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预诱导提高成年动物肝细胞胆红素代谢活性
目的 探讨经苯巴比妥钠(phenobarbital sodium,PBS)体内预诱导的成年动物肝细胞(adult animal hepatocytes,AAH)在体外时能否提高对胆红素的代谢活性,为体外生物人工肝支持系统(extracorporeal bioartificial liver support system,EBLSS)寻求更佳的生物材料.方法 12只成年雄性小白鼠平均体重34g,随机分为预诱导组与对照组各6只,预诱导组每日1次腹腔内注射PBS 45mg/kg,共5次,对照组注射NS,末次给药的24h后取肝脏;从同组的每只实验鼠中各取湿重肝0.5g混合,合并研制为混悬液加入96孔培养板每孔30μl,各孔再加入黄疸血清50μl,后加培养液20μl,使各孔终体积为100μl,每组设6孔,共两组12孔;同时设无肝细胞的黄疸血清孔做两组的对照,共同在37℃、95%湿度、5%CO2培养箱中静置培养3h后离心,取上清用贝克曼生化分析仪检测两组的胆红素变化.结果 与对照血清比较,预诱导组总胆红素、间接胆红素各下降60%、71.42%,直接胆红素无显著变化;对照组总胆红素、间接胆红素各下降34.78%、54.87%,直接胆红素亦无显著变化;两组总胆红素变化比较P＜0.05(t=2.899),间接胆红素变化比较P＞0.05(t=1.571).结论 体内PBS预诱导可增强AAH在体外对胆红素的代谢活性,预诱导的AAH可能是EBLSS更佳的生物材料.
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苯巴比妥钠诱导小鼠后血清与原代肝细胞培养物的生物学分析
目的 探讨经苯巴比妥钠(phenobarbital sodium,PBS)体内预诱导的成年动物肝细胞的生物学特征,研究效应肝细胞在生物人工肝(bioartificial liver,BL)与其他临床应用的潜在价值.方法 12只成年雄性小白鼠随机分为预诱导组与对照组.预诱导组每日1次腹腔内注射PBS 45mg/kg,共7次;对照组注射NS.预诱导结束后两组小鼠做如下分析:检测血清总蛋白(TP)、尿功能素氮(BUN)、胆固醇(CHOL)、高密度脂蛋白胆固醇(HDLC)合成量;分离肝细胞培养48h后取培养液做同上4项生化分析;培养24h的肝细胞做MTT检测细胞增生活性;染色体显示法观察细胞分裂状况,以及肝细胞培养的存活期限和一般形态学观察.结果 实验组血清TP与对照组有显著差异(t=2.678,P<0.5).两组肝细胞培养液中TP、BUN、CHOL、HDLC含量差异无统计学意义.MTT实验两组的培养增生活性无显著差异.培养的生存期限均不超过72h,细胞一般形态未见变化差异.结论 PBS预诱导可明显提高成年鼠血清TP含量和肝细胞的其他生物活性,有利于我们加深对PBS效应肝细胞在生物人工肝与其他临床应用潜能的探讨.
