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X染色体Amelogenin等位基因缺失的研究
目的 探讨采用Amelogenin基因常规Sullivan106/112 bp体系进行性别鉴定时X染色体Amelogenin等位基因片段(Amel-X)缺失的原因以及缺失后对法医物证性别鉴定和临床疾病诊断的影响.方法 采用Sullivan212/218 bp和Haas-Rochholz80/83 bp引物体系对Amel-X缺失的样本进行验证,并对缺失的Amel-X进行序列分析.结果 采用Sullivan212/218 bp和Haas-Rochholz80/83 bp引物体系分型时均可重获缺失的等位基因.测序分析在Sullivan106/112 bp体系的正向引物结合区检出3种点突变,包括分别位于3'端第2位、第13位的单点突变以及第2位和第13位同时发生的杂合多点突变.结论 引物结合区点突变导致的无效扩增是Amel-X等位基因缺失的原因,这在实践中会干扰性别鉴定,需引起重视.
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釉基质蛋白对牙周膜细胞增殖和牙骨质相关蛋白基因表达的影响
目的 通过研究釉基质蛋白(enamel matrix proteins,EMP)对人牙周膜细胞增殖及牙骨质相关蛋白基因表达的影响,探讨EMP促进牙骨质形成的机制.方法 分别用质量浓度为0(对照组)、50、100、200、300 mg/L的EMP作用于培养的人牙周膜细胞(periodontal ligament cells,PDLC),在培养的第1、3、5、7天用甲基噻唑基四唑法检测细胞增殖活性；在培养的第7天用荧光实时定量反转录聚合酶链反应法检测各组细胞牙骨质附着蛋白(cementum attachment protein,CAP)和牙骨质蛋白23(cementum protein-23,CP-23)mRNA表达量.结果 EMP质量浓度在50 ～ 200 mg/L范围内可以促进人PDLC增殖,在300 mg/L时抑制细胞增殖；EMP质量浓度为100、200 mg/L时可以显著促进CAP mRNA(分别为4.661 ±0.154、5.923±0.788)和CP-23mRNA的表达(分别为1.222±0.089、3.795±0.640)与对照组(CAP:1.006±0.062,CP-23:1.012±0.163)相比差异均有统计学意义(P＜0.05),且以200 mg/L EMP的促表达效果佳.结论 EMP在一定浓度范围内能促进人PDLC增殖及CAP和CP-23基因表达,提示EMP可能通过促进细胞增殖和牙骨质相关蛋白的表达促进牙骨质的形成.
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釉蛋白在大鼠牙胚釉质发育中的表达特征
目的:观察釉蛋白(enamelin,En)在大鼠牙胚发育过程中的表达,探讨其可能的生物学功能.方法:采用免疫组织化学方法,检测出生后第1,3,7,10,14天SD大鼠第一磨牙牙胚中釉蛋白的表达特征.结果:大鼠出生后第1～14天釉蛋白在成釉细胞中的表达随细胞的分化、基质分泌而变化.釉蛋白在出生后第1天的成釉器前成釉细胞中表达为阴性,但在沿牙尖斜面的进入分泌期成釉细胞中表达阳性;在出生后3天的分泌期成釉细胞胞浆中表达阳性,在刚分泌形成的釉牙本质界呈强阳性表达;在出生后第7天的分泌期成釉细胞胞浆中表达阳性,在未矿化完全的釉质基质中为强阳性表达,且釉蛋白随矿化的程度不同而表达强弱不同;在出生后第10天的大鼠牙胚中釉蛋白仅在成熟期成釉细胞中有较弱的阳性表达,在矿化变薄的剩余釉质基质中仍有阳性表达;在出生后第14天的大鼠牙胚中,釉蛋白表达阴性.结论:釉蛋白由成釉细胞分泌,初分布于釉牙本质界,位于发育中的釉质全层,随釉质成熟而逐渐减少,至釉质完全形成后而表达停止,提示釉蛋白在釉质形成中可能有重要作用.
