中国组织工程研究杂志
Chinese Journal of Tissue Engineering Research 중국조직공정구여림상강복
- 主管单位： 中华人民共和国卫生部
- 主办单位： 中国康复医学会,《中国组织工程研究与临床康复》杂志社
- 影响因子： 1.38
- 审稿时间： 1-3个月
- 国际刊号： 2095-4344
- 国内刊号： 21-1581/R
- 论文标题 期刊级别 审稿状态
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接受运动处方干预老年人凝血与纤溶系统的变化
目的:以引发血栓性疾病的因素-血液凝血和纤维蛋白溶解系统(简称纤溶系统)为切入点,观察体育运动对老年人血液凝血和纤溶系统的影响.方法:实验于2006-07/2007-05在江西师范大学完成.从普查中随机选择健康不锻炼老年人52名,男27名,女25名,年龄在61-74岁之间,平均年龄(68.7±5.4)岁.受试对象大多数从事教育工作,经健康检测,所有受检老人无慢性肝肾疾病、无糖尿病及高血压、冠心病、无出血及血栓性疾病,男性至少戒烟3年以上或不吸烟.从52名中随机抽取27名为不锻炼组,男14名,女13名;另25名为运动处方组,男性13名,女性12名.运动处方:运动形式为步行快走,运动强度为大心率的60%,每次运动持续时间为40 min,隔日1次,每周三四次,运动周期半年.采用组间比较实验方法,观察与分析运动处方组和不锻炼组血液凝血和纤溶系统指标差异.检测组织型纤溶酶原激活物活性、纤溶酶活性、6-酮-前列环素含量、血栓烷B2含量、α2抗纤溶酶活性和纤维蛋白原含量.结果:52名受试者均进入结果分析.体育锻炼不仅增加了组织型纤溶酶原激活物活性、纤溶酶活性,同时还能降低了α2抗纤溶酶活性、纤维蛋白原含量和血栓烷B2含量;运动对于老年人血液凝血和纤溶系统能力的影响无明显的性别差异.结论:长期体育运动有助于提高老年人纤溶活性,加速纤维蛋白的降解,终能有效地预防血栓的形成.
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单次与两次自体造血干细胞移植治疗血液肿瘤的远期结局比较:150例资料回顾
目的:对没有与供者HLA配型相合的血液恶性肿瘤患者来说,自体造血干细胞移植不失为一种积极有效的治疗方法.评价比较单次与两次自体造血干细胞移植治疗血液肿瘤的效果.方法:①实验对象:选取1988～2001年解放军总医院血液科行自体造血干细胞移植的150例患者,对本实验均知情同意.其中两次自体移植25例(两次骨髓移植3例、两次外周血造血干细胞移植1例、1次骨髓移植+1次外周血造血干细胞移植21例),单次自体移植125例(骨髓移植44例、外周血造血干细胞移植81例);急性非淋巴细胞白血病75例,急性淋巴细胞白血病43例,非霍奇金淋巴瘤22例,霍奇金淋巴瘤10例.②实验方法:应用化疗使白血病患者在移植前达到完全缓解,淋巴瘤患者要求移植前至少骨髓中没有肿瘤累及.动员化疗方案原则上采用对相应肿瘤有效的联合化疗方案,并适当增加剂量.骨髓移植及外周血造血干细胞移植患者回输单核细胞中位数分别为2.68×108/kg,4.20×108/kg.115例患者采用环磷酰胺/全身放疗方案,35例患者采用不含全身放疗的高剂量化疗方案.③实验评估:自体造血干细胞移植5年后血液肿瘤患者的无病存活率.结果:①急性非淋巴细胞白血病:69例患者单次移植,5年无病存活率58.0%(40例),复发率29.0%(20例),移植相关死亡率13.0%(9例).6例患者两次移植,其中1例M5患者复发死亡,5例无病存活.②急性淋巴细胞白血病:29例患者单次移植,5年无病存活率34.5%(10例),复发率34.5%(10例),移植相关死亡率31.0%(9例).14例患者两次移植,5年无病存活率42.9%.③非霍奇金淋巴瘤:18例患者单次移植,5年无病存活率61.1%(11例),复发率16.7%(3例),移植相关死亡率22.2%(4例).4例患者两次移植,其中1例CR1期患者在首次移植后21个月复发,化疗获得PR后行第2次自体造血干细胞移植,17个月后复发死亡;其余3例均无病存活.④霍奇金淋巴瘤:9例患者单次移植,5年无病存活率100%.1例患者行两次移植,首次移植前13个化疗疗程未缓解,行自体外周血造血干细胞移植后达到部分缓解,9个月后行自体骨髓移植后完全缓解,无病存活.结论:①自体造血干细胞移植是治疗血液肿瘤安全有效的方法.②自体造血干细胞两次移植5年无病存活率明显优于单次移植效果,可改善血液肿瘤患者顶后.
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添加谷氨酰胺的全胃肠外营养对造血干细胞移植术后常见并发症的防治作用
目的:严重的黏膜损伤是诱发造血干细胞移植后出现并发症的一常见原因,已有证据显示谷氨酰胺能降低接受化疗患儿黏膜炎的发生率.观察谷氨酰胺对异基因外周造血干细胞移植患者并发症及恢复的影响.方法:选择于2002-03/2006-11在河南省血液病研究所接受同胞异基因外周造血干细胞移植的48例血液系统肿瘤患者.所有患者及其家属对治疗和实验均知情同意,并经医院伦理委员会批准.所有患者移植前均处于完全缓解状态,营养中等或良好,心、肝、肾功能正常,将48例患者随机分为标准化全胃肠外营养液组(标准组,n=13)和加用谷氨酰胺的全胃肠外营养液组(谷氨酰胺组,n=35).待患者中性粒细胞升至1.0×106 L-1,且无任何感染指征,进行异基因外周造血干细胞移植.造血干细胞输注后第1天开始给予全胃肠外营养与胃肠外营养联合谷氨酰胺双肽,至中性粒细胞≥1.0×109 L-1,且无消化道症状时停用.观察两组患者中性粒细胞恢复时间、出层流室时间以及关于感染、急性移植物抗宿主病等情况有无差异.结果:48例患者均进入结果分析.两组患者营养物质的摄入基本相同,谷氨酰胺组有6例发生黏膜炎,标准组有11例,差异显著(P＜0.05);谷氨酰胺组有1例发生严重腹泻,标准组有5例,差异显著(P＜0.05);谷氨酰胺组有3例发生临床感染,标准组有7例,差异显著(P＜0.05);标准组中性粒细胞≥0.5×109 L-1的持续时间短于谷氨酰胺组(P＞0.05);谷氨酰胺组抗生素治疗时间及无菌病房居住时间较标准组短(P＜0.05);两组急性移植物抗宿主病发生率差异无统计学意义(P＞0.05).结论:添加谷氨酰胺的全胃肠外营养可改善异基因造血干细胞移植患者的营养状态,减少感染及肠损害,减少急性移植物抗宿主病的发生,有利于异基因移植患者恢复.
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骨髓基质细胞与pLXSN-bcl-2基因联合治疗大鼠脑缺血
目的:用质粒pLXSN携带抗凋亡基因bcl-2,观察分析骨髓基质细胞与其联合应用对局灶性脑缺血大鼠的治疗效果.方法:实验于2005-05/2006-10在中国医科大学完成.①实验材料:雌性Wistar大鼠40只,随机数字表法分为模型对照组、细胞移植组、基凶质粒组、联合组,10只/组.另选取雄性Wistar大鼠10只用于骨髓基质细胞的提取.质粒pLXSN-bcl-2由钱其军博士惠赠.②实验方法:无菌条件下取大鼠肱骨、胫骨和股骨,去除干骺端,冲出骨髓,离心后重悬为单细胞悬液进行原代培养.待细胞生长到80%铺满瓶底时胰蛋白酶消化,接种密度1×104/cm2,传至3代后用于细胞移植,移植前24 h行BrdU标记.扩增、提取、鉴定并纯化pLXSN-bcl-2质粒,-20℃备用.各组均采用改良线栓法建立大鼠大脑中动脉闭塞再灌注模型.质粒于造模后3 h经鼠颈动脉注入,总量为10 μg,总体积200 μL.骨髓基质细胞于造模后24 h经鼠尾静脉注入,总量为3×106个,总体积1 mL.模型对照组给予等量生理盐水.③实验评估:各组大鼠分别于移植术后3,14 d清醒状态下进行神经运动功能评分.麻醉后处死,免疫组织化学法观察脑源性神经营养因子及Bcl-2蛋白的表达、BrdU标记的骨髓基质细胞在脑内的分布及数量,TUNEL法检测脑内细胞凋亡情况.结果:①神经功能评分:移植术后3 d联合组神经功能评分明显小于模型对照组,至14 d明显低于其余各组(P＜0.05).②移植入脑的Brdu阳性骨髓基质细胞数:联合组和细胞移植组在梗死半球可见大量BrdU阳性的骨髓基质细胞,主要存在于梗死灶周边,其次为海马、纹状体区,梗死对侧也有少量细胞存在.移植术后3,14 d,联合组Brdu阳性细胞数均明显多于细胞移植组(P＜0.05).③脑源性神经营养因子及Bcl-2蛋白的表达:移植术后3,14 d,联合组脑源性神经营养因子、Bcl-2蛋白的表达均明显高于其余3组(P＜0.05).④细胞凋亡情况:移植术后3,14 d,联合组细胞凋亡数量均低于其余各组(P＜0.05).结论:骨髓基质细胞与pLXSN-bcl-2两种治疗因素叠加应用可明显改善大鼠缺血性脑损伤,且效果优于其各自的单独作用.其机制可能是bcl-2基因在抗脑内细胞凋亡的同时,也抑制移植人脑的骨髓基质细胞凋亡,从而更大限度发挥骨髓基质细胞的治疗作用.
