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乳腺干细胞的体外培养及免疫磁珠法分离
目的:乳腺干细胞可以从正常乳腺腺体、良性或恶性乳腺肿瘤的瘤旁组织以及乳汁分离的乳腺上皮细胞中获得.实验选取乳腺癌旁正常组织,体外培养并利用免疫磁珠法分离出具有干细胞特性的乳腺细胞,拟进一步验证在成人乳腺组织中含有可为组织工程所用的种子细胞.方法:实验于2007-03/10在吉林大学公共卫生学院放射生物学教研室完成.①细胞来源:标本取材于吉林大学第一医院乳腺外科同期收治的20例女性乳腺癌患者手术切除的癌旁组织(> 3 cm),经病理证实为正常乳腺腺体,患者对治疗及实验均知情同意.②实验方法:去除乳腺腺体周围脂肪组织及毛细血管,剪碎成约为0.3 cm3的组织块,离心,去上清,I型胶原酶消化,加入含10%胎牛血清的DMEM/F12基础培养基进行原代培养.2周后待细胞接近铺满整个培养瓶底部时,用胰蛋白酶 + D-HANKS液将贴壁细胞消化分离,按1∶2 或1∶3传代.利用免疫磁珠系统分离筛选乳腺成体干细胞.③实验评估:观察原代与传代培养的乳腺细胞生长特点,以及免疫磁珠分选后的乳腺干细胞形态、生长特性.采用免疫组化法对分选结果进行鉴定.结果:①体外培养的乳腺细胞生长特点:原代培养72 h后可见乳腺细胞贴壁,5 d后细胞呈纺锤形、多角形生长,10 d后细胞生长旺盛且排列紧密,随着培养时间的延长梭形细胞逐渐占据优势.传代后细胞增殖速度加快,细胞更加均匀有序的生长.②乳腺干细胞的形态特点及生长特性:分离出的人乳腺成体干细胞生长状态良好,呈类圆形,培养3 d后呈多角形分化生长.③分选结果免疫组化鉴定:免疫磁珠分选出的乳腺干细胞均表达上皮特异性抗原,而不表达唾液黏蛋白1.结论:成人乳腺组织中存在唾液黏蛋白1-上皮特异性抗原+且具有干细胞特性的乳腺细胞,利用免疫磁珠技术可成功地将其从人乳腺癌旁正常组织中分离出来.
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乳腺干细胞培养基的建立及有效性验证
背景：干细胞培养基，尤其是乳腺干细胞培养基现阶段尚无有效的制备方法。目的：利用Sca-1+乳腺细胞验证自制乳腺干细胞培养基的有效性。
方法：用BM培养基培养乳腺器官样小体，6 d后以免疫荧光方法监测成纤维细胞Sca-1和vimentin的表达。筛选出MaECM培养基，培养乳腺细胞6 d后，免疫磁珠筛选Sca-1+和Sca-1-细胞群，流式细胞术分析Sca-1阳性细胞的纯度，1×104 Sca-1+或Sca-1-细胞种植在4只鼠双侧乳腺脂肪垫上，6-8周后取出乳腺脂肪垫，以卡红整体染色和苏木精-伊红染色分析长出乳腺的结构数量。
结果与结论：乳腺器官样小体用BM培养基培养6 d后，检测到大量Sca-1和vimentin阳性的成纤维细胞，说明BM培养基不适合分离Sca-1+乳腺干细胞。筛选出的MaECM培养基能够抑制成纤维的生长。磁珠筛选后，流式细胞术检测Sca-1+细胞在Sca-1+和Sca-1-细胞群的纯度分别是92%和5%。移植实验显示在8个种植Sca-1+细胞的脂肪垫生长出6个乳腺结构；而在8个种植Sca-1-细胞的脂肪垫中除1只鼠死亡，其余脂肪垫中均未长出乳腺结构。提示MaECM培养基适用于培养鼠乳腺干细胞。 -
来源于乳腺癌正常组织乳腺干细胞的安全性
背景：乳腺干细胞的培养对研究乳腺的发育及乳腺癌具有重要的意义。
目的：找到一种易操作的体外分离培养乳腺干细胞的方法，并验证其安全性。
