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重组人角质细胞生长因子冻干粉针剂中β-巯基乙醇残留量的考察
目的 考察重组人角质细胞生长因子(rh-KGF)冻干粉针剂中β-巯基乙醇的残留量,确定其临床应用安全性.方法 采用气相色谱法,考察β-巯基乙醇对照品的检测限、标准曲线、加样回收率及稳定性,并对不同批号的rh-KGF冻干针剂中β-巯基乙醇残留量进行考察.结果 β-巯基乙醇的检测限为0.235μg/ml,在0～52.08μg/ml浓度范围内,β-巯基乙醇与其浓度有良好线性关系(r=0.9999).加样回收率及稳定性均符合要求;且不同批号的rh-KGF冻干粉针剂中β-巯基乙醇基本无残留.结论 rh-KGF冻干粉针剂安全,无β-巯基乙醇残留,可应用于临床.
关键词： β-巯基乙醇 重组人角质细胞生长因子 气相色谱法 残留量 -
大鼠骨髓基质细胞体外诱导分化为神经细胞的研究
①目的探讨大鼠骨髓基质细胞体外向神经细胞分化的特性.②方法大鼠的骨髓基质细胞传代培养4代后,以成纤维细胞生长因子(bFGF)及β-巯基乙醇预诱导24小时,再以β-巯基乙醇、二甲基亚砜和3-叔丁基4-羟基茴香醚联合进行正式诱导6小时.诱导后的细胞采用免疫组化法进行鉴定.③结果诱导后大鼠骨髓基质细胞神经元特异性烯醇化酶(NSE)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达率分别为84.13%和4.27%.④结论β-巯基乙醇、二甲基亚砜和3-叔丁基4-羟基茴香醚可以促进大鼠骨髓基质细胞向神经元和神经胶质细胞分化.
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黄芩苷体外诱导人脐血间充质干细胞向神经元样细胞的分化
目的:体外诱导脐血间充质干细胞定向分化为神经元包括抗氧化剂法及细胞因子法,如何选择一种既能够如细胞因子般可广泛保护神经,又具有较强抗氧化作用的诱导剂?通过广泛筛选,观察中药单体黄芩苷对人脐血间充质干细胞体外纯化、扩增及向神经元样细胞诱导分化的作用.方法:实验于2005-02/06在南昌大学第一附属医院神经内科实验室完成.①对象及药物:无内外科并发症和传染性疾病、无血液系统疾病、乙肝表面抗原阴性、非高危妊娠、年龄23～35岁的健康孕妇足月顺产儿的脐带血10份,由南昌大学第一附属医院产科提供,孕妇及其家属对治疗及实验均签署知情同意书,实验经医院医学伦理委员会批准.黄芩苷,分子量446,纯度 > 95%,由中南大学湘雅医学院药剂科提供.抗氧化添加剂β-巯基乙醇为SABC公司产品.②实验方法:无菌条件下采集胎儿脐带血,肝素抗凝,用明胶沉降+密度梯度离心两步法分离出脐血单个核细胞,经冷冻保存和复苏后,调整细胞浓度为1×109 L-1,以含20%胎牛血清、谷氨酰胺、B27、粒巨噬细胞集落刺激因子300 μg/L、干细胞因子300 μg/L的DMEM液体培养基进行纯化和扩增.按照抗氧化添加剂的不同分为4组:黄芩苷组加入黄芩苷100 μmol/L;空白对照组不添加抗氧化剂;β-巯基乙醇组添加β-巯基乙醇2 mmol/L;共培养组添加黄芩苷100 μmol/L、β-巯基乙醇2 mmol/L.连续培养4周.③实验评估:观察细胞形态学变化;采用流式细胞仪检测间充质干细胞表面标志;制作细胞爬片,采用免疫细胞化学染色评价神经细胞特异性烯醇化酶、神经微管相关蛋白2、胶质纤维酸性蛋白阳性细胞表达率.结果:①细胞形态学观察:脐血单个核细胞培养第2～3天开始贴壁生长,2周左右达高峰,3周后细胞生长达80%～90%融合,此时脐血原始间充质干细胞呈较均一的长梭形.4周后,黄芩苷组原来呈梭形的胞体一部分发生收缩,细胞边缘出现细的突起;一部分胞体逐渐近似圆形、锥形、三角形,伪足有多个细长突起,且发出分支,形成圆锥状终末端.β-巯基乙醇组、共培养组细胞虽然也有上述类似形态学的改变,但少量细胞存在脱落、死亡现象,且随着培养时间延长呈逐渐增加的趋势.