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星形胶质细胞对神经干细胞分化的影响
目的:研究表明,星形胶质细胞产生一系列可溶性因子和膜相关因子,对中枢神经系统的发育和功能的成熟起了重要的作用.将星形胶质细胞和神经干细胞在互不接触的情况下进行共培养,探讨星形胶质细胞对神经干细胞分化的影响.方法:实验于2005-03/2006-02在广西医科大学实验中心完成.①实验材料:生后0-2 d新生SD大鼠由广西医科大学实验动物中心提供.②实验方法:分离培养新生大鼠海马神经干细胞.采用化学法、差速贴壁法和振荡法分离纯化新生大鼠脑组织星形胶质细胞,以胶质纤维酸性蛋白标记星形胶质细胞,应用免疫细胞化学染色法进行细胞纯度鉴定.将星形胶质细胞和神经干细胞在互不接触的情况下进行共培养:共培养组是将培养瓶中的星形胶质细胞用胰蛋白酶消化成单细胞悬液,加入完全培养液,待细胞均匀长满后,换神经干细胞基础培养液,孵育24 h后,将涂有多聚赖氨酸的盖玻片放入6孔板中,将传代1个月的神经干细胞球种到盖玻片上,同时更换神经干细胞基础培养液继续培养.对照组是单纯接种神经干细胞球于置有多聚赖氨酸涂布盖玻片的6孔培养板内.③实验评估:采用免疫细胞化学染色法观察神经干细胞分化后神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白和酪氨酸羟化酶表达.结果:纯化的星形胶质细胞胶质纤维酸性蛋白抗体标记阳性,细胞纯度达95%.星形胶质细胞与神经干细胞共培养时,神经干细胞贴壁分化加快,神经元特异性烯醇化酶阳性细胞及酪氨酸羟化酶阳性细胞明显多于对照组(P＜0.05).结论:星形胶质细胞可诱导神经干细胞向神经元细胞,包括多巴胺神经元细胞分化,提示星形胶质细胞支持神经元发生,可能是星形胶质细胞及其分泌的因子维持并延长了神经元存活,降低了凋亡比率所致.
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应用细胞培养、流式细胞技术和Western Blot检测氮杂糖化合物SZL在体外抑制人宫颈癌HeLa细胞增殖与诱导凋亡的效应
目的:存在于细胞表面的糖复合物参与细胞的通讯、增殖、迁移、分化等生理过程,在机体中具有复杂的生物学调控作用.探讨氮杂糖化合物SZL在体外对人宫颈癌HeLa细胞生长、DNA损伤、线粒体膜电位以及细胞凋亡的干预.方法:实验于2004-12/2006-12在北京大学医学部细胞生物学系完成.①实验材料:人子宫颈癌HeLa细胞株由北京大学医学部细胞生物学系杜晓娟副教授提供.SZL由北京大学天然药物及仿生药物重点实验室叶新山教授合成.②实验方法:取对数生长期HeLa细胞,消化后制成细胞悬液,按1.5×103/孔的密度接种,培养24 h细胞完全贴壁后,SZL组加入5.10,25,50,100 μmol/L的SZL,空白对照组加入DMEM培养液.③实验评估:SZL作用24,48,72 h后,采用酸性磷酸酶法检测细胞生长抑制情况,瑞氏染色镜下观察细胞形态;AnnexinV-PI染色后,流式细胞仪检测细胞凋亡率;Rhodamine123标记活细胞后,流式细胞仪检测线粒体膜电位的变化;Western Blot法检测SZL作用后凋亡相关蛋白的表达;单细胞凝胶电泳检测SZL作用后细胞DNA损伤情况.结果:①细胞生长抑制:5,10,25,50,100 μmol/L SZL作用24,48,72 h后的半数抑制浓度分别为73.6,43.2,33.6 μmol/L,显著抑制Hela细胞的增殖.镜下空白对照组HeLa细胞分布均匀,胞质透明清亮,呈铺展状态生长;50 μmol/L SZL作用24 h后,HeLa细胞密度变稀,体积变小,胞核染色质呈聚集状态.②细胞凋亡:50,100 μmol/L SZL作用24 h后细胞凋亡率分别为(3.51±0.41)%,(58.46±8.45)%;在24～48 h过程中,凋亡的细胞逐渐坏死,SZL作用48 h后细胞凋亡率分别为(10.51±2.20)%,(17.29±7.52)%.空白对照组24,48 h后细胞凋亡率均为1%.③线粒体跨膜电位的变化:50 μmol/L SZL作用24,48 h后,HeLa细胞的线粒体膜电位平均荧光强度均明显低于空白对照组(P＜0.01).④凋亡相关蛋白的表达:25,50,100 μmol/L SZL作用HeLa细胞48 h后,凋亡相关蛋白pro-caspase3、Bcl-2表达降低,细胞色素c含量升高.⑤细胞DNA损伤;50 μmol/L SZL作用24 h后,受损细胞DNA在电场中迁出,呈现彗星状拖尾.结论:氮杂糖类化合物SZL能够抑制HeLa细胞的增殖,诱导细胞发生DNA损伤,通过干预线粒体途径实现细胞凋亡.
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犬脂肪间充质干细胞体外分离培养及其多向分化潜能
目的:为进一步分析脂肪间充质干细胞的生物学特性,建立犬脂肪间充质干细胞的体外分离培养方法,并对其表面标志和多向分化潜能进行鉴定.方法:实验于2006-09/2007-04在解放军第四军医大学组织工程中心完成.①实验方法:1岁龄家犬麻醉后,无菌条件下取犬腹股沟皮下脂肪组织,用Ⅰ型胶原酶消化,离心弃上层脂肪及上清,沉淀用含体积分数为0.1胎牛血清的D/F12培养基制成单细胞悬液,按2×108 L-1接种于培养瓶中,细胞长满80%时用胰酶消化传代.②实验评估:分别取第3,5,10代脂肪间充质干细胞,倒置显微镜下连续观察细胞形态变化;MTT法检测细胞增殖活性;采用免疫细胞化学和体外诱导分化方法对脂肪间充质干细胞表面分子标志和多向分化潜能进行鉴定.结果:①细胞形态观察:原代培养1 d多数贴壁细胞呈圆形;3 d时贴壁细胞数量明显增加,大部分呈梭形、三角形;6 d后细胞呈团簇状生长,形成集落;9～10 d后细胞融合超过80%.传代后2～4 h开始贴壁,经过较短的潜伏期后开始增殖,3 d即可长满培养瓶底壁.②细胞增殖活性:培养的细胞分裂增殖能力强,无明显的生长滞缓期,第3天进入对数生长期,第7天达到生长峰值,第8天后进入平台期.第3,5,10代细胞传代接种后的潜伏期、对数生长期、平台期无明显差异,传10代后细胞无明显的衰老征象.③细胞表面分子标志的鉴定:第3代脂肪间充质干细胞CD29,CD44均呈阳性表达.④脂肪间充质干细胞的多向分化潜能:向脂肪细胞诱导第6天胞质中出现透亮的小脂滴,油红染色呈阳性;向神经细胞预诱导24 h后,细胞由梭形变为栅栏样,正式诱导0.5 h后细胞呈双极或多极,3 h后细胞形态不再发生变化,神经元特异性烯醇化酶、胶质原纤维酸性蛋白均呈阳性;向成骨细胞诱导第21天可见钙化结节.结论:体外分离培养的犬脂肪间充质干细胞生长稳定、增殖较快,存在脂肪组织来源干细胞的相关标志分子CD29及CD44,诱导后能向脂肪细胞、神经细胞和成骨细胞分化.
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造血干细胞移植后血液肿瘤患者生存质量的评价
目的:仅以发病率、患病率、病死率作为反映临床治疗和卫生预防措施的效果存在一定的局限性,人们越来越多地以生存质量作为终点指标.调查及评价血液肿瘤患者造血干细胞移植后的生存质量及其影响因素.方法:选择于2001-09/2006-06在广西医科大学第一附属医院血液科进行造血干细胞移植的、对汉语语言文字有正确理解能力的、年龄在18周岁以上的42名患者,男34例,女8例,移植前经骨髓病理学确诊为恶性血液病,移植后骨髓及外周血检验未发现异常细胞、染色体分析及基因检查均正常.征得患者同意后,采用QLQ-C30量表问卷的方式对42例患者的生存质量进行调查,QLQ-C30质量问卷量表(V3.0)由 3个子量表及6个单测项目共30个问题组成,反映患者的总体健康状况、躯体功能、角色功能、情感功能、认知功能和社会功能,以及疲乏、恶心呕吐、疼痛、呼吸困难、失眠、食欲减退、便秘、腹泻、经济困难症状的情况.功能性评分和总体健康状况评分越高表明生存质量越好,症状类评分越高则意味着症状越严重.并选取30名健康普通成人各维度得分为对照.采用相关分析及多元回归模型分析影响患者生存质量的因素.结果:72名受试者均进入结果分析.42例患者总体健康状况中等,与普通人群相比,躯体功能和认知功能恢复较好(P＞0.05),其他功能状态恢复较差,社会功能中位得分低(P＜0.01),症状分级中疲乏症状明显(P=0.000),64.3%存在经济困难(P=0.000).回归分析显示,原发病、血型相合度、HLA相合度、婚姻、家庭月收入、因病借钱及移植后费用与生存质量功能状态相关,并影响功能维度得分(P＜0.05).而年龄、职业、移植类型和预处理方案等因素不影响功能维度得分.结论:移植后血液病患者生存质量满意度较好,躯体功能恢复好,疲乏常见,经济情况是生存质量的主要影响因素.
