘细胞生长曲线,流式细胞仪检测细胞凋亡并评价其疗效.统计分析采用SPSS10.0统计软件包完成,两样本均数的比较采用t检验.结果:PEG-PBLG纳米微球可介导质粒pcDNA3.1(+)-CDglyTK转染Tca8113细胞,RT-PCR可检测到转染细胞中CDglyTK的mRNA表达.转染后,细胞在滴加5-FC和GCV后生长受到明显抑制,5-FC和GCV联合使用对Tca8113细胞的生长抑制作用明显优于单用5-FC或GCV.5-FC和GCV联合使用组,凋亡指数显著高于对照组(P＜0.01),同时也高于单独使用5-FC或GCV组(P＜0.05).结论:PEG-PBLG纳米载体介导双自杀基因CDglyTK,可有效杀伤舌鳞癌Tca8113细胞,为舌鳞癌的基因治疗提供了新的途径.
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PAMAM-D介导EGFP基因转染人舌鳞癌细胞的实验研究
目的:优化聚酰胺-胺型树枝状高聚物(PAMAM-D)纳米载体介导增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因转染人舌鳞癌Tca8113细胞的条件,以获得佳的转染效率和细胞内表达.方法:采用不同的质粒DNA浓度、PAMAM-D代数、PAMAM-D:DNA质量比以及转染时间等参数,在激光共聚焦显微镜下,观察PAMAM-D介导pEGFP-N1体外转染Tca8113细胞,检测转染效率,并应用单因素方差分析等统计学方法进行比较分析;结合细胞生长和荧光蛋白的表达情况,进一步评估和优化转染条件.结果:1.0μg质粒DNA与2.0μl C5 PAMAM-D形成复合物,转染细胞2 h后,可获得佳的转染效率(42.1%);G5 PAMAM-D转染效率显著高于G2 PAMAM-D(42.1%比19.4%,P＜0.05);PAMAM-D基因转移系统对细胞的生长增殖无显著影响(P＞0.05).结论:PAMAM-D纳米载体在优化的转染条件下,可安全高效地介导目的基因转染Tca8113细胞,是一种较理想的基因转移系统.
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平阳霉素抑制舌鳞癌细胞系的量效和时效关系及可能的抗癌机制
目的:探讨平阳霉素体外抑制口腔鳞癌细胞系的量效和时效关系及可能的抗癌机制.方法:用不同浓度的平阳霉素培养人舌鳞癌细胞系Tca8113不同时间,以MTT法和荧光显微镜观察细胞增殖抑制情况,流式细胞术分析细胞凋亡率.结果:MTT法和荧光观察显示:不同浓度平阳霉素组间细胞生长抑制率有显著差异(P＜0.05),浓度越高,抗增殖效应越明显;随药物作用时间延长,肿瘤细胞生长受抑制递增(P＜0.05).流式细胞术显示:凋亡率随药物浓度增加而增加,但与作用时间长短无关.低浓度药物无法诱导细胞凋亡.结论:平阳霉素在体外能明显抑制人舌鳞癌细胞系Tca8113生长,并具有浓度和时间依赖性.其抗癌机制可能包括细胞毒作用和启动程序化死亡信号等.
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TRPM1在舌癌组织及Tca8113细胞中表达的研究
目的 观察瞬间受体势M亚基1(Transient Receptor Potential Melastatin-1,TRPM1)在舌癌组织及舌癌Tca8113细胞系中的表达情况.方法 选取25例舌癌组织作为实验组,15例正常舌组织作为对照组,应用免疫组化及Western-blot的方法检测TRPM1蛋白在舌癌组织及Tca8113细胞与正常舌组织中的表达;应用RT-PCR方法检测TRPM1 mRNA在舌癌细胞与正常舌组织中的表达.结果 免疫组化实验结果显示,23/25例舌癌组织中TRPM1呈强阳性表达,2/25例呈阴性表达;12/15例正常舌体组织中TRPM1呈阴性表达,3/15例呈弱阳性表达.TRPM1在舌癌与正常舌组织中的表达有显著性差异(P＜0.05);Western-blot实验显示舌癌组织及舌癌细胞系Tca8113细胞中TRPM1蛋白的表达水平高于其在正常舌组织的表达;RT-PCR实验结果也证实TRPM1 mRNA在Tca8113细胞中的表达高于正常舌组织.结论 TRPM1与舌癌的发生可能存在相关性.
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AAVC－Ⅰ对人口腔鳞癌Tca8113细胞GRP78和Caspase－4基因表达的影响
目的：研究不同浓度的AAVC－Ⅰ对人口腔鳞癌Tca8113细胞GRP78、Caspase－4基因表达的影响。方法：设置正常对照组和AAVC－Ⅰ实验组，Trizol试剂提取各组总RNA，运用RT－PCR法扩增内参基因β－actin及目的基因GRP78、Caspase－4片段，ChemiDoc XRS凝胶成像系统观察电泳结果并采用QuantityOne软件测定目的条带灰度值。结果：正常对照组、实验组均扩增出GRP78、Caspase－4目的条带，且随AAVC－Ⅰ浓度增大GRP78、Caspase－4表达增加。结论：高浓度AAVC－Ⅰ可上调GRP78、Caspase－4基因的表达，因此AAVC－Ⅰ可能诱导人口腔鳞癌Tca8113细胞发生了内质网应激。
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奥沙利铂诱导人舌鳞癌细胞株Tca8113凋亡抑制基因survivin表达的研究
目的 探讨铂类抗癌药--奥沙利铂体外对诱导人舌鳞癌细胞株Tca8113凋亡抑制基因survivin表达的影响.方法 应用MTT法检测奥沙利铂不同浓度(32、64、128、256 μmol/L)对Tca8113细胞增殖的影响,并确定半数抑制浓度(IC50);应用免疫细胞化学法观察奥沙利铂作用于Tca8113细胞过程中凋亡抑制基因survivin表达的变化.结果 一定浓度的奥沙利铂作用于Tca8113细胞24、48及72小时,可见survivin表达有不同程度增强.结论 奥沙利铂体外能诱导人舌鳞癌细胞株Tca8113凋亡抑制基因survivin表达上调,可能是奥沙利铂化疗耐药性的机制之一.
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乏氧对人舌鳞癌Tca8113细胞HIF-1α表达影响的研究
目的 初步研究乏氧对人舌鳞癌Tca8113细胞HIF-1α表达水平的影响.方法 将处于对数生长期的Tca8113细胞置于1%O2、5%CO2、94%N2混合气体的乏氧培养箱内培养,分别在乏氧培养1/2、1、3、6、12和24 h时取出.每个时间段均设常氧培养对照组(5%CO2、95%O2).采用RT-PCR技术检测不同培养条件下细胞HIF-1α mRNA的表达情况.结果 HIF-1α的表达在乏氧12 h明显升高并达高峰,24 h时又下降至常氧水平.每个时间段乏氧组HIF-1α的表达均高于其相应的常氧对照组.结论 乏氧影响了人舌鳞癌Tca8113细胞HIF-1α基因的表达水平,肿瘤细胞通过上调HIF-1α基因的表达适应肿瘤乏氧的微环境,有利于肿瘤的发生与发展.