②细胞表型检测:扩增培养4周后,空白对照组以CD45阳性细胞为主;其余3组均以CD29和CD83阳性细胞为主,其中共培养组多,黄芩苷组次之,β-巯基乙醇组少,组间两两比较差异有显著性意义(P < 0.01);各组贴壁生长细胞中均未见CD34+阳性细胞.③细胞扩增培养过程中黄芩苷的预诱导效果:扩增培养4周后与黄芩苷组比较,空白对照组、β-巯基乙醇组神经细胞特异性烯醇化酶及神经微管相关蛋白2阳性细胞表达率均显著降低(P < 0.01),共培养组无明显差异 (P > 0.05).各组胶质纤维酸性蛋白阳性细胞表达率均低于1%.结论:100 μmol/L黄芩苷可促进脐血间充质干细胞体外扩增,且随抗氧化作用时间的延长效果显著增强,同时在一定程度上还能够诱导其向神经元样细胞方向分化.
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优化培养基加快骨髓间充质干细胞的诱导分化
背景：研究发现骨髓间充质干细胞在一定的诱导条件下能分化成神经元、神经胶质等神经细胞，这一定程度上解决了种子细胞来源的难题。目前采用的诱导方法各有不同，所诱导分化的效率也不尽相同。
目的：观察不同抗氧化剂体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经样细胞分化的效果。
方法：将Wistar大鼠骨髓间充质干细胞分为4组，使用不同神经细胞诱导剂诱导分化，分别为未干预组、β-巯基乙醇组、维甲酸组、β-巯基乙醇联合维甲酸组，诱导5 h，12 h，1 d，3 d，5 d，7 d，10 d后，分别观察细胞形态变化及检测神经元细胞特异性抗原神经元特异性烯醇化酶、微管相关蛋白2阳性率表达差异。
结果与结论：未干预组骨髓间充质干细胞形态无明显改变，其他3组细胞逐渐变成纺锤形，并生出多个小突起，互相连接成网，呈现神经元样细胞形态；免疫细胞化学染色显示β-巯基乙醇联合维甲酸组在诱导10 d后其效率高，神经元特异性烯醇化酶、微管相关蛋白2表达阳性率分别是71.63%和79.72%。结果显示β-巯基乙醇联合维甲酸可加快诱导骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化。 -
维生素和β－巯基乙醇对绵羊卵母细胞体外成熟与孤雌发育的影响
本研究探讨了维生素及β－巯基乙醇对绵羊卵母细胞体外成熟和孤雌培养的影响。加入β－巯基乙醇的采卵液，与不加β－巯基乙醇的采卵液对绵羊卵母细胞的体外成熟没有显著差异（P＞0．05），但是成熟率明显提高（64．70％和58．34％），孤雌培养的卵裂率却偏低（81．80％和87．57％）。若在培养液中加入维生素 A、D、E，则绵羊卵母细胞体外成熟率显著提高（P＜0．05），孤雌培养的卵裂率也明显提高（91．80％和83．27％），但没有显著差异（P＞0.05）。
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不同代数的成人骨髓间充质干细胞体外转化为神经细胞的实验研究
目的探讨不同代数的成人骨髓间充质干细胞(hMSCs)体外向神经元细胞转化的效率,为骨髓间充质干细胞应用于临床提供可靠的实验数据.方法采用β-巯基乙醇做为诱导剂,选用第2、4、6、8代hMSCs在体外诱导6h后,用细胞化学及免疫组织化学检测神经元细胞、星形胶质细胞标记蛋白的表达.结果第2、4、6代hMSCs诱导后胞浆中均可见深蓝色的颗粒状尼氏体,第8代hMSCs诱导6h后胞浆中未见明显的深蓝色尼氏体结构.不同代数的hMSCs经诱导6h后均表达NSE、NF-M,不表达GFAP;第2、4、6代的阳性率无显著性差异(P＞0.05),第8代与第2、4、6代的阳性率有显著性差异(P＜0.05).结论β-巯基乙醇在体外可定向诱导hMSCs转化为神经元细胞,第2、4、6代的阳性率明显高于第8代.