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用于包装腺相关病毒293细胞的培养
背景:腺相关病毒作为一种主要的基因工程载体,已被广泛应用.但腺相关病毒是缺陷性病毒,需要包装细胞提供E1蛋白.腺相关病毒293细胞作为重要的腺相关病毒特异性包装细胞,能反式产生E1,但腺相关病毒293细胞娇嫩,培养困难,生物学特性易发生改变.因此,有必要建立一种腺相关病毒293细胞的培养方案以满足基因工程的需要.目的:建立一种体外培养腺相关病毒293细胞的方法.设计:开放性实验.单位:华中科技大学同济医学院附属同济医院神经内科.材料:腺相关病毒293细胞株购于Stratagene公司.高糖型DMEM粉(Gibco公司),AAV Helper-Free系统三质粒(Stratagene公司).方法:实验于2006-10/2007-04在武汉同济医院神经内科实验室完成.在体外将腺相关病毒293细胞复苏,用高糖型DMEM生长培养基培养,当细胞单层融合度达到50%时传代和冻存,并倒置显微镜下观察细胞的生长状态,记录生长曲线.荧光倒置显微镜下观察,根据腺相关病毒293细胞在共转染腺相关病毒系统三质粒后以及被腺相关病毒上清感染后能否激发出绿色荧光,鉴定其包装腺相关病毒的生物学特性.主要观察指标:①腺相关病毒293细胞形态学观察.②生长曲线.③腺相关病毒包装.结果:①倒置显微镜下显示,腺相关病毒293细胞贴壁生长良好,呈现不规则的多角形,胞浆透亮,胞核隐约可见.②生长曲线显示,细胞传代后第1天为生长适应期,2-5 d为生长活跃期.6 d后细胞进入生长平台期.③荧光倒置显微镜下观察到,腺相关病毒293细胞激发绿色荧光,共转染腺相关病毒系统三质粒成功.腺相关病毒293细胞被腺相关病毒上清感染后激发出绿色荧光,腺相关病毒包装成功.结论:本实验的培养方法简单有用,培养的腺相关病毒293细胞可保持良好的腺相关病毒包装功能.
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重组腺病毒对体外培养耳蜗Corti器的转染特性
目的:腺病毒载体是在内耳基因治疗的实验研究中应用广泛的载体之一,但载体的靶向性不明显.通过重组腺病毒携带报告基因EGFP转染体外培养耳蜗器官,观察各型细胞的转染特性.方法:实验于2004-08/2006-01在美国纽约州立大学布法罗分校听力耳聋研究中心完成.①实验材料:Fisher大鼠来源于布法罗大学的实验动物中心.AdV/EGFP是Buffalo大学Dr.Lee惠赠.②实验方法:选取出生3 d的大鼠分离获取耳蜗组织.使用携带报告基因-EGFP的重组腺病毒(AdV/EGFP),以1×107,1×108,1×109,2×109V P/mL 作用耳蜗,于感染后6,12,24,48 h和3 d,固定组织,观察感染特性.分离出生3 d的大鼠耳蜗Corti器,基底膜分离后,立即进入2 mL滴度为1×109VP/mL,含2mmol/L 的庆大霉素病毒溶液,作用3 h后平铺到胶粒上,加入含2 mmol/L庆大霉素的生长培养基,作用24 h后收获样品.③实验评估:采用TRITC-labeled phaloidin组织化学染色,荧光显微镜观察绿色荧光蛋白EGFP和TRIC在耳蜗细胞中的表达定位.结果:①重组腺病毒可转染离体培养耳蜗组织中的各种类型细胞,外沟细胞感染率高,其次为齿间细胞.仅有很少部分的毛细胞和螺旋神经元被感染.②在病毒滴度在107～109 VP/mL 的范围内,重组腺病毒感染耳蜗具有剂量依赖性,但大于这个滴度并不会增加感染效率,而且高浓度的重组病毒可造成毛细胞和外沟细胞破坏.③EGFP早于感染后6 h出现,48 h达到高峰,外源基因高表达至少可维持7 d.④庆大霉素损伤所有的毛细胞后,重组腺病毒能够感染多数的Deiters'细胞,齿间细胞的感染效率高于腺病毒对正常耳蜗组织的感染.结论:重组腺病毒转染效率在耳蜗各种类型细胞明显不同,重组腺病毒优先感染耳蜗支持细胞.
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腺相关病毒介导癌胚抗原转染树突状细胞对免疫功能的调节作用
目的:近年来,树突状细胞参与调节作用的研究较多.实验拟验证重组腺相关病毒(rAAV)介导癌胚抗原基因转染树突状细胞后其的免疫调节作用的变化.方法:实验于2006-06/2006-11在美国阿肯色大学医学院基因治疗中心完成.①实验方法:取健康人外周血(自愿捐献),采用改良Ficoll密度梯度离心的方法分离外周血单个核细胞,取贴壁细胞,分为rAAV/CEA转染组和空白对照组,均采用重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、白细胞介素4、肿瘤坏死因子-α诱导树突状细胞前体细胞成熟,将成熟树突状细胞与末梢血淋巴细胞按比例混合培养,可得到激活的细胞毒性T淋巴细胞.②实验评估:采用流式细胞仪检测树突状细胞表面标志表达,细胞毒性T淋巴细胞的免疫表型变化,细胞毒性T淋巴细胞γ-干扰素表达.采用酶联免疫吸附法(ELISA法)检测树突状细胞的白细胞介素12和白细胞介素10表达.结果:①rAAV/CEA转染树突状细胞的CD14较空白对照组降低,共刺激分子CD40、CD80、CD83、CD86表达均较空白对照组高.②成熟树突状细胞细胞因子表达中,rAAV/CEA转染组的白细胞介素12较空白对照组升高,白细胞介素10降低.③与空白对照组比较,rAAV/CEA转染组能高表达CD8+T细胞和其表型CD69,CD8/CD56的T细胞比例上调,CD25+CD4+的T细胞减少.④rAAV/CEA转染的细胞毒性T淋巴细胞表达相对较高水平的γ-干扰素,与杀伤实验结果相吻合.结论:rAAV/CEA转染树突状细胞能够激活细胞毒性T淋巴细胞的特异性杀伤作用,与树突状细胞和细胞毒性T淋巴细胞等免疫细胞表面标志变化和细胞内细胞因子水平变化相关.
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不同诱导条件对体外诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的影响
目的:已证实骨髓间充质干细胞体内移植能改善心脏功能,但其机制尚不清楚.观察不同诱导条件对骨髓间充质干细胞体外分化为心肌样细胞的影响.方法:实验于2005-05/2006-04在南昌大学第一附属医院泌尿外科研究所完成.①实验材料:健康供体骨髓(自愿捐赠),孕16周水囊引产胎儿(胎儿家属同意捐赠).②实验方法:取健康供体骨髓,采用淋巴细胞分离液并结合骨髓间充质干细胞贴壁特性分离细胞.取第4代骨髓间充质干细胞进行诱导实验,分为生物诱导组和化学诱导组.生物诱导组分别采用胚胎心肌细胞与骨髓间充质干细胞直接混合培养、胚胎心肌细胞与骨髓间充质干细胞间接混合培养及胚胎心肌细胞匀浆液诱导培养,化学诱导组用5,10,15 μmol/L 5-aza分别处理12,24,48 h进行诱导.③实验评估:采用免疫细胞荧光染色法检测胞浆中的肌节肌动蛋白.结果:①骨髓间充质干细胞只有在其与胚胎心肌细胞直接混合培养时,才能分化为心肌样细胞,而在其他生物诱导模型下却未见其分化为心肌样细胞.②化学诱导组骨髓间充质干细胞经免疫细胞荧光染色鉴定后,均未见胞浆中有肌节肌动蛋白表达,证实经5-aza诱导处理后,未见骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞.结论:①胚胎心肌细胞可诱导骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞,机械因素是促进骨髓间充质干细胞定向分化为心肌样细胞必不可少的因素之一.②骨髓间充质干细胞经5-aza诱导是否分化为心肌样细胞未能获得证实.
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严重烧伤早期大鼠骨髓中性粒细胞的变化与低剂量环磷酰胺的干预
目的:中性粒细胞在炎症反应的发生、发展和转归中起关键作用.有研究证实,低剂量环磷酰胺具有明显的抗炎作用.观察低剂量环磷酰胺对严重烧伤早期大鼠骨髓中性粒细胞的影响,并探讨其可能的机制.方法:实验于2006-09/2007-05分别在解放军第三军医大学西南医院烧伤研究所、重庆医科大学附属儿童医院实验室进行.①实验材料:清洁级雄性SD大鼠110只,体质量160-200 g,由解放军第三军医大学大坪医院动物实验中心提供.②实验方法:将110只SD大鼠随机分为3组,环磷酰胺组(n=50)、烧伤模型组(n=50)、空白组(n=10).环磷酰胺组与烧伤模型组复制30%体表面积Ⅲ度烧伤模型后,烧伤模型组立即腹腔注射乳酸林格氏液,环磷酰胺组立即腹腔注射乳酸林格氏液和环磷酰胺,空白组不做任何处理.③实验评估:于造模后3,6,12,24,48 h采集骨髓,采用流式细胞仪分析中性粒细胞凋亡情况.结果:110只SD大鼠全部进入结果分析.与空白组比较,烧伤模型组中性粒细胞凋亡率在造模后第6小时开始增加(P＜0.05),第12小时达峰值,第24小时开始降低,环磷酰胺组中性粒细胞凋亡率在造模后第6小时开始增加(P＜0.05),且持续增加直至第48小时.与烧伤模型组比较,环磷酰胺组从造模后第6小时开始凋亡率增加,且在造模后第24,48小时凋亡率增加(P＜0.05).与空白组比较,环磷酰胺组中性粒细胞数量变化从造模后第3小时开始减少直至第48小时(P＜0.05),烧伤模型组中性粒细胞数量变化从造模后第3小时开始减少直至第48小时(P＜0.05).与烧伤模型组比较,环磷酰胺组中性粒细胞数量仅造模后第3小时明显减少(P＜0.05),其他时段均增加,但差异无统计学意义.结论:低剂量环磷酰胺加速严重烧伤早期大鼠骨髓中性粒细胞的凋亡,抑制其排空,对烧伤全身炎症反应综合征的发生、发展具有一定的影响.
