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软骨干细胞修复软骨损伤及治疗骨关节炎的研究进展
软骨损伤通常导致整个关节的病变,从而诱发骨性关节炎.目前已证实关节软骨中存在一类具有自我增殖性、表面抗原表达特性及多向分化潜能的软骨干细胞,该类细胞可以自发聚集到损伤部位进行修复,有利于快速构建软骨修复的微环境.但软骨干细胞的起源和功能尚需进一步明确.本文就软骨干细胞在软骨损伤修复中的作用及对骨性关节炎的治疗等研究进展进行综述.
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大鼠腰椎终板软骨干细胞的分离及分化
背景:细胞克隆筛选系统ClonePix能快速有效的挑选出经低熔点琼脂糖悬浮培养获得的细胞克隆团,能够解决生物治疗所需种子细胞数量不足的问题.目的:分离和鉴定大鼠腰椎终板软骨干细胞.方法:取4周龄SD大鼠10只,解剖显微镜下获得其腰椎终板软骨,采用胰酶与Ⅱ型胶原酶消化获得原代软骨细胞,将原代软骨细胞在低熔点琼脂糖培养基中悬浮培养,细胞克隆筛选系统ClonePix挑取细胞克隆团进行体外扩增,扩增后观察其细胞形态,然后进行成骨、成脂肪及成软骨方向诱导,并检测单克隆形成能力.结果与结论:①利用低熔点琼脂糖悬浮培养法能够获得大鼠腰椎终板软骨细胞克隆团,细胞克隆团经体外扩增培养后形态呈梭形;②诱导后经茜素红、油红O及番红染色证明具有成骨、成脂肪及成软骨分化能力;③将细胞克隆团的单个细胞接种于10 cm培养皿,经过12 d的体外扩增培养,肉眼可观察到细胞集落.随着细胞接种密度的增大,细胞集落形成数目减少,以100个细胞密度接种时,集落形成能力强,可以形成数目大于20个的细胞集落;④结果表明,经低熔点琼脂糖悬浮培养法获得的细胞克隆团具有多向分化能力和高增殖能力.
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动态压力负荷对大鼠生长板软骨干细胞外基质及PTHrP mRNA的影响
目的 探讨动态压力刺激对大鼠生长板软骨干细胞外基质及甲状旁腺激素相关蛋白(PTHrP)mRNA表达水平的影响.方法 采用免疫磁珠法分离培养大鼠生长板软骨干细胞,将细胞分为0、30、60、90 mmHg组,采用动态压力细胞培养装置向各组分别施加0、0~30、0~60、0~90 mmHg的动态压力刺激.作用1、6、24 h后,采用半定量RT-PCR方法检测软骨干细胞外基质[包括Ⅱ型胶原、葡聚多糖(aggrecan)、Ⅹ型胶原]及PTHrP mRNA表达.结果 30、60、90 mmHg组Ⅱ型胶原均有明显表达且在6 h时达到高,30、60、90 mmHg组各时间点的表达量均大于0 mmHg组(P均<0.05);30、60、90 mmHg组aggrecan mRNA均有明显表达且在6 h时达到高,在每个时间点30、60、90 mmHg组的表达量均大于0 mmHg组(P<0.05);0、30、60、90 mmHg组Ⅹ型胶原mRNA均有较低表达,且各组之间比较差异无统计学意义(P均>0.05);30、60、90 mmHg组PTHrP mRNA均有较高表达,在每个时间点30、60、90 mmHg组的表达量均大于0 mmHg组(P均<0.05),PTHrP mRNA表达量随着受力时间的延长而增加.结论 动态压力负荷可上调大鼠生长板软骨干细胞PTHrP mRNA表达,促进其细胞外基质的形成及增殖.
关键词： 动态压力 生长板 软骨干细胞 细胞外基质 甲状旁腺激素相关蛋白 -
脂联素对软骨干细胞成软骨分化作用的影响
目的 从晚期骨关节炎患者关节软骨中分离出软骨干细胞,观察脂联素对软骨干细胞成软骨分化作用的影响.方法 收集5例晚期骨关节炎患者行全膝关节置换术后剩余的软骨组织,培养分选出软骨干细胞,观察比较单纯成软骨诱导培养基组和加入了脂联素的成软骨诱导组成软骨诱导后组织Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原、蛋白聚糖(Agg)及性别决定区Y框蛋白-9(SOX-9)的免疫组织化学及相关基因的表达.结果 晚期骨关节炎患者关节软骨中分选出的软骨干细胞在适当条件下能向软骨细胞进行分化;当在成软骨诱导培养基中加入脂联素后,与未加脂联素的诱导组比较,细胞内Ⅱ型胶原和Agg的蛋白和基因表达减弱(Ⅱ型胶原:1.004±0.125比0.588±0.101,P=0.001;Agg:1.002 ±0.050比0.584±0.138,P=0.000),SOX-9下调不明显(0.998±0.080比0.946±0.149,P=0.513),但Ⅰ型胶原表达明显增强(2.290±0.349比1.010±0.059,P=0.000).结论 脂联素对软骨干细胞的成软骨能力有一定抑制作用.
关键词： 脂联素 软骨干细胞 成软骨分化 性别决定区Y框蛋白-9 -
三种亚型软骨组织来源干细胞的分离培养及鉴定
目的 分离培养猪不同亚型软骨组织(弹性软骨、透明软骨以及纤维软骨)来源干细胞并鉴定,为软骨组织工程提供理想种子细胞.方法 利用纤维连接蛋白黏附法分别从猪耳软骨、关节软骨以及椎间盘软骨中分离培养干细胞,并进行传代.倒置相差显微镜下观察细胞形态变化,流式细胞术鉴定细胞表面抗原表达水平(阳性标志物CD29、CD90及阴性标志物CD34、CD45),单克隆形成实验鉴定软骨干细胞单克隆形成能力.三向诱导分化鉴定软骨来源干细胞的成软骨、成骨及成脂多向分化潜能.RT-PCR检测成骨(Ⅰ型胶原、Ⅹ型胶原)、成软骨[蛋白聚糖(Aggrecan)、Ⅱ型胶原]、成脂[脂联素(Adiponectin)、脂肪酸合成酶(fatty acid synthase,FAS)]相关基因表达,并以猪BMSCs作为对照.结果 通过纤维连接蛋白黏附法分别从耳软骨(弹性软骨)、关节软骨(透明软骨)、椎间盘软骨(纤维软骨)分选出一群细胞,细胞高表达干细胞表面阳性标志物CD29、CD90,几乎不表达干细胞表面阴性标志物CD34、CD45.经过体外2周培养,单个细胞均能形成细胞克隆.三向诱导分化显示软骨来源的干细胞具备成软骨、成骨和成脂分化能力.RT-PCR