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釉基质蛋白对人牙周膜细胞生物学影响的体外研究
目的:了解釉基质蛋白对人牙周膜细胞的增殖、矿化、蛋白合成及超微结构的影响.方法:组织块法原代培养人牙周膜细胞,茜素红染色进行细胞表型的鉴定；采用细胞增殖试剂盒及流式细胞仪检测釉基质蛋白对人牙周膜细胞增殖及细胞周期的影响；BCA蛋白定量试剂盒分析釉基质蛋白对牙周膜细胞蛋白合成的影响；并用透射电镜观察牙周膜细胞超微结构的改变；免疫组化染色观察釉基质蛋白作用下对牙周膜细胞骨涎蛋白和骨桥蛋白表达的影响.结果:釉基质蛋白可促进牙周膜细胞增殖,促进牙周膜细胞DNA的合成,使牙周膜细胞周期的G1期细胞所占百分比降低,而S期细胞所占百分比升高,并可提高牙周膜细胞蛋白总量,透射电镜观察可见经釉基质蛋白作用后的牙周膜细胞胞浆丰富,与蛋白合成相关细胞器粗面内质网及高尔基体发达,釉基质蛋白可促进牙周膜细胞矿化相关蛋白骨涎蛋白和骨桥蛋白的表达.结论:釉基质蛋白能促进牙周膜细胞增殖、蛋白合成及矿化相关蛋白骨涎蛋白和骨桥蛋白的表达,促进牙周组织的再生.
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自体牙周膜细胞和釉基质蛋白修复猴下后牙Ⅲ度根分叉病变
目的:应用自体牙周膜细胞(periodontal ligament call,PDLC)结合釉基质蛋白(enamel matrix derivative,EMD)植入人工制备的猴Ⅲ度根分叉病损内,探讨此牙周组织工程技术治疗重度根分叉病变的可行性.方法:人工制备3只食蟹猴双侧下颌第二双尖牙、第一磨牙和第二磨牙的慢性Ⅲ度根分叉病损.拔除第一双尖牙,分离牙周膜,取体外培养的第3代PDLC再与牛无机矿化骨胶原块复合培养后植入病损内.3只猴的一侧第二磨牙植入PDLC/牛无机矿化骨胶原块+EMD为A组;对侧同名牙植入牛无机矿化骨胶原块+EMD为B组;一侧第一磨牙植入PDLC/牛无机矿化骨胶原块为C组,对侧同名牙植入牛无机矿化骨胶原块为D组;一侧第二双尖牙置入EMD为E组;对侧同名牙为空白对照组(F组).所有部位均覆盖胶原膜,每组3颗牙,分别于植入材料前和植入后6个月记录牙颊舌侧根分叉部位的牙周袋探诊深度(periodontal depth,PD)和附着水平(attachment level,AL),拍摄X线片.结果:植入材料后6个月,除少数根分叉暴露的病损外,多数根分叉处的PD和AL有不同程度的改善,依次为E组和F组(第二双尖牙),A组,C组,B组和D组.修复的牙槽骨几乎充满第二双尖牙的根分叉,甚至可见较清晰的骨硬板,其他牙位的牙槽骨虽有一定程度的修复,但在缺损的冠方仍留有较明显的密度减低影.结论:PDLC和EMD均可增加Ⅲ度根分叉病变区牙周组织的修复,两者联合应用效果更好.Ⅲ度根分叉病变的治疗效果不仅取决于植入的细胞和材料,而且受多种因素的影响,尤其是根分叉的大小和牙龈瓣能否很好覆盖病损是影响愈合的重要因素.
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小鼠重组釉蛋白基因稳定表达细胞系的建立
目的:构建小鼠重组釉蛋白基因的真核表达系统,并建立稳定表达该蛋白的细胞系.方法:取初生小鼠牙胚组织,提取 RNA,用 RT-PCR 技术扩增釉蛋白基因片段,经双酶切后克隆至真核表达载体 pcDNA3.1TM/myc-His(-)B 上, 转化大肠杆菌E.coli DH5α, 中提质粒,将该重组表达质粒转染至 HEK 293A 细胞,用 G418 筛选出阳性克隆,并检测釉蛋白的表达水平.结果:通过测序表明,小鼠釉蛋白基因被成功地连接到了真核表达载体上.将该表达系统转染 HEK 293A 细胞后,进行 Western Blot 检测,证明其中有相对分子质量约 32 000 的釉蛋白表达.结论:成功构建了小鼠重组釉蛋白真核表达载体,建立了稳定细胞系,为获得高纯度的釉蛋白,为进一步研究蛋白质功能奠定了基础.