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PSNAV2.0-TNFα重组质粒的构建及其在体外的表达
目的:在前期微囊化基因工程细胞制备平台的基础上,构建分泌型人肿瘤坏死因子α的真核表达载体PSNAV2.0-TNFα重组质粒,并鉴定其蛋白的体外瞬时表达,为进一步利用该基因进行微囊化细胞移植治疗和改善疾病奠定基础.方法:实验于2006-06/2007-05在解放军总医院老年医学研究所细胞生物学实验室完成.①以含有人肿瘤坏死因子αcDNA序列的质粒为模板,通过PCR扩增获得人肿瘤坏死因子α基因片段;将其定向插入真核表达载体PSNAV2.0中,获得重组质粒PSNAV2.0-TNFα.采用Sal Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切法、PCR法及插入片段序列测定法鉴定该质粒.②利用阳离子脂质体介导法,将其转染到人胚胎肾细胞HEK-293细胞中,构建可持续分泌人肿瘤坏死因子α的基因工程细胞,采用RT-PCR法和Western blot法检测转染细胞培养上清液中人肿瘤坏死因子蛋白的体外瞬时表达.结果:①通过Sal Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切、PCR及测序鉴定证明:在HEK-293中插入片段正确.②采用RT-PCR和Western blot法检测表明HEK-293细胞培养上清中有人肿瘤坏死因子α蛋白,Mr17 000.结论:成功构建了重组质粒PSNAV2.0-TNFα真核表达载体,转染HEK-293细胞后可有效分泌人肿瘤坏死因子α蛋白,并能分泌到细胞外.
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新生大鼠海马区及室管膜下区神经干细胞的诱导分化:无血清培养条件下观察
背景:神经干细胞作为修复损伤神经组织的细胞源已引起学者的关注,如何有效的获取更多的神经干细胞逐渐成为重点解决的课题之一.目的:观察大鼠室管膜下区和海马回神经干细胞体外培养、传代和分化情况.设计:单一样本实验.单位:中山大学附属第三医院神经外科.材料:取出生后3d SD大鼠10只,雌雄不拘,由中山大学实验动物中心提供.巢蛋白抗体(兔抗大鼠)、神经微丝蛋白(NF-200)抗体(兔抗大鼠)、胶质纤维酸性蛋白抗体(小鼠抗大鼠)均购自Sigma公司.方法:实验于2006-09/12在中山大学基础医学院组织胚胎学实验室完成.实验过程中对动物的处置符合动物伦理学要求.从新生大鼠海马、室管膜下区分离神经干细胞,采用DMEM/F12无血清悬浮的条件培养,同时在培养基中加入碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子代替血清中含有的分裂原,进行体外扩增培养、传代观察.主要观察指标:采用免疫荧光检测技术,通过检测神经干细胞表达的nestin、神经元细胞表达的神经微丝蛋白和星形胶质细胞表达的胶质纤维酸性蛋白,鉴定神经干细胞及其分化结果.结果:分离获取的细胞具有自我更新和增殖能力,原代及传代培养20代后,在倒置显微镜下仍保留典型的"细胞克隆球"特征,神经克隆球通过nestin免疫荧光染色,呈阳性反应.经诱导后,细胞克隆球细胞外迁贴壁生长,可分化为神经微丝蛋白阳性的神经元细胞和胶质纤维酸性蛋白阳性的星形胶质细胞.结论:实验分离培养出具有自我更新和增殖能力的神经干细胞,其可诱导分化为神经元样细胞和星形胶质细胞.
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供体鼠龄对急性心肌梗死骨髓间充质干细胞移植后血管发生的影响
目的:干细胞移植后可以通过改善梗死区域血管新生而发挥改善心功能的作用.实验观察不同鼠龄骨髓间充质干细胞移植后的效果,拟验证其对急性心肌梗死动物血管发生的影响.方法:实验于2006-02/2007-05在福建省高血压研究所完成.①实验材料:清洁级SD大鼠由上海实验动物公司提供.选用2周龄雄性SD大鼠作为幼年鼠骨髓间充质干细胞来源,选用1年龄雄性SD大鼠作为老年鼠骨髓间充质干细胞来源.实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准.②实验方法:密度梯度离心法和贴壁筛选法获得SD大鼠骨髓间充质干细胞,观察老年与幼年大鼠骨髓间充质干细胞的凋亡情况.体外模拟梗死心肌缺血、缺氧条件,制备大鼠心肌梗死模型.将造模后大鼠随机分为3组:对照组(n=8)不进行干细胞移植,只在梗死心肌周围注入等量的生理盐水.老年鼠移植组(n=8)梗死心肌周围分4点注入同种异体老年鼠骨髓间充质干细胞,幼年鼠移植组(n=8)梗死心肌周围分4点注入同种异体幼年鼠骨髓间充质干细胞.③实验评估:干细胞移植4周后,采用Ⅷ因子免疫组织化学观察各组间血管密度的差别.结果:24只大鼠均进入结果分析.在缺血、缺氧条件下,幼年鼠骨髓间充质干细胞的抗凋亡能力强于老年鼠(P＜0.05).Ⅷ因子免疫组织化学检测显示,两移植组梗死区域均有新生血管生成,幼鼠移植组血管密度高于老年鼠移植组(P＜0.05),老年鼠移植组高于对照组(P＜0.05).结论:供体年龄在一定程度上影响急性心肌梗死骨髓间充质干细胞移植后血管的发生.
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黄芪诱导骨髓间充质干细胞分化进程中细胞内钙离子浓度的动态变化
目的:从细胞内钙离子浓度这一视角切入,验证黄芪提取物可诱导骨髓间充质干细胞向神经干细胞分化的作用,并观察黄芪注射液在骨髓间充质干细胞分化进程中的诱导效应.方法:实验于2007-03/05在河北北方学院中心实验室完成.①实验方法:取1只Wistar大鼠,麻醉后分离股骨和胫骨,D-Hanks液冲洗骨髓腔,离心弃上清,加入含体积分数为0.15胎牛血清的L-DMEM培养基重悬,调整细胞浓度为1×109 L-1接种,达80%～90%融合后消化传代.取第4代骨髓间充质干细胞,加入黄芪注射液至终浓度为100 mg/L进行诱导分化.②实验评估:观察细胞形态学变化.以免疫细胞化学技术检测诱导5 h后细胞巢蛋白的表达.使用流式细胞仪检测诱导前及诱导后10,30,60,120,300 min钙离子探针fluo-3-AM的平均荧光强度.结果:①诱导后细胞形态变化:诱导5 h后细胞体积增大,胞核固缩,核质比减小,有细长突起形成.②诱导后细胞内巢蛋白的表达:免疫细胞化学检测诱导后可见巢蛋白阳性细胞.③诱导不同时相细胞内钙离子浓度的变化:与诱导前比较,诱导10,30 min后细胞内钙离子浓度均明显下降(P＜0.01);诱导60 min后有所上升,虽然仍低于诱导前浓度但差异无显著性意义(P＞0.05);诱导120 min后达高点(P＜0.01);诱导300 min后胞内钙离子浓度下降至诱导前水平(P＞0.05).结论:黄芪注射液可诱导骨髓间充质干细胞向神经干细胞分化,且细胞内钙离子浓度伴随分化过程出现曲线波动,提示钙离子介导的信号通路可能参与细胞分化.