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β-巯基乙醇与肝基质对日本血吸虫培养细胞的影响
目的研究β-巯基乙醇与肝基质对日本血吸虫培养细胞的影响.方法将18 d虫龄的日本血吸虫童虫细胞联合法接种于小盖玻片上.实验被随机分为4个组,分别为对照组、β-巯基乙醇组、肝基质组、β-巯基乙醇+肝基质联合处理组.培养第7天,对各组细胞进行核仁组织区相关嗜银蛋白(AgNORs)与乳酸脱氢酶(LDH)细胞化学染色,并结合图像分析比较4个组培养细胞的AgNORs水平及LDH活性.结果与对照组比较,肝基质组、β-巯基乙醇组、β-巯基乙醇+肝基质联合处理组培养细胞的AgNORs颗粒数目、颗粒面积与核面积百分比、平均光密度以及LDH的平均光密度等4个参数均有不同程度升高(P＜0.01).其中,以β-巯基乙醇组培养细胞的4个参数升高显著,β-巯基乙醇+肝基质联合处理组次之,肝基质组升高幅度小.统计学分析显示,除β-巯基乙醇+肝基质联合处理组与β-巯基乙醇组之间的AgNORs及LDH平均光密度两两比较差异无显著意义(P＞0.05),其余组间3个参数两两比较差异均有显著意义(P＜0.01或P＜0.05).结论β-巯基乙醇与肝基质均能促进日本血吸虫培养细胞的增殖、代谢,但β-巯基乙醇的作用比肝基质显著;二者联合使用对培养细胞的增殖无协同作用.
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用于纳米递药系统荧光标记的3种CdTe量子点荧光特性的比较
合成了以L-半胱氨酸(L-Cys)、β-巯基乙醇(β-ME)和巯基乙酸(TGA)修饰的3种CdTe量子点,并比较三者的荧光强度、半峰宽-峰高比、粒径和不同pH值缓冲液中荧光强度的稳定性,分析了三者用于纳米递药系统荧光标记的适宜性.结果表明,L-Cys修饰的量子点荧光强度高,但在pH值小于8.0时会发生急剧淬灭;β-ME修饰的量子点虽然在pH4～8范围内不会发生淬灭,但荧光强度低、荧光峰宽;TGA修饰的量子点具有适宜的荧光强度和峰宽,且在pH4～8范围内不会发生淬灭.因此TGA修饰的CdTe量子点适宜用于纳米递药系统的荧光标记.