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人成釉蛋白抗体的制备及组织表达特异性
目的:制备抗人成釉蛋白抗体,观察成釉蛋白在各组织中的表达.方法:实验于2002-03在解放军第四军医大学基础部生物化学与分子生物学教研室完成.以重组、纯化的成釉蛋白C端肽为抗原,混入完全/不完全弗氏佐剂,免疫新西兰大白兔,经5次免疫后,颈动脉取血,分离血清并用饱和硫酸铵纯化,制备兔抗人成釉蛋白多克隆抗体,用双向免疫扩散试验和ELISA检测抗体的效价.用Western Blot检测人成釉蛋白的组织表达特异性.结果:①ELISA检测结果:表明兔抗人成釉蛋白多克隆抗体效价达到1:10 000.②Western Blot显示:成釉蛋白在人牙胚组织总蛋白中有特异性表达,相对分子质量约为65 000,在脑、心、肝、脾、肺、肾、胰腺、胸腺、骨骼肌等组织中未见表达条带.结论:制备了抗人成釉蛋白抗体,为研究成釉蛋白在人牙胚中的组织表达以及利用抗体纯化蛋白提供了基础,从蛋白水平证实成釉蛋白为牙胚组织特异性蛋白,并证实人牙胚组织中的成釉蛋白相对分子质量约为65 000.
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釉基质蛋白治疗牙周骨下袋缺损促进形成牙周硬组织的能力:数字化标准系列放射学观察
目的:观测分析釉基质蛋白治疗牙周骨下袋缺损前后拍摄的数字化标准系列X线片,以评估釉基质蛋白促进形成牙周硬组织的能力.方法:选择2000-01/2002-01上海第二医科大学附属第九人民医院口腔内科收治的无全身系统性疾病的慢性牙周炎患者24例,共40个牙位.按照牙位随机分为3组,釉基质蛋白组17个牙位,空白对照组13个牙位,甲壳素膜组10个牙位.各组患者在患牙区行改良Widman翻瓣术,釉基质蛋白组骨缺损区根面放置含釉基质蛋白的甲壳素膜,甲壳素膜组放置甲壳素膜,空白对照组不放任何材料仅做术区清创.各组分别于术前和术后6个月测定数字化X影像指标:釉牙骨质界到牙槽嵴顶的距离、釉牙骨质界到骨缺损底部的距离、牙槽嵴顶到骨缺损底部的距离.所有测量值的单位均由Cygnus系统的默认值换算为mm.结果:实验纳入40个牙位,全部进入结果分析.各组各项指标治疗前与治疗后6个月差值的比较:与釉基质蛋白组比较,甲壳素膜组和空白对照组治疗前后釉牙骨质界到牙槽嵴顶的距离差值均有所升高[(0.13±0.28),(0.20±0.41),(0.20±0.35)mm],釉牙骨质界到骨缺损底部的距离、牙槽嵴顶到骨缺损底部的距离差值均明显下降[(1.40±1.16),(0.35±0.56),(0.61±0.72)mm,P＜0.05;(1.53±1.17),(0.55±0.79),(0.81±0.76)mm;P＜0.01].结论:釉基质蛋白治疗能够使骨缺损区的骨质修复量及骨缺损深度明显减少,可显著促进牙周骨组织的再生,充分显示了釉基质蛋白治疗牙周骨下袋缺损的优势.
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牙胚组织中成釉蛋白表达免疫组织化学和原位杂交的特点
目的:观察人牙胚组织中成釉蛋白的表达特点.方法:实验于2002-02/04在解放军第四军医大学口腔内科实验室完成.取孕5个月流产男性胎儿(产妇知情同意),截取上、下颌骨,常规方法制备人牙胚组织石蜡切片.用兔抗人AMBN多克隆抗体,对人牙胚组织石蜡切片和正常狗牙周组织石蜡切片进行免疫组织化学染色.标记人成釉蛋白cDNA探针,对人牙胚组织石蜡切片进行原位杂交.结果:①免疫组织化学染色发现成釉蛋白由内釉上皮细胞在分化为成熟成釉细胞前开始表达,分泌期成釉细胞高度表达并持续整个釉质形成期,新形成的牙釉质染色阳性;成牙本质细胞在分泌牙本质基质之前开始表达成釉蛋白,在牙本质形成过程中成牙本质细胞持续表达成釉蛋白,呈弱阳性,前期牙本质中呈弱阳性染色;上皮根鞘细胞染色阳性.狗牙周组织染色发现牙骨质表层细胞呈强阳性染色,新形成的牙骨质中可见阳性染色颗粒,呈网状分布.②对人牙胚组织石蜡切片的原位杂交显示,成釉蛋白在成釉细胞、成牙本质细胞、上皮根鞘细胞中有表达,表达部位与免疫组织化学结果一致.结论:内釉上皮首先表达成釉蛋白,之后前成牙本质细胞达成釉蛋白.成釉细胞、成牙本质细胞、上皮根鞘细胞表达成釉蛋白.