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腺病毒介导人骨形态发生蛋白2基因在兔脂肪干细胞的表达与成骨分化效应
目的:采用腺病毒介导人骨形态发生蛋白2基因转染兔脂肪干细胞,观察目的基因在脂肪干细胞中的表达效率及向成骨细胞定向分化的能力.方法:实验于2005-12/2006-09在武汉大学医学院中心实验室和三峡大学医学院病理实验室进行.①实验材料:4月龄健康新西兰大耳白兔2只.质粒pAd-BMP-2由美国哈佛医学院分子骨科中心Oliver博士惠赠;携带β-半乳糖酐酶基因的腺病毒对照载体由李康博士惠赠;大肠杆菌DH5a以及293细胞由本实验室保存.②实验方法:新西兰兔肌注麻醉后,完整取出双侧腹股沟脂肪垫,清除外包膜、明显的结缔组织和小血管,剪碎,离心,体外分离培养脂肪干细胞.表达载体pAd-hBMP-2经293细胞包装重组腺病毒后,取第3代生长良好的脂肪干细胞,按5×105接种于60 mm培养皿,将Ad-hBMP-2病毒以感染复数10～20感染细胞.将成功转染骨形态发生蛋白2的脂肪干细胞作为转染组,以转染携带β-半乳糖酐酶基因腺病毒载体的脂肪干细胞作为对照组.两组均置入不含骨形态发生蛋白2的无血清成骨诱导培养基中进行诱导分化.③实验评估:定期观察细胞的形态学变化,MTT法绘制生长曲线,计算增殖时间;成骨诱导培养后测定碱性磷酸酶活性,光倒置显微镜下观察钙化结节形成情况;RT-PCR、免疫组织化学法、Western blot法检测目的基因人骨形态发生蛋白2和成骨细胞标志性蛋白Ⅰ型胶原、骨钙素的表达.结果:①脂肪干细胞转染前后形态学变化、生长曲线及倍增时间:Ad-hBMP-2基因修饰的脂肪干细胞经诱导培养后形态规则,多角型细胞增多,转染组的细胞生长曲线倍增时间明显短于对照组.②碱性磷酸酶活性及矿化结节形成:转染组脂肪干细胞碱性磷酸酶活性呈增加趋势,成骨诱导培养7,10,14 d均显著高于未转染组(P＜0.01).转染组成骨细胞四环素标记显示圆形矿化结节呈金黄色,数量多,结节大.③脂肪干细胞人骨形态发生蛋白2与Ⅰ型胶原、骨钙素的表达:成骨诱导培养7,14 d,RT-PCR、免疫组织化学法、Western blot法检测结果显示转染组目的基因人骨形态发生蛋白2、成骨标志性蛋白Ⅰ型胶原、骨钙素的分泌表达均明显强于对照组.结论:经Ad-hBMP-2基因修饰的兔脂肪干细胞在体外能定向分化为成骨细胞,且分化增殖能力强;目的基因骨形态发生蛋白2表达高、持续时间长.
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诱导大鼠骨髓间充质干细胞表达神经胆碱乙酰化转移酶
目的:胆碱乙酰化转移酶是胆碱能神经系统功能变化的重要标记.观察大鼠骨髓间充质干细胞表达神经胆碱乙酰化转移酶的情况,探讨其定向诱导分化为特异胆碱能神经元的有效条件.方法:实验于2006-09/2007-05在暨南大学医学院血液病研究完成.①实验方法:SD大鼠颈椎脱臼处死,无菌条件下取股骨,从骨髓中分离间充质干细胞,待80%～90%融合后胰酶消化传代.体外培养传3代后,向胆碱乙酰化转移酶阳性神经细胞进行诱导分化.实验Ⅰ组:DMEM/F12+0.1 mmol/L 2-巯基乙醇+1 mmol/L维甲酸诱导2 d.实验Ⅱ组:体积分数为0.1的胎牛血清+10 μg/L碱性成纤维细胞生长因子+0.1 mmol/L 2-巯基乙醇预诱导2 d,换液后再加入1 mmol/L 维甲酸、10 μg/L表皮生长因子、10 μg/L 神经生长因子继续诱导7 d.实验Ⅲ组:在Ⅱ组方案的基础上加入1 250 u/mL Heparin.空白对照组不作任何处理.②实验评估:观察间充质干细胞诱导后的形态变化;诱导9 d,采用RT-PCR检测及凝胶电泳分析实验Ⅱ组胆碱乙酰化转移酶mRNA的表达;诱导2,9 d,以CY3间接免疫荧光法检测各组胆碱乙酰化转移酶阳性细胞分化情况.结果:①骨髓间充质干细胞诱导后形态学变化:诱导1 d细胞形态逐渐由长梭形变为圆形或椭圆形,折光性及立体感增强,部分细胞可见突起开始形成;诱导2 d细胞突起伸长,胞间或细胞与间质可形成连接;诱导9 d细胞突起变粗,胞浆内分泌颗粒增加并见胞核.②胆碱乙酰化转移酶mRNA的表达:诱导后的细胞高表达胆碱乙酰化转移酶mRNA.③胆碱乙酰化转移酶阳性分化细胞检测:实验Ⅱ组胆碱乙酰化转移酶阳性分化细胞表达率为80%～90%,明显高于实验Ⅰ组的50%～70%,且细胞生长状态较好;实验Ⅲ组细胞脱壁死亡率高,亦有较高的胆碱乙酰化转移酶阳性分化细胞表达率.结论:①鼠骨髓间充质干细胞能被转化为表达神经胆碱乙酰化转移酶的细胞.②胎牛血清、碱性成纤维细胞生长因子、2-巯基乙醇预诱导后,再加入维甲酸、表皮生长因子、神经生长因子继续诱导是分化为特异胆碱能神经元的有效条件.
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脉冲电磁场对小鼠骨髓间充质干细胞增殖的影响
背景:脉冲电磁场作为一种非侵入性疗法治疗骨不连及其他的骨科疾病已被证实有确切的临床疗效.但由于认识的局限性,骨髓间充质干细胞在脉冲电磁场治疗骨折中的作用未被充分重视.目的:观察小鼠骨髓间充质干细胞在50 Hz、正弦波形、不同强度、不同作用时间脉冲电磁场干预下的增殖情况,以及其细胞周期变化,以寻求佳干预窗口.设计:单一样本、区组设计,观察对比体外细胞培养实验.单位:华中科技大学同济医学院附属普爱医院骨科.材料:选用BALB/C小鼠20只,鼠龄4～5周,体质量18～22 g,雌雄不拘,由同济医学院实验动物中心提供.此动物实验符合动物伦理学要求.脉冲电磁场发生器(海军工程大学电机系设计与制造).方法:实验于2005-02/12在华中科技大学同济医学院附属普爱医院骨外科实验室完成.用密度梯度离心法分离小鼠骨髓间充质干细胞,再用贴壁筛选法筛选,对生长良好的第3代的小鼠骨髓间充质干细胞分别给予50 Hz、强度分别为4,3,2,1 mT的正弦波形脉冲电磁场,2次/d,每次30 min,间隔12 h,以不加电磁场干预的干细胞为对照组.主要观察指标:在照射第24,48,72 h后采用MTT法测定骨髓间充质干细胞增殖水平;采用流式细胞仪分析细胞周期,以增殖指数(proliferation index,PI)表示脉冲电磁场对小鼠骨髓间充质干细胞分裂增殖的影响.结果:脉冲电磁场对小鼠骨髓间充质干细胞增殖的影响:脉冲电磁场照射24,48 h后各干预组与对照组比较,差异无显著性意义(P＞0.05).脉冲电磁场照射72 h后各干预组骨髓间充质干细胞增殖数目多于对照组,差异有显著性意义(P＜0.05～0.01),其中以1 mT强度照射为明显(P＜0.01).脉冲电磁场对小鼠骨髓间充质干细胞细胞周期的影响:在检测的所有细胞样本中均未发现有DNA倍体异常的细胞(diploid:100%).骨髓间充质干细胞经过72 h的强度为1,2,3,4 mT的脉冲电磁场干预后PI值高于对照组,差异有显著性意义(P＜0.05～0.01),其中以1 mT为明显(P＜0.01).结论:50 Hz、正弦波形、强度为1 mT的脉冲电磁场照射72 h能明显促进体外小鼠骨髓间充质干细胞增殖,是佳干预窗口.
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血管内皮祖细胞与内皮细胞生长因子在冠状动脉粥样硬化性心脏病状态时的变化
目的:观察冠状动脉粥样硬化性心脏病(简称冠心病)患者循环内皮祖细胞与血管内皮细胞生长因子的变化及其相互间的关系.方法:①对象:于2005-11/2006-10在泰山医学院聊城临床学院心内科住院并行冠状动脉造影检查确诊为冠心病患者37例和冠状动脉造影正常者(对照组)7例.其中稳定型心绞痛患者12例、不稳定型心绞痛患者14例、急性心肌梗死患者11例.②方法:采集研究对象外周血进行内皮祖细胞的分离培养,激光共聚焦显微镜鉴定FITC-UEA-I和DiLDL双染色阳性细胞为正在分化的内皮祖细胞,通过集落形成试验、改良的Boyden小室和黏附能力测定实验计数内皮祖细胞的数量,测定内皮祖细胞的迁移和黏附能力.用酶联免疫吸附法检测44例入选者血浆内皮细胞生长因子水平,比较其与循环内皮祖细胞的数量、迁移和黏附能力有无相关性.结果:急性心肌梗死组内皮祖细胞集落形成数是对照组的2.7倍,其迁移能力较其他3组升高(P＜0.01),但其黏附能力与不稳定型心绞痛组相比差异无显著性;不稳定型心绞痛患者内皮祖细胞数量及迁移能力较稳定型心绞痛和对照组升高(P＜0.01);稳定型心绞痛患者内皮祖细胞数量及迁移、黏附能力均比对照组减低(P＜0.05).不稳定型心绞痛和急性心肌梗死患者血浆内皮细胞生长因子水平明显高于对照组(P＜0.01).内皮细胞生长因子浓度与循环内皮祖细胞数量及迁移能力呈正相关,与循环内皮祖细胞黏附能力无相关性.结论:急性心肌梗死(发病7 d内)和不稳定型心绞痛可引起循环内皮祖细胞数量增多,迁移和黏附能力增强,这种变化可能与血浆内皮细胞生长因子水平增高有关.