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Fura-2/AM荧光法测定日本血吸虫培养细胞内游离钙离子浓度
目的研究用钙荧光探剂(Fura-2/AM)检测静息状态下日本血吸虫培养细胞内的游离钙离子浓度([Ca2+]i),以及β-巯基乙醇对培养细胞[Ca2+]i的影响.方法将18 d虫龄的日本血吸虫童虫制成细胞悬液,贴壁法接种于30 ml培养瓶中,培养液为RPMI-1640含20%小牛血清及常量抗生素.在培养的0-3d,制备日本血吸虫细胞悬液,采用Fura-2/AM钙荧光探剂测定正常静息状态下及加入β-巯基乙醇后日本血吸虫培养细胞内的[Ca2+]i.结果正常静息状态下,培养0 d的日本血吸虫培养细胞内的[Ca2+]i为188.2 nmol/L;培养1-3 d的[Ca2+]i两两比较差异无显著性(P＞0.05),它们的平均值为(187.0±10.7)nmol/L,与培养0d的[Ca2+]i比较,差异也无显著性(P＞0.05).β-巯基乙醇可使日本血吸虫培养细胞内[Ca2+]i明显升高(P＜0.01),并随浓度的增加而升高.结论培养1-3 d,静息状态下日本血吸虫培养细胞内的[Ca2+]i比较稳定,β-巯基乙醇能影响日本血吸虫培养细胞内的[Ca2+]i.
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日本血吸虫培养细胞核仁组织区相关嗜银蛋白的研究
目的通过研究日本血吸虫成虫与童虫培养细胞核仁组织区相关嗜银蛋白(AgNORs)含量及β-巯基乙醇对培养细胞AgNORs的影响,探讨AgNORs能否作为评价日本血吸虫培养细胞增殖的指标以及β-巯基乙醇对培养细胞的促增殖作用.方法联合法培养虫龄分别为18d和24d的日本血吸虫童虫与成虫,将童虫细胞随机分成对照组和实验组,对照组细胞与成虫细胞使用常规培养基培养,实验组在常规培养基中加入50μmol/L β-巯基乙醇和1mmol/L丙酮酸钠.培养第5d,运用胶银法染色,使用HPIAS-2000图像分析系统,计算培养细胞核内AgNORs颗粒数,测定银染颗粒面积与核面积的百分比和平均光密度.结果日本童虫培养细胞(对照组)的AgNORs颗粒数目、颗粒面积与核面积百分比、平均光密度均高于成虫培养细胞.统计学分析显示,两者之间的AgNORs颗粒数目,银染颗粒面积与核面积百分比、平均光密度两两比较均有统计学差异(P＜0.01或P＜0.05);实验组培养细胞与对照组比较,AgNORs颗粒数目明显增多颗粒面积与核面积百分比、平均光密度均显著升高.统计学分析可知,两组细胞三组参数之间均有统计学差异(P＜0.01或P＜0.05).结论 AgNORs可作为评价日本血吸虫培养细胞增殖的一个简便、敏感的指标.日本血吸虫童虫培养细胞较成虫培养细胞更具增殖潜能;β-巯基乙醇对培养细胞具有一定的促增殖作用.
关键词： 日本血吸虫 细胞培养 核仁组织区相关嗜银蛋白 β-巯基乙醇 -
β-巯基乙醇诱导成年鼠骨髓基质细胞向神经细胞分化的研究
目的:探讨β-巯基乙醇诱导成年大鼠骨髓基质细胞成神经细胞的可能性.为神经再生和诱导剂的筛选提供一种新的参考方法.方法:从大鼠骨髓中分离出骨髓基质细胞并培养传至3-5代,诱导前24 h用含1 mmol /l 的β-巯基乙醇及含20%的DMEM培养液培养,再以含5 mmol /l β-巯基乙醇的无血清DMEM培养液作诱导,用免疫细胞化学方法鉴定神经细胞特异性标志物NF、NSE及GFAP的表达. 结果:诱导后1 h,部分细胞发生形态学上的改变,6 h后大部分细胞不仅在形态上表现为神经元样特征,而且NF、NSE等特异性抗体呈阳性表达,而GFAP抗体表达呈阴性.结论:β-巯基乙醇能将骨髓基质细胞诱导成神经元样细胞.