方法：分离培养乳腺癌旁正常组织中乳腺上皮细胞，流式细胞仪分选CD49f和EPCAM阳性细胞进行干细胞表面标记分析及细胞集落形成能力分析，然后在乳腺干细胞、乳腺癌组织和乳腺癌旁正常组织中提取mRNA，实时荧光定量PCR检测C-erbB-2和Maspin基因的表达。
结果与结论：①成功培养出人乳腺干细胞，并且细胞表面特异性标志物CD49f，EPCAM高表达；②集落形成能力分析可见混合集落、腔上皮细胞集落、肌上皮细胞集落；③乳腺干细胞C-erbB-2低表达，而Maspin高表达，证明来源于乳腺癌正常组织的乳腺干细胞具有生物安全性。 -
干细胞用于乳腺再生研究进展
干细胞是机体内具有自我更新和多向分化潜能的细胞群,并能通过分化产生特定组织的成熟细胞,理论上一个干细胞可以发育成为完整的生物个体或组织器官.乳腺干细胞的主要功能包括:能产生乳腺组织生长发育过程中的多种细胞,在妊娠、授乳、退化的周期中维持乳腺的生长和重建,在组织损伤时有修复功能.1 乳腺干细胞及乳腺形成的影响因素正常乳腺干细胞主要位于导管的上基部并被具有增殖作用的前祖细胞所包围.有研究小组从人类脐带血中检测到乳腺干细胞,其含量和脐带血中造血干细胞含量成正比,并推测可能是乳腺癌的危险因素.乳腺导管树状结构主要是由网状细胞组成内层,外层是由肌上皮细胞组成,基底膜将导管与其下的间质隔开.基底细胞直接和细胞外基质接触,比网状细胞表达更高水平的细胞外基质受体、整合蛋白.乳腺上皮细胞由两种主要的细胞组成:基底细胞和网状细胞,在泌乳期,基底细胞负责乳汁的排出而网状细胞则分泌乳汁,干细胞对这两个细胞层功能的维持有重要作用[1].乳腺干细胞对乳腺的形成、再生至关重要,近也有研究表明很多其他因素亦能影响乳腺的形成及再生.
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绿色荧光蛋白转基因小鼠乳腺的移植
目的 研究乳腺的发育和乳腺癌的发生机制,探讨乳腺移植技术和新的乳腺移植动物模型.方法 应用绿色荧光蛋白(GFP)转基因小鼠的乳腺组织,移植到去除乳腺上皮的野生型小鼠的乳腺脂肪垫中,经10至12周后,摘取受体小鼠的乳腺脂肪垫,制备乳腺的组织样本,进行荧光显微镜和组织学检查.结果 发现GFP小鼠的乳腺在受体小鼠的乳腺脂肪垫中生长,并分化成管、泡状的乳腺结构.结论 GFP小鼠的乳腺能长期生长在野生小鼠的脂肪垫中并产生乳腺组织,为今后研究乳腺的分化、乳腺干细胞的培养及乳腺癌的发生机制提供了新的动物模型.
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成人乳腺干细胞的培养筛选及生物学特点鉴定
目的 用不同的鉴定方法对应用免疫磁珠技术分离的乳腺干细胞(separated human mammary stem cell,SHMEC)进行生物学特点的鉴定.方法 对原代培养的乳腺细胞用免疫磁珠方法(Magnetic Cell Sorting,MACS)进行分离.对分离后的乳腺干细胞(SHMEC)进行免疫组化,光镜,GIEMSA染色,染色体染色,电镜超微结构扫描等方法进行生物学特点的鉴定,并观察其转化为其他乳腺细胞的能力.结果 光镜下可见对正常的静止期的乳腺细胞经免疫磁株分离后得到的乳腺导管上皮细胞呈椭圆型,聚集成团.GIEMSA染色可见红色椭圆型细胞及细胞核.扫描电镜下可见细胞的超微结构特点.染色体核型分析染色显示SHMEC细胞为二倍体细胞,染色体数目与正常外周血淋巴细胞相同.染色体恒定,无缺失及短臂丢失.结论 从正常组织中经原代培养后分离出的乳腺上皮细胞具有乳腺干细胞的特性并不具有恶性转变的生物学特点.