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大鼠骨髓基质干细胞定向分化为成骨细胞及体外增殖过程中地塞米松的抑制性干预
目的:地塞米松在体外诱导骨髓基质干细胞向成骨细胞分化过程中起着关键性作用.验证骨髓基质干细胞向成骨细胞分化的能力,观察成骨细胞分化早期地塞米松对骨髓基质干细胞体外增殖的抑制效果.方法:实验于2006-09/12在南方医科大学组织工程研究中心完成.①实验方法:取5周龄雄性SD大鼠10只,经颈椎脱位法处死后取股骨,去除双侧干骺端,用DMEM高糖完全培养基冲洗骨髓腔,收集骨髓细胞,离心后按(1-2)×107L-1密度接种,加入条件培养液(DMEM高糖完全培养基,体积分数为0.1的标准胎牛血清,50 mg/L维生素C,10 mmol/L的B-甘油磷酸钠,100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素)进行体外培养.分别于细胞传代培养后第0,2,4天向培养基中加入1 μmol/L地塞米松1 mL,并设立仅加入等量培养基的空白对照组.②实验评估:以2 d为间隔,倒置显微镜下观察细胞生长情况.采用Cell Titer 96试剂盒各组细胞增殖情况.结果:①骨髓基质干细胞向成骨细胞的分化:原代培养中贴壁细胞多呈长梭形,少数呈小圆形或三角形.原代培养六七天后进,行传代,多数细胞在加入地塞米松后逐渐呈均一的长梭形,随着时间延长呈叠形多层排列,细胞外基质明显增多,并逐渐形成多个小结样结构.空白对照组细胞形态欠均一,少数细胞呈多边形或三角形,细胞外基质明显少于地寒米松组,罕见小结样结构.传代后10～12 d可达80%～90%致密层,细胞生长速度较原代细胞明显增快,至第10代细胞仍未出现衰老现象.②骨髓基质干细胞的增殖检测:与空白对照组比较,细胞传代培养后第0,2,4天加入地塞米松,干预处理8,10,12 d时的细胞数量均明显下降(t=5.044 5～11.379 5,P均＜0.01).结论:①传代的骨髓基质干细胞经地塞米松处理后,细胞形态趋于成熟,生长速度加快,可定向分化为成骨细胞.②在向成骨细胞分化早期,地塞米松能够抑制骨髓基质干细胞的体外增殖.
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模拟失重对大鼠承重骨骨髓基质细胞数量及体外成骨能力的影响
背景:骨组织在特殊物理环境如失重环境下,代谢活动会发生显著的变化,而成骨细胞是骨代谢和骨形成的核心部分,其对重力环境的变化敏感.目的:观察模拟失重条件对大鼠股骨骨髓基质细胞数量体外成骨能力的影响,揭示骨丢失的机制.设计:随机配对,对照实验.单位:解放军第四军医大学航空航天医学系和口腔医学院病理科.材料:选用20只成年健康雄性SD大鼠.实验开始当日按体质量随机分为对照组和悬吊组,每组10只.碱性磷酸酶试剂盒由北京中生生物工程高技术公司生产.方法:实验于1999-11/2000-07在解放军第四军医大学口腔医学院病理科完成.将SD大鼠随机配对分为鼠尾悬吊组和对照组,每组10只.悬吊组大鼠做尾部悬吊28 d,大鼠始终保持30°头低位及后肢自由悬垂不负重状态.对照组正常饲养.实验期满,取股骨,将股骨骨髓基质细胞进行原代和传代细胞培养.主要观察指标:采用细胞计数法和噻唑蓝法绘制原代和传代培养细胞的生长曲线,进行碱性磷酸酶活性及体外矿化小结形成量的检测.结果:①碱性磷酸酶活性:原代和传代培养悬吊组低于对照组,差异有显著性意义(P＜0.05).②钙化小结形成数:悬吊组少于对照组,差异有显著性意义(P＜0.05).③细胞生长:原代和传代股骨间充质细胞的生长曲线呈"S"形,悬吊组和对照组细胞倍增时间相近.④股骨骨髓基质细胞数:原代细胞培养系中,悬吊组比对照组约少50%(P＜0.05).结论:模拟失重条件下,大鼠骨髓基质细胞数明显减少,后肢承重骨成骨细胞数减少,体外成骨能力降低.
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β-巯基乙醇诱导大鼠骨髓基质细胞神经细胞蛋白的表达
目的:骨髓基质细胞具有向神经细胞分化的能力,观察化学诱导剂β-巯基乙醇体外诱导大鼠骨髓基质细胞后神经细胞标志蛋白的表达率.方法:实验于2006-09-01/2006-10-20在辽宁医学院中心实验室完成.①实验材料:选取清洁级2月龄SD大鼠12只,由辽宁医学院实验动物中心提供,体质量200 g左右,雌雄不拘.②实验方法:采用贴壁培养与传代的方法分离纯化SD大鼠骨髓基质细胞.将第2代细胞置于含有4 mol/L β-巯基乙醇诱导剂的培养基中诱导6 h.③实验评估:应用倒置显微镜观察骨髓基质细胞与诱导后细胞形态,采用免疫组织化学法检测巢蛋白,胶质纤维酸性蛋白,神经丝蛋白的表达率.结果:诱导前大鼠骨髓摹质细胞以长梭形细胞为主,诱导后可见细胞体积缩小,胞体伸出较多突起并有分枝出现,个别细胞形态类似神经细胞.诱导6 h后,细胞中巢蛋白、神经丝蛋白、胶质纤维酸性蛋白均有表达,表现为胞浆呈棕黄色,免疫组织化学检测神经细胞标志蛋白神巢蛋白、胶质纤维酸性蛋白、神经丝蛋白表达率分别为85.12%,6.56%,80.17%.结论:大鼠骨髓基质细胞体外分离纯化方法简单易行,在β-巯基乙醇诱导下,较高的表达了神经细胞标志物.
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不同组合细胞因子与人参总皂苷对体外培养CD34+细胞分化的诱导效应
背景:造血生长因子可分别作用于不同的造血细胞和细胞的不同分化阶段.红细胞生成素可促进晚期红系祖细胞的增殖分化,白细胞介素3为多潜能集落刺激因子,对多种造血细胞的分化成熟具有促进作用.目的:观察细胞因子的不同组合及人参总皂苷对CD34+细胞体外定向诱导分化为红系血细胞的影响.设计:观察对比实验.单位:重庆医科大学.材料:实验于2002-07/2004-01在重庆医科大学组织胚胎学教研室、基础医学研究所、重庆市生物化学与分子药理学重点实验室完成.正常人骨髓细胞来自第三军医大学大坪医院胸外科无血液系统疾病患者手术摘除的肋骨,所有患者知情同意.人参总皂苷和试剂由重庆中药研究所惠赠.胎牛血清、FITCCD34+抗体、FITC标记同型对照小鼠IgG1为Becton Dickinson公司产品,CD71+抗体为Santa Cruz公司产品,血小板生成素、Flt-3配基、干细胞因子、白细胞介素-3为Santa Cruz公司产品,红细胞生成素为Amgen公司.方法:应用阴性分选策略,以StemsepTM系统从正常人骨髓细胞中分离CD34+造血干/祖细胞.经造血细胞因子不同组合(白细胞介素3+红细胞生成素、干细胞因子+白细胞介素3+红细胞生成素,Flt-3配基+血小板生成素+干细胞因子+白细胞介素3+红细胞生成素)进行液体培养,并以干细胞因子+白细胞介素3+红细胞生成素为对照组,在其中加入终浓度分别为10,20,50,70,100 mg/L人参总皂苷为加药组,检测细胞总数、CD71+细胞比例;在CD34+细胞培养体系中加入不同剂量的人参总皂苷(剂量同前)为药物组,以不加人参总皂苷为对照组,通过甲基纤维素半固体培养法检测人参总皂苷诱导CD34+造血干/祖细胞向红系祖细胞(早期红系祖细胞、晚期红系祖细胞)增殖与分化能力.主要观察指标:①不同的细胞因子组CD34+细胞体外增殖情况.②人参总皂苷对CD34+细胞定向诱导分化为红系血细胞的影响.③人参总皂苷对CD34+细胞形成红系祖细胞能力的影响.结果:①各因子组合中以Flt-3配基+血小板生成素+干细胞因子+白细胞介素3+红细胞生成素细胞因子组合诱导CD34+细胞分化为红系血细胞的能力强,2周时CD71+细胞比例为(61.20±5.31)%.②人参总皂苷20 mg/L是液体培养诱导CD34+细胞向红系分化的佳浓度,与干细胞因子+白细胞介素3+红细胞生成素协同作用CD34+细胞2周后,CD71+细胞比例从(48.39±5.07)%增加到(56.20±1.40)%.③人参总皂苷10～50 mg/L均能提高CD34+细胞形成早期红系祖细胞、晚期红系祖细胞的集落产率.结论:含有Flt-3配基+血小板生成素+干细胞因子+白细胞介素3+红细胞生成素的细胞因子组合,可诱导CD34+细胞定向生成大量的红系细胞;人参总皂苷能促进CD34+细胞定向诱导分化为红系血细胞.
