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心肌微环境与5-氮杂胞苷诱导脂肪间充质干细胞心肌分化的差异
目的 探讨体内心肌微环境及体外5-氮杂胞苷(5-aza)诱导脂肪间充质干细胞分化为心肌样细胞的作用差异.方法 取小鼠腹股沟的皮下脂肪组织,分离培养脂肪间充质干细胞(ADMSCs),对其进行表面标记和成骨、成脂分化能力鉴定.选取生长状态良好的第3代ADMSCs,分为5-aza体外诱导组、体内心肌移植组,体外诱导3周以及体内移植1周后,采用免疫荧光技术检测特异性心肌肌钙蛋白T(cTnT)的表达.结果 两种诱导方法ADMSCs均表达cTnT,5-aza诱导组3周表达率(33.33±3.79)％,移植组1周表达率(42.93 ±4.04)％,移植组1周较5-aza诱导组3周具有更高的分化效率(P＜0.05).结论 体外5-aza化学诱导和体内心肌微环境均可使ADMSCs分化为心肌样细胞,但心肌微环境的诱导分化效率明显高于5-aza的作用.
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心肌微环境下丹酚酸B诱导MSCs向心肌样细胞分化的研究
[目的]复制心肌缺血-再灌注损伤模型,体外模拟心肌缺氧复氧微环境,观察丹酚酸B(SalB)诱导骨髓间充质干细胞(MSCs)向心肌样细胞分化的作用.[方法]通过向MSCs培养体系中添加心肌细胞裂解液的方法,体外模拟心肌微环境.自成年大鼠骨髓中分离MSCs,设对照组(A组)、心肌细胞裂解液(TJ)组(B组)、SalB组(C组)、TJ+SalB组(D组).培养4周,观察细胞形态,并采用免疫荧光技术检测cTnT的表达.[结果]除A组MSCs无明显的肌样细胞形成,各诱导组均有肌样细胞分化,D组与C组相比,cTnT表达率明显增高,差异有统计学意义.[结论]心肌细胞裂解液可以诱导MSCs向心肌样细胞分化；心肌微环境的建立有利于SalB诱导MSCs向心肌样细胞分化.
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体外模拟心肌环境诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞的分化
目的:以往研究将长有一层心肌细胞的半透膜放于骨髓间充质干细胞培养皿中,或用培养过心肌细胞的培养基来培养骨髓间充质干细胞,均未发现心肌细胞特异蛋白表达.为此体外模拟心肌微环境诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化,并与常规诱导剂5-氮杂胞苷的诱导效果进行比较.方法:实验于2007-03/09在山西医科大学中心实验室完成.①动物:Wistar大鼠20只,新生1 d龄Wistar乳鼠10只,均由山西医科大学动物房提供,清洁级,实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准.诱导剂5-氮杂胞苷为美国Sigma公司产品.②实验方法:自新生Wistar乳鼠心脏分离培养心肌细胞,取第1、2代制成1×109 L-1细胞悬液,-70 ℃放置4～5 h后融化,吸管吹打,反复3次,离心取上清,过滤后即为心肌细胞冻融液,以此作为培养基体外模拟心肌微环境.自成年Wistar大鼠骨髓分离骨髓间充质干细胞,取生长良好的第2代制成1×108 L-1细胞悬液,分为4组:血清对照组加入含15%胎牛血清的DMEM/F12培养基;5-氮杂胞苷组加入10μmol/L 5-氮杂胞苷37 ℃避光孵育24 h后,换DMEM/F12培养基继续培养;5-氮杂胞苷+心肌细胞冻融液组加入10μmol/L 5-氮杂胞苷诱导24 h后,在培养体系中加入相当于4倍骨髓间充质干细胞数量的心肌细胞冻融液;心肌细胞冻融液组加入相当于4倍骨髓间充质干细胞数量的心肌细胞冻融液.③实验评估:诱导1周后观察骨髓间充质干细胞的形态变化,利用免疫细胞化学技术鉴定心肌特异性肌钙蛋白T、连接蛋白43、α-横纹肌肌动蛋白、CD31的表达情况.结果:①体外模拟心肌微环境情况:培养7 d时心肌细胞形成细胞簇或细胞单层,呈放射状排列的同心圆状或峰谷样生长,细胞簇搏动呈明显同步性.传代后的心肌细胞仍具有自主收缩的特性.②骨髓间充质干细胞的体外诱导结果:诱导处理1周后,5-氮杂胞苷组多数细胞呈杆状,紧密平行排列生长,细胞体积变大,可见肌丝样结构形成;心肌细胞冻融液组细胞有聚集生长趋势,形成大量的子细胞,可见大量的肌丝样的结构;5-氮杂胞苷+心肌细胞冻融液组脱落或降解的细胞数明显少于5-氮杂胞苷组,也形成肌丝样结构,但部分细胞内有脂肪空泡形成.③免疫细胞化学鉴定结果:诱导培养1周后,血清对照组仅表达α-横纹肌肌动蛋白;5-氮杂胞苷组表达心肌特异性蛋白T、α-横纹肌肌动蛋白、连接蛋白43,其阳性率分别为20%,28%,25%,抗CD31染色呈阴性;心肌细胞冻融液组上述蛋白阳性表达率分别为23%,32%,28%,明显高于5-氮杂胞苷组(P < 0.05),同时抗CD31染色呈阳性;5-氮杂胞苷+心肌细胞冻融液组上述蛋白阳性表达率略低于心肌细胞冻融液组,抗CD31染色呈阳性.结论:①以心肌细胞冻融液体外模拟心肌微环境,可高效诱导骨髓间充质干细胞分化为心肌细胞.②部分骨髓间充质干细胞表达CD31,即可向血管内皮细胞分化,提示与5-氮杂胞苷单一的肌细胞诱导作用相比,心肌细胞冻融液更能提供一个心肌再生所需的自然条件.