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釉基质蛋白预防鼠再植牙根吸收作用的磨片观察
目的探索釉基质蛋白对再植牙根吸收的预防作用,解决牙再植后根吸收并终导致牙齿脱落现象.方法通过随机、对照、双盲法等流行病学方法,将釉基质蛋白应用于 SD大鼠再植牙的根面和牙槽窝中,在 2和 4周时间点取标本制成牙根磨片,观察牙根面的吸收情况并对结果进行统计学分析.结果第 1,2组(腹壁异位移植)牙根面吸收情况, 2周实验组与 2周对照组比较χ 2=2.051, P >0.05, 2周实验组与 4周对照组比较χ 2=4.021, P< 0.05, 2周实验组与 4周对照组比较χ 2=4.211, P< 0.05, 4周实验组与 4周对照组比较χ 2=7.853, P< 0.05;第 3,4组(干燥 30 min再植)牙根面吸收情况, 2周实验组与 2周对照组比较χ 2=2.222, P >0.05, 4周实验组与 4周对照组比较χ 2=4.013, P< 0.05, 2周实验组与 4周对照组比较χ 2=3.130, P >0.05, 4周实验组与 4周对照组比较χ 2=5.230, P< 0.05;第 5,6组(去牙周膜再植)牙根面吸收情况, 2周实验组与 2周对照组比较χ 2=2.296, P >0.05, 4周实验组与 4周对照组比较χ 2=5.698, P< 0.05, 2周实验组与 4周对照组比较χ 2=1.569, P >0.05, 4周实验组与 4周对照组比较χ 2=4.528, P< 0.05.结论釉基质蛋白能有效降低再植牙根吸收的发生率.
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釉基质蛋白在牙周组织再生过程中对T细胞增殖及其亚群的影响
目的:釉基质蛋白具有诱导牙周组织再生的作用,而且釉基质蛋白在同属种类之间具有明显的同源性,并在进化中保持较高的遗传保守性.在体外观察釉基质蛋白对免疫细胞功能的影响,评价釉基质蛋白的免疫原性.方法:术前采取10例伴牙周骨缺损的牙周炎患者的外周血淋巴细胞,与4组不同含量的EMPs(对照组为植物血凝素和甲壳素)进行体外培养,分别于3 d后检测CD3,CD4,CD8 T细胞亚群百分比和CD4/CD8比值,并用MTT法测细胞增殖所得的A值.结果;各组测得的CD3,CD4,CD8 T细胞亚群百分比和CD4/CD8比值差异无显著性意义(P＞0.05).淋巴细胞增殖的实验统计结果显示,阳性对照组培养后3 d测得的A值与培养前相比差异有显著性意义(P＜0.01,t=7.223),其余各组间测得的培养前和培养后的A值的差异均无显著性意义(P＞0.05).结论:不同含量的EMPs对淋巴细胞的增殖和T淋巴细胞亚群没有产生明显的影响,釉基质蛋白具有较低的免疫原性,具有临床应用价值.
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釉基质蛋白骨诱导作用的实验探讨
目的:观察提取的猪釉基质蛋白是否具有骨诱导作用.方法:采用大鼠腓肠肌肌袋内成骨模型观察釉基质蛋白是否具有骨诱导作用.实验分为2组,采用自体对照,实验组埋入以藻酸丙二醇酯为载体的釉基质蛋白,对照组埋入藻酸丙二醇酯.1个月后处死动物.结果:经大体及组织学观察,大鼠腓肠肌肌袋埋植处瘢痕愈合,未见有骨样或软骨样组织形成.结论:提取的猪釉基质蛋白未具有骨诱导作用.
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釉鞘蛋白在小鼠牙胚发育中的时空表达
目的:观察釉鞘蛋白(ameloblastin)在小鼠牙胚发育中表达的时空顺序及分布,探讨釉鞘蛋白在釉质发育矿化中的作用.方法:采用原位杂交的实验方法,观察釉鞘蛋白在牙胚发育的增殖分化期、分泌初期及分泌期的表达.结果:釉鞘蛋白mRNA在成釉细胞增殖分化期表达为阴性,分泌初期细胞内及新生釉基质中开始出现弱阳性表达;至分泌期,细胞内及新生釉基质中均呈强阳性表达.成熟釉质中无釉鞘蛋白mRNA的阳性表达.结论:本实验从分子水平上进一步明确了釉鞘蛋白的时空表达,并推测釉鞘蛋白可能介导了釉质的发育矿化,它与牙齿发育、釉基质矿化反应等过程密切相关.