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黄芩苷体外诱导人脐血间充质干细胞向神经元样细胞的分化
目的:体外诱导脐血间充质干细胞定向分化为神经元包括抗氧化剂法及细胞因子法,如何选择一种既能够如细胞因子般可广泛保护神经,又具有较强抗氧化作用的诱导剂?通过广泛筛选,观察中药单体黄芩苷对人脐血间充质干细胞体外纯化、扩增及向神经元样细胞诱导分化的作用.方法:实验于2005-02/06在南昌大学第一附属医院神经内科实验室完成.①对象及药物:无内外科并发症和传染性疾病、无血液系统疾病、乙肝表面抗原阴性、非高危妊娠、年龄23～35岁的健康孕妇足月顺产儿的脐带血10份,由南昌大学第一附属医院产科提供,孕妇及其家属对治疗及实验均签署知情同意书,实验经医院医学伦理委员会批准.黄芩苷,分子量446,纯度 > 95%,由中南大学湘雅医学院药剂科提供.抗氧化添加剂β-巯基乙醇为SABC公司产品.②实验方法:无菌条件下采集胎儿脐带血,肝素抗凝,用明胶沉降+密度梯度离心两步法分离出脐血单个核细胞,经冷冻保存和复苏后,调整细胞浓度为1×109 L-1,以含20%胎牛血清、谷氨酰胺、B27、粒巨噬细胞集落刺激因子300 μg/L、干细胞因子300 μg/L的DMEM液体培养基进行纯化和扩增.按照抗氧化添加剂的不同分为4组:黄芩苷组加入黄芩苷100 μmol/L;空白对照组不添加抗氧化剂;β-巯基乙醇组添加β-巯基乙醇2 mmol/L;共培养组添加黄芩苷100 μmol/L、β-巯基乙醇2 mmol/L.连续培养4周.③实验评估:观察细胞形态学变化;采用流式细胞仪检测间充质干细胞表面标志;制作细胞爬片,采用免疫细胞化学染色评价神经细胞特异性烯醇化酶、神经微管相关蛋白2、胶质纤维酸性蛋白阳性细胞表达率.结果:①细胞形态学观察:脐血单个核细胞培养第2～3天开始贴壁生长,2周左右达高峰,3周后细胞生长达80%～90%融合,此时脐血原始间充质干细胞呈较均一的长梭形.4周后,黄芩苷组原来呈梭形的胞体一部分发生收缩,细胞边缘出现细的突起;一部分胞体逐渐近似圆形、锥形、三角形,伪足有多个细长突起,且发出分支,形成圆锥状终末端.β-巯基乙醇组、共培养组细胞虽然也有上述类似形态学的改变,但少量细胞存在脱落、死亡现象,且随着培养时间延长呈逐渐增加的趋势.②细胞表型检测:扩增培养4周后,空白对照组以CD45阳性细胞为主;其余3组均以CD29和CD83阳性细胞为主,其中共培养组多,黄芩苷组次之,β-巯基乙醇组少,组间两两比较差异有显著性意义(P < 0.01);各组贴壁生长细胞中均未见CD34+阳性细胞.③细胞扩增培养过程中黄芩苷的预诱导效果:扩增培养4周后与黄芩苷组比较,空白对照组、β-巯基乙醇组神经细胞特异性烯醇化酶及神经微管相关蛋白2阳性细胞表达率均显著降低(P < 0.01),共培养组无明显差异 (P > 0.05).各组胶质纤维酸性蛋白阳性细胞表达率均低于1%.结论:100 μmol/L黄芩苷可促进脐血间充质干细胞体外扩增,且随抗氧化作用时间的延长效果显著增强,同时在一定程度上还能够诱导其向神经元样细胞方向分化.
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神经干细胞对胶质瘤细胞趋向性的实验研究
目的 观察神经干细胞在体外培养条件下是否有向胶质瘤细胞趋向的特性.方法 ①从胎小鼠脑组织中分离出神经干细胞,并采用免疫荧光化学法检测神经干细胞标志物神经上皮干细胞蛋白(Nestin)的表达,免疫细胞化学法检测分化后细胞神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达;②用Transwell细胞小室作神经干细胞对胶质瘤细胞趋向性实验.结果 ①从胎鼠脑组织分离的细胞能形成大量悬浮的神经干细胞球,经免疫荧光化学法鉴定,巢蛋白抗体标记阳性,免疫细胞化学法鉴定分化后的神经元、胶质细胞的特异性抗原NSE及GFAP表达阳性;②神经干细胞对胶质瘤细胞趋向实验中,实验组迁移的神经干细胞数明显多于对照组及空白组,三者比较差异有统计学意义(P<0.05).预诱导神经干细胞对胶质瘤细胞趋向实验中实验组迁移的神经干细胞数明显多于对照组及空白组,差异有统计学意义(P<0.05).结论 该研究观察到神经干细胞在体外有向胶质瘤细胞趋向的特性.预诱导状态下神经干细胞有比未诱导神经干细胞更强的向脑胶质瘤细胞趋向的趋势.