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乳腺干细胞和乳腺癌
乳腺干细胞是一种未分化的细胞,具有永远增殖和自我更新能力.乳腺癌中的癌症干细胞可能起源于正常干细胞,以细胞表面标志CD44+/CD24-/low识别.癌症干细胞可能为肿瘤转移和复发的原因.识别乳腺癌干细胞和普通癌症细胞之间的差异,可以发展更有效的诊断和治疗方法.
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乳腺干细胞研究及其再生医学
关于乳腺干细胞及乳腺癌干细胞的研究,本实验室前期做了较多探索性工作,包括乳腺癌干细胞的分选、特异性乳腺癌干细胞标志物的筛选、癌基因和肿瘤抑制基因、生长因子、细胞周期、增殖和凋亡、信号转导通路、实验和临床病理等方面的研究.
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乳腺干细胞与乳腺癌干细胞研究及其临床意义
干细胞与癌干细胞分别是正常组织与癌组织中具自我更新能力与级别(hierarchy)分化潜能的细胞.近年来这方面所作研究的成果预示对于细胞与癌干细胞特性及其调控机制的探明将使癌症临床诊断治疗发生革命性的变化.本文就乳腺干细胞与乳腺癌干细胞研究及其临床意义作一简要介绍.
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BRCA1与乳腺癌研究的进展
BRCA1是第一个被鉴别出来的人类乳腺癌易感基因,是乳腺癌及卵巢癌特异性抑癌基因.笔者结合文献就其结构和功能、BRCA1与miRNA的联系、BRCA1与乳腺干细胞及乳腺癌干细胞的关系作一综述.
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成年大鼠不同发育时期乳腺上皮小亮细胞CD24的免疫组化研究
目的 观察成年大鼠乳腺不同发育时期CD24阳性表达的乳腺上皮小亮细胞部位、数量的变化.方法 制备成年大鼠乳腺不同发育时期(选取静止期、孕期、哺乳期、退化期)组织标本,采用免疫组织化学和光镜技术检测CD24的表达.结果 CD24在导管小亮细胞中的染色程度普遍高于腺泡;相比于静止期和退化期,CD24更多地表达于孕期和哺乳期的小亮细胞;静止期和退化期表达无显著性差异(P>O.05);孕期和哺乳期表达也无显著性差异(P>0.05).结论 CD24蛋白参与了正常成年大鼠乳腺组织的发育过程,且可能是鉴定乳腺干细胞(MaSCs)及观察MaSCs发育与分化过程的重要分子.
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Sca-1,CD24和Muc1在雌性大鼠静止期乳腺中的表达
目的 研究干细胞抗原(Sca-1),CD24和Muc1在静止期乳腺中的表达.方法 用Western免疫印迹法检测Sca-1和CD24在6周龄和9周龄大鼠乳腺中的含量变化,制备6周龄、9周龄SD雌性大鼠乳腺标本,切片(4 μm),运用免疫组化酶标和免疫组化荧光法对乳腺中Sca-1,CD24,Muc1进行标记.结果 Sca-1,CD24在6周龄的大鼠乳腺中的含量略低于9周龄大鼠;Sca-1在乳腺叶间导管、分支导管及腺泡周围表达;CD24在分支导管、乳脂垫及腺泡周围中表达;Muc1在分支导管和叶间导管中表达.结论 Sca-1阳性细胞可能代表一类乳腺祖细胞,CD24阳性细胞代表一类乳腺干细胞,而Muc1阳性细胞代表成熟腺上皮细胞.本实验为上述细胞的鉴定提供了一些形态学证据,但需要细胞移植实验进一步实证.
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乳腺干细胞研究进展
乳腺发育是一个复杂的过程.在小鼠早期乳腺发育中,简单的乳腺导管树已经形成[1].出生后直至青春期,乳腺生长一直保持静止[2].在青春期,从导管树的顶端长出终末芽胚(ter-minal end buds,TEBs).