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非必需氨基酸和β-巯基乙醇对神经干细胞增殖的影响
目的：观察非必需氨基酸（NEAA）和β-巯基乙醇对神经干细胞（NSCs）增殖的影响。方法取孕龄为14．5 d的雌鼠，处死后提取NSCs并培养，取5～7代的NSCs用于实验，将NSCs细胞使用传代培养基培养，并分为四组，对照组：加入磷酸盐缓冲液（ PBS）12μL；NEAA组：加入NEAA 10μL，PBS 2μL；β-巯基乙醇组：加入β-巯基乙醇2μL， PBS 10μL；NEAA＋β-巯基乙醇组：加入NEAA 10μL，β-巯基乙醇2μL。通过细胞计数法计算NSCs的增殖速度，噻唑蓝（ MTT）法测定NSCs增殖率，RT-PCR法测定NSCs中凋亡相关基因含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3（Caspase-3）的表达，免疫组化法对NSCs进行鉴定并测定NSCs向神经元和星形胶质细胞的分化潜能。结果与对照组比较，NEAA组NSCs增殖速度、增殖率升高，Caspase-3 mRNA降低（ P＜0．05或＜0．01）；β-巯基乙醇组及NEAA＋β-巯基乙醇组NSCs增殖速度、增殖率升高，Caspase-3 mRNA、TUJ-1阳性细胞百分比、GFAP阳性细胞百分比降低，Nestin升高（P＜0．05或＜0．01）。与NEAA组比较，NEAA＋β-巯基乙醇组各项指标差异均有统计学意义（P＜0．05或＜0．01）；与β-巯基乙醇组比较，NEAA ＋β-巯基乙醇组 NSCs 增殖速度、增殖率升高，Caspase-3 mRNA降低（P＜0．05或＜0．01）。结论 NEAA和β-巯基乙醇均能促进NSCs增殖，联合使用起协同作用。
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β-BME与BDNF联合RA体外诱导成人MSCs分化为神经元样细胞对比观察
目的 寻找体外诱导人骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为神经元样细胞的良好方法.方法 分别采用β-巯基乙醇(BME)、脑源性神经营养因子(BDNF)和维A酸(RA)为诱导剂,体外诱导人MSCs分化为神经元样细胞.用免疫组化SP法对诱导后细胞进行鉴定.结果 两种方法诱导6 h后,MSCs均呈现神经元样细胞改变,伸出突起,类似树突和轴突.该细胞神经元特异性烯醇化酶(NSE)均呈阳性表达,胶质纤维酸性蛋白(GFAP)均呈阴性表达.其中β BME诱导6 h后神经元样细胞分化率为68.32%±2.58%,BDNF+RA诱导6 h后神经元样细胞分化率仅为42.45%±3.26%,两组比较,P＜0.05.但β BME诱导后分化细胞存活时间较短,而BDNF+RA诱导后分化细胞存活时间较长.结论 两种诱导方法均可在体外定向诱导人MSCs转化为神经元样细胞,神经元分化率及存活时间不同.
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成人脂肪基质细胞体外诱导分化为神经前体细胞的数量达峰时间研究
目的 研究成人脂肪基质细胞(ADSC)诱导分化为神经前体细胞数量达峰时间和诱导分化后神经前体细胞的超微结构特征.方法 应用β-巯基乙醇诱导成人ADSC向神经前体细胞和神经元样细胞分化,倒置相差显微镜观察诱导前后细胞形态;免疫荧光细胞化学染色法检测诱导分化后细胞神经巢蛋白(nestin)的表达情况;透射电镜观察诱导分化3h时的神经前体细胞超微结构.结果 体外培养的成人ADSC诱导分化3h时nestin的表达到高峰,为(86.25±4.82)%,透射电镜观察神经前体细胞的超微结构可见细胞表面突起较多,胞质中细胞器丰富,细胞核大,核/浆比例大,双层核膜且有较多核孔,常染色质多,异染色质少.结论 β-巯基乙醇诱导成人ADSC分化3h时神经前体细胞数量达到高峰,且超微结构研究证实此时细胞处于分裂增殖旺盛期.