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大鼠骨髓间质干细胞经三七总皂甙体外诱导分化为神经元样细胞:表型特征、凋亡蛋白的表达及存活
目的:研究证实三七总皂甙能促进骨髓间质干细胞向神经细胞的横向分化,但分化细胞能否表达神经递质?存活时间是否延长?采用三七总皂甙对大鼠骨髓间质干细胞进行体外诱导,并检测分化的神经元样细胞表型特征、凋亡蛋白表达及存活情况.方法:实验于2006-01/2007-01在安徽医科大学实验中心完成.①实验方法:脱颈椎法快速处死大鼠,取股骨,剪断骨两端,IMDM冲洗骨髓腔,分离培养骨髓间质干细胞.取第5代细胞,用含体积分数为0.2胎牛血清、1 mmol/L 2巯基乙醇的完全培养液预诱导24 h,然后更换含不同诱导剂的无血清培养液诱导分化,设立3组:三七总皂甙组的诱导剂含2.0 g/L 三七总皂甙,2巯基乙醇+丁羟茴醚组的诱导剂含200 μmol/L 丁羟茴醚+10 mmol/L 2巯基乙醇,空白对照组不添加任何诱导剂.②实验评估:观察诱导期间细胞形态变化及分化细胞的存活时间.免疫细胞化学检测分化的神经元样细胞表型特征及凋亡相关蛋白bcl-2、bax的表达情况,并采用TUNEL法检测细胞凋亡指数.结果:①加入三七总皂甙诱导后约2 h可见细胞胞质收缩,逐渐有突起形成.约5 h后多数细胞呈明显的神经元样细胞形态,胞体呈圆形,突起较长,双极或多极形,在突起末端出现分支,部分相邻细胞的突起连接成网.②2巯基乙醇+丁羟茴醚诱导8 h后即有部分细胞贴壁,但不牢靠,1 d后约半数细胞死亡,3 d后仅少数细胞存活.三七总皂甙诱导后细胞死亡现象缓慢发生,1周内少数神经元样细胞出现漂浮、崩解,三四周仍有部分细胞存活.③分化细胞能够表达神经干细胞标志巢蛋白、神经元标志神经元特异性烯醇化酶、神经递质标志乙酰胆碱酯酶及γ-氨基丁酸,不表达酪氨酸羟化酶及胶质纤维酸性蛋白.④诱导后12,24 h与2巯基乙醇+丁羟茴醚组比较,三七总皂甙组分化细胞bcl-2蛋白阳性表达率明显升高(P＜0.01).bax蛋白阳性表达率显著降低(P＜0.01),细胞凋亡指数明显降低(P＜0.01).结论:三七总皂甙在体外能够有效诱导大鼠骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞,表达神经递质表型特征;与传统的诱导因子比较,可延长细胞存活时间,且具有抗细胞凋亡作用.
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胚胎干细胞体外分化为功能性肝细胞过程中肝细胞生长因子诱导系统中瘀胆血清的促进作用
背景:目前各种诱导胚胎干细胞(ESC)分化为肝细胞的方法中,大多忽略了对分化细胞功能的诱导与鉴定.是否表达肝细胞功能应作为ESC向肝细胞分化的鉴定指标之一.目的:观察在肝细胞生长因子(HGF)体外诱导小鼠胚胎干细胞向肝细胞分化的体系中,瘀胆血清病理环境对分化细胞表达肝细胞功能的作用.设计:观察对比,体外细胞学实验.单位:中山大学附属第二医院肝胆外科.材料:实验于2004-10/2007-02在中山大学附属第二医院医学研究中心完成.小鼠E14 ESC系由中山大学干细胞与组织工程中心提供;SD大鼠20只,鼠龄2周,购自中山大学动物实验中心.实验过程中对动物的处置符合动物伦理学要求.方法:对SD大鼠施以胆总管结扎切断手术,制作瘀胆模型,饲养10 d后取全血制备瘀胆血清.用悬滴培养ESC发育5～7 d的拟胚体,将其离散细胞种植于不同的分化体系,分别进行自主分化、20 μg/L肝细胞生长因子、5%瘀胆血清+20 μg/L肝细胞生长因子诱导分化.主要观察指标:①倒置显微镜下动态观察细胞形态变化.②分化4周时进行白蛋白、甲胎蛋白、CK18/19、糖原及吲哚氰绿和荧光二乙酯染色.③采用相应试剂盒每3天检测细胞合成白蛋白、三酰甘油及尿素氮功能.结果:①ESC自主分化难以控制,分化为3个胚层的细胞.肝细胞生长因子促进ESC向内脏内胚层和中胚层(心肌)分化,但两者仅能表达低水平的肝细胞特异性功能.②引入瘀胆血清的肝细胞生长因子诱导体系中ESC能分化为较为形态均一的多角形细胞,其糖原、吲哚氰绿和荧光二乙酯染色均为阳性;白蛋白、三酰甘油和尿素氮合成能力显著高于自发分化和肝细胞生长因子诱导结果(P＜0.05～0.01).结论:采用瘀胆血清体外模拟病理性微环境可促进HGF诱导的ESC源性肝细胞表达高水平的肝特异性代谢功能.
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不同年龄大鼠骨髓基质细胞端粒酶活性及端粒长度的变化
目的:端粒酶活性表达可能是干细胞维持其自我复制能力的分子基础,然而对于这种酶活性表达在骨髓基质细胞端粒维持和细胞增殖中的作用及其随年龄增长的变化规律还知之甚少.观察不同年龄大鼠骨髓基质细胞端粒酶活性和端粒长度的变化情况.方法:实验于2005-10/2006-08在解放军163医院神经外科实验室进行.①实验材料:清洁级SD大鼠,雌雄不拘,体质量120～150 g,购自中南大学湘雅医学院实验动物中心.根据大鼠年龄不同分为1月龄组、3月龄组、6月龄组、1年龄组、2年龄组.②实验方法:采用密度梯度离心法分离培养不同年龄大鼠骨髓基质细胞,观察各组细胞形态学差别,采用MTT法绘制细胞生长曲线.③实验评估:采用流式细胞仪检测细胞周期,PCR-ELISA法检测各组细胞端粒酶活性,Southern印迹法测量各组细胞端粒末端限制性片段长度.结果:①不同年龄各组骨髓基质细胞形态上无明显差别.②各组细胞增殖缓慢,不同年龄组大鼠骨髓基质细胞生长周期显示,G0/G1期细胞多,G2/M期和S期细胞较少.各组间无明显差别.③1月至2年组大鼠骨髓基质细胞端粒酶活性分别为0.651、0.676、0.615、0.815、0.672,各组间差异无显著性意义.④1月至2年组大鼠细胞端粒末端限制性片断长度分别为24.4、22.56、23.56、22.79、22.65 kb.除1月组稍长于其他各组外,其余各组间端粒末端限制性片断长度无明显差别.结论:①随着年龄的增长,骨髓基质细胞稳定表达端粒酶活性.②骨髓基质细胞能维持端粒长度,不随年龄增长而缩短,这可能与细胞表达端粒酶活性有关.
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经冠状动脉自体骨髓单个核细胞移植对扩张型心肌病兔心肌组织病理学的影响
目的:骨髓干细胞在扩张型心肌病动物模型中具有向心肌样细胞和血管内皮细胞分化的潜能.评价经冠脉自体骨髓单个核细胞移植治疗对扩张型心肌病兔心肌组织病理学影响及心功能的变化.方法:实验于2006-09/2007-03在复旦大学附属华山医院心血管研究室完成.①实验材料:3月龄雄性新西兰兔25只,随机数字表法分为正常组5只、模型组10只、冠脉移植组10只.②实验方法:冠脉移植组、模型组兔经耳缘静脉注射盐酸阿霉素建立扩张型心肌病模型.冠脉移植组10只兔麻醉后以髂骨为穿刺点,共采集15 mL混有肝素生理盐水的骨髓液,密度梯度离心得到自体骨髓单个核细胞悬液2 mL,其中5只兔的骨髓单个核细胞悬液行DAPI标记,经塑性的4F造影导管,模拟临床冠脉内输注细胞悬液.③实验评估:术后4周通过检测血流动力学指标评价心功能的改变;苏木精-伊红、天狼猩红染色观察心肌组织形态学特点,透射电镜观察心肌组织超微结构的改变;TnT间接免疫荧光检测心肌组织DAPI标记情况,以评价骨髓单个核细胞的分化和转归.结果:①血流动力学指标的测定:与基础值比较,细胞移植4周后模型组兔血流动力学指标无明显改变(P＞0.05),而冠脉移植组心功能显著改善(P＜0.05).②心肌组织形态学观察:扩张型心肌病兔心肌纤维排列紊乱,坏死区大量淋巴细胞浸润,细胞间隙增宽,心肌间质面积增大.③心肌组织超微结构的变化:造模结束后,模型组心肌细胞线粒体肿胀,肌丝断裂,心肌细胞核呈锯齿状,心肌间质中淋巴细胞浸润,胶原纤维增多.细胞移植4周后,冠脉移植组出现线粒体堆积现象,亦存在巨噬细胞浸润和胶原纤维轻度增生,未发现心肌组织中存在植入的特殊类型细胞.④心肌组织TnT间接免疫荧光检测:DAPI标记的骨髓单个核细胞在心肌组织中富集,血管腔内不存在.结论:①经冠脉自体骨髓单个核细胞移植治疗阿霉素扩张型心肌病兔,利于植入细胞在心肌组织中富集,改善心功能.②透射电镜尚无法证实心肌组织中存在外来的移植细胞.