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大鼠骨髓间充质干细胞表达心肌基因表型的时间依赖效应
背景:前期实验已经证实30%心肌培养上清是诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞的佳浓度.目的:在前期实验基础上,观察30%心肌培养上清条件下诱导骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞的时间依赖效应.设计、时间及地点:对比观察,于2007-08/2008-06在徐州市心血管病研究所完成.材料:健康成年SD大鼠,体质鼍180～220 g.方法:分离大鼠骨髓间充质干细胞和心肌细胞并在体外培养纯化.以1×108L-1的细胞密度种植心肌细胞,培养72 h后收集上清.将骨髓间充质干细胞的DMEM/F12培养基换为含有30%M199心肌细胞培养上清作为实验组,对照组仍将细胞接种在DMEM/F12培养基上继续培养.主要观察指标:30%心肌细胞培养上清诱导7,14,21d后,应用免疫细胞化学技术检测骨髓间充质干细胞中α-平滑肌肌动蛋白、β-肌动蛋白和心肌特异性肌钙蛋白T的表达.结果:30%心肌细胞培养上清诱导骨髓间充质干细胞后,细胞的形态没有改变,但与对照组相比,α-平滑肌肌动蛋白、β肌动蛋白和心肌特异性肌钙蛋白T的表达均呈阳性,其中以第14天的蛋白表达量高(P＜0.01).结论:30%心肌细胞培养上清诱导骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞的佳诱导时间是14 d.
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心肌微环境中Wnt11与BMP2协同作用促大鼠BM-MSCs分化为心肌样细胞的实验研究
目的 探讨在心肌微环境的旁分泌作用中,Wnt11与BMP2对促进大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow-mesenchymal stem cells,BM-MSCs)分化为心肌样细胞的协同作用.方法 建立Transwell共培养模型,将心肌细胞及转染Wnt11质粒的3T3细胞置于上层、BM-MSCs置于下层培养,前3天应用含50 μg/L Noggin(BMP抑制剂)培养液、第4天换用含0.5 μg/L BMP2的培养基诱导培养至第14天.根据不同诱导条件,培养细胞分为7组:阳性对照组(Heart组)、CM组、CM +BMP2组、CM+Wnt11组、Wnt11+BMP2组、CM+Wnt11+BMP2组、阴性对照组(BM-MSCs组).诱导培养结束后,采用RT-PCR方法,检测心肌特异性转录因子(Nkx2.5、GATA4、Mef2c)和成熟心肌细胞特异性基因(cTnI、ANP、α-MHC、β-MHC)mRNA表达水平.结果 RT-PCR结果显示,在心肌细胞旁分泌微环境下,Wnt11与BMP2协同作用组(CM+Wnt11+BMP2组)心肌特异性转录因子和成熟心肌细胞特异性基因的表达明显高于阴性对照组和其他共培养对照组,低于阳性对照组(P<0.05).结论 在心肌细胞旁分泌微环境中,Wnt11协同BMP2表达可提高BM-MSCs向心肌样细胞分化的效率.
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自体骨髓单个核细胞心肌内移植的实验研究
目的:观察自体骨髓单个核细胞(BMMNG)在动物模型心肌微环境中的存活和分化情况,探索该方法应用至临床的可行性.方法:选取成年新西兰兔共20只,随机分为四组.无菌状态下取胫骨骨髓15 ml,采用改进后的密度梯度离心法分离出BMMNC,荧光染料CFSE作细胞标记后备用.正中切口进胸,心肌内注入上述备用细胞悬液.于术后1、2、4、8周先后处死四组动物,取心脏标本冰冻切片在共聚焦显微镜下观察局部含荧光细胞的存活发育情况.结果:移植后4周可观察到与心肌纤维平行的荧光带,部分标本血管内壁中观察到了荧光细胞.结论:自体BMMNC心肌内移植可在心肌微环境的诱导下分化为心肌样细胞及血管内皮细胞.改进后的BMMNC分离纯化方法过程简便、可靠,处理过程无毒性,获得的细胞纯度和活性较高,该方法可应用于临床研究.
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心肌微环境对胎盘间充质干细胞向心肌细胞分化的影响
目的 观察心肌微环境对胎盘间充质干细胞(human placenta-derived mesenchymal stem cells,hPDMSCs)向心肌细胞分化的影响.方法 用心肌细胞培养上清液模拟心肌微环境诱导hPDMSCs向心肌细胞分化,同时设置20％DMEM培养的对照组.每天于显微镜下观察细胞形态学变化,每两天台盼蓝拒染法计数细胞,免疫组织化学法检测α-横纹肌肌动蛋白的表达,免疫荧光法检测心肌肌钙蛋白I(cardiac troponin I,cTnI)的表达,RT-PCR法检测心钠素(atrial natriuretic factor,ANF)、β-肌球蛋白重链(beta-myocin heavy chain,β-MHC)mRNA的表达.结果 对照组细胞保持较快的增殖速度,不表达α-横纹肌肌动蛋白、cTn I、ANF、β-MHC;心肌细胞培养上清液模拟的心肌微环境组细胞增殖速度较慢,表达α-横纹肌肌动蛋白、cTn I、ANF、β-MHC.结论 心肌微环境能够诱导hPDMSCs向心肌细胞分化.