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成年大鼠骨髓基质细胞体外诱导分化为NSE阳性细胞
目的 研究成年大鼠骨髓基质细胞(MSCs)在体外分化为NSE阳性细胞的方法。方法 采用β－巯基乙醇预诱导MSCs 24h，再诱导5 h。神经细胞特异性烯醇化酶(NSE)免疫细胞化学染色鉴定、计数诱导前后的细胞。结果 诱导后MSCs形态改变，胞体呈锥形，突起交织成网。免疫细胞化学染色NSE表达率达到(63.7±4.5)%。结论 β－巯基乙醇可以诱导成年大鼠MSCs在体外分化成为NSE阳性细胞。
关键词： 骨髓基质细胞 神经细胞特异性烯醇化酶 β-巯基乙醇 大鼠 -
硝酸甘油联合β-巯基乙醇对冠心病患者 外周血内皮祖细胞的影响
目的:观察硝酸甘油对冠心病患者外周血内皮祖细胞(EPCs)体外增殖的影响及其分子机制,并探讨β-巯基乙醇改善硝酸甘油耐药的作用途径.方法:选择冠心病患者75例,分为硝酸甘油应用组和对照组,流式细胞术检测外周血中EPCs的数量,ELISA法检测血浆中血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor-A,VEGF-A)和过氧亚硝基阴离子(ONOO-)的水平;EPCs培养实验中分别用不同浓度硝酸甘油及β-巯基乙醇进行干预,MTT法检测EPCs的活力,ELISA法检测上清液VEGF-A和ONOO-的含量,DCFH-DA探针检测细胞活性氧水平,Western blot检测贴壁细胞Akt、p-Akt、内皮型一氧化氮合酶(eNOS)和p-eNOS的蛋白水平.结果:与对照组相比,高浓度硝酸甘油应用组外周血EPCs显著减少,血清中ONOO-增多,VEGF-A减少.适量浓度硝酸甘油组EPCs的活力提高,上清液VEGF-A水平升高,ONOO-减少,eNOS和Akt磷酸化水平提高;高浓度硝酸甘油组EPCs活力下降,细胞ROS产生过多,上清液中VEGF-A减少,eNOS和Akt的磷酸化水平显著降低;联用β-巯基乙醇后可降低高浓度硝酸甘油组上清液中ONOO-的含量,提高p-Akt和p-eNOS水平,增强EPCs的活力.结论:硝酸甘油可以通过PI3K/Akt/eNOS信号通路影响冠心病患者EPCs的活力,联用β-巯基乙醇可通过改善内皮祖细胞内的氧化应激并激活PI3K/Akt/eNOS信号通路来改善高浓度硝酸甘油引起的耐药.
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骨髓间充质干细胞诱导分化为神经细胞的表型变化
为了研究大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)诱导分化为神经细胞的表型特征,利用贴壁培养法获得骨髓MSCs.化学诱导剂二甲基亚砜(DMSO)和β-巯基乙醇(BME)联合诱导MSCs.免疫组织化学染色检测神经元特异性标志物MAP2、NSE和NF的表达,以及胶质细胞标志物GFAP的表达.硫堇-伊红染色检测细胞内Nissl体.结果表明,DMSO和BME联合诱导MSCs后48h,80%以上的细胞变为神经元样形态,胞体发出数个突起,有的似轴突,突起交织成网.免疫组化结果表明,诱导后细胞表达神经元特异性标志物MAP2、NSE和NF,其诱导率分别为88.6%,87.1%和85.8%.神经干细胞的特征性生物学标记nestin的诱导率在诱导后2 h和10 h较高,分别为48%和71.4%,而在诱导后48 h仅为0.06%.诱导后细胞不表达GFAP.Nissl染色结果表明,诱导后细胞胞质中含有Nissl体.本研究结果证明DMSO和BME联合诱导MSCs可获得具有神经元表型特征的MSCs源性神经细胞.