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兔骨髓间充质干细胞经Ad-TGFβ1重组腺病毒载体转染定向分化为软骨细胞
目的:通过软骨组织工程与基因治疗相结合的技术,利用腺病毒载体将转化生长因子β1基因导入兔骨髓间充质干细胞,使其诱导靶细胞定向分化为软骨细胞.方法:实验于2004-03/2006-03在徐州医学院完成.①实验方法:兔麻醉后自胫骨上端抽取骨髓,体外分离培养骨髓间充质干细胞.取第2代细胞,以1×104/cm2接种,达70%融合时分为3组:Ad-TGFβ1转染组采用H-DMEM无血清培养基,加入刚解冻的Ad-TGFβ1液30 μL,地塞米松100 nmol/L,维生素C 50 mg/L;Ad-GFP对照组采用H-DMEM无血清培养基,加入Ad-GFP腺病毒,地塞米松100 nmol/L,维生素C 50 mg/L;空白对照组采用H-DMEM完全培养基,不外加任何试剂或药品.②实验评估:倒置显微镜逐日观察细胞生长情况.分别于转染后7,14,21,28 d检测细胞内蛋白多糖、转化生长因子β1、Ⅱ型胶原的表达.结果:①细胞形态学观察:Ad-TGFβ1转染后7 d,集落中的细胞呈放射状向周围扩展,均一性好,呈长梭形,紧密排列似漩涡状,生长速度明显增快,细胞密度明显增高.②转染后细胞内蛋白多糖的检测:Ad-TGFβ1转染后14 d胞浆呈紫蓝色,异染性明显,胞核清晰,可见核仁.转染后28 d细胞明显老化,但胞浆中仍可见紫蓝色异染.其余两组均未见明显的异染性.③转染后转化生长因子β1的表达:Ad-TGFβ1转染组细胞中转化生长因子β1呈强阳性表达,其余两组几乎检测不到转化生长因子B1的表达.④转染后细胞内Ⅱ型胶原的表达:Ad-TGFβ1转染后7 d胞浆中Ⅱ型胶原呈弱阳性表达,转染后14,21 d呈强阳性表达,转染后28 d表达有所降低.其余两组几乎不表达Ⅱ型胶原.结论:经Ad-TGFβ1重组腺病毒载体转染,兔骨髓间充质干细胞可定向分化为软骨细胞,是获得软骨组织工程种子细胞的方法之一.
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小儿脑损伤与干细胞移植治疗
学术背景:小儿脑损伤后多采用高压氧、神经营养药物、细胞因子、中药及针灸等方法来治疗,但对于已经完全损伤的神经细胞,治疗效果很差.近年来随着干细胞移植的研究不断深入,为治疗此类疾病带来了希望.目的:介绍干细胞的生物学特性及移植的研究现状,展望其在小儿脑损伤治疗领域潜在的发展方向.检索策略:由作者应用计算机检索Proquest和Elsevier数据1992-01/2007-04相关文献,检索词为"alstemcells transplan",限定语言种类为"English";同时检索维普中文期刊数据库、万方数据库1992-01/2007-06相关文献,检索词为"干细胞移植",限定语言种类为中文.纳入标准:内容与神经干细胞、间充质干细胞移植有关并发表早权威杂志.排除标准:较陈旧及重复文献,与小儿脑损伤及干细胞移植无关的文献.文献评价:共收集到56篇相关文献,排除26篇,30篇文献符合标准,其中13篇是综述和述评类文献,其余17篇为基础研究.30篇中11篇介绍干细胞的基本生物学特性,4篇与干细胞移植途径相关,15篇关于干细胞移植与缺氧缺血性脑损伤有关的文献.资料综合:①神经干细胞可分成内源性和外源性,利用两者的互动效应及神经干细胞多潜能分化的特点,神经干细胞移植可能作为挽救性治疗手段,修复与防治小儿脑损伤.②间充质干细胞一定条件下可分化出具有生理功能的神经细胞,异体移植无免疫排斥反应,可通过血脑屏障.目前对胚胎干细胞、骨髓间充质干细胞、脐血间充质干细胞移植研究较多.结论:干细胞移植已经在动物实验上取得了令人鼓舞的进展,但仍有一些问题需要解决.随着分子生物学、发育生物学、临床学科等学科的相互协作和研究方法的进一步完善,干细胞移植将对于小儿脑损伤的治疗具有重要意义.
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造血干细胞移植与临床感染的防治
学术背景:造血干细胞移植技术在临床上已得到广泛应用,移植后感染是关系到移植成败的重要因素.目的:探讨造血干细胞移植后各阶段的感染的特点、预防及治疗,以进一步减低造血干细胞移植后感染的发生率及死亡率.检索策略:由作者应用计算机检Medline 1994-01,2007-05关于造血干细胞移植及移植后感染的文章.检索词为"hematopoietic stem cell transplantation,infection",限定语言种类为"English";同时检索中国期刊全文数据库1994-01/2007-05相关文章,检索词"造血干细胞移植,感染,防治",限定语言种类为中文.纳入标准:随机对照研究;实验或临床研究包含平行对照组.排除标准:重复性研究文献评价:初检得到212篇文献,初审后选取与造血干细胞移植后感染有关的文章126篇,删除明显无关及相关性不强的文章,进一步查找全文,29个实验符合标准,予以纳入.29个研究包括324例患者和140个实验动物,分别阐述了造血干细胞移植后感染的原因、途径、特点、种类及各种感染的预防及治疗措施.资料综合:造血干细胞移植后感染发病隐匿,由于患者免疫力低下,感染不易控制,在不同阶段致病菌的种类有所不同,细菌感染普遍,在移植后各个时期均可出现,真菌感染和病毒感染致死性强,故预防和治疗感染至关重要,其治疗分为预防治疗、抢先治疗、经验性治疗和针对治疗.结论:造血干细胞移植后感染的治疗已成为影响移植疗效的一个重要原因,及早的诊断及正确的治疗将成为移植后感染治疗成功的关键.
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受致死剂量照射模型小鼠输注骨骼肌卫星细胞后造血功能的变化
背景:骨骼肌卫星细胞是一种具有增殖、分化潜能的肌源性干细胞.近年,国外已有报道骨骼肌细胞具可被某种特定微环境因子激活分化为造血干细胞,从而具有造血重建的潜能.目的:初步验证肌源性的成体干细胞-骨骼肌卫星细胞分化为造血干细胞的能力.设计:验证性动物实验.单位:天津中医药大学基础医学院组胚教研室.材料:选用雌性昆明种成年小鼠65只,体质量25～28 g.出生5 d昆明种乳鼠5只,均由北京大学医学部实验动物中心提供.方法:实验于2001-08/2003-08在北京大学医学部人体解剖学与组织胚胎学系细胞培养室完成.胶原酶、胰蛋白酶消化分离5只乳鼠骨骼肌卫星细胞,分离5只成年昆明种小鼠骨髓单个核细胞.取成年雌性小鼠60只作为受体,用60Co γ8.0 Gy照射,然后随机分为4组:对照组不做任何处理;培养液输注组小鼠尾静脉注射DMEM,F-12培养液;卫星细胞输注组小鼠尾静脉注射卫星细胞悬液0.3 mL(细胞浓度1×109 L-1);骨髓细胞输注组小鼠尾静脉注射骨髓细胞悬液0.3 mL(细胞浓度1×109 L-1).主要观察指标:①观察各组小鼠14 d存活率.②照射后14 d处死存活下来的受体小鼠:肉眼计数脾脏表面结节数;对骨髓单个核细胞涂片进行Wright-Girmesa染色.结果:①脾集落形成单位的测定:照射后14 d,卫星细胞注射组小鼠脾结节数与骨髓细胞注射组比较,差异无显著性意义(P＞0.05).②骨髓单个核细胞组织学鉴定结果:卫星细胞输注组与骨髓细胞输注组骨髓单个核细胞涂片中有相对较多的早期造血细胞出现,其形态符合早期造血细胞的生物学特性.③被照射鼠的存活情况:对照组和培养液输注组小鼠在被照射后9～13 d全部死亡.照射后14 d,卫星细胞输注组和骨髓细胞输注组分别有8和13只鼠存活.结论:骨骼肌卫星细胞具有诱导分化为造血干细胞的功能.
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非亲缘外周血造血干细胞移植治疗重型β-地中海贫血1例
患儿,女,4岁,体质量19 kg.生后4个月开始进行性面色苍白伴巩膜黄染,血红蛋白65 g/L,白细胞和血小板均正常,血红蛋白电泳血红蛋白A 48.1%、血红蛋白A2 4.2%、抗碱血红蛋白47.7%,基因型为β地贫纯合子,诊断为重型β地中海贫血,以间断大量输血维持生命.于2005-12-09在厦门大学附属中山医院血液科接受非亲缘性外周血干细胞移植.预处理方案采用常规氟达拉滨、白消胺、环磷酰胺三药联合方案,以环孢菌素A、霉酚酸酯、抗胸腺淋巴细胞免疫球蛋白联合预防移植物抗宿主病,供受者人类白细胞抗原高分辨全相合,ABO血型次要不合(O-A),输入CD34+干细胞11.4×106/kg.植入成功,移植后12 d中性粒细胞＞0.5×109 L-1,移植后37 d血小板＞50×109 L-1,移植后35 d患者血型检测转变为供者血型,患儿血红蛋白达到100 g/L的时间是28 d,移植后患儿未再输血,血红蛋白维持130 g/L以上,整个移植过程顺利,未出现严重感染和移植物抗宿主反应,随访18个月,患儿生活正常,发育良好.
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新等位基因HLA-B*5812的认定
应用流式反向PCR-SSO和PCR-SSP基因分型技术发现可能的HLA新等位基因,对PCR产物进行HLA基因分型、DNA序列分析及克隆测序.发现一个样本的HLA-B位点结果异常,其核苷酸序列与已知所有HLA-B位点等位基因序列均不一致,与同源性高的等位基因B*5801的差异在于第2外显子区域中的第69位碱基发生了G→T的替换,即"GCA→TCA",结果改变了第24位密码子编码的氨基酸,即"丙氨酸→丝氨酸".判断该等位基因为HLA-B位点的一个新等位基因,已于2006年4月被WHO HLA因子命名委员会正式命名为HLA-B*5812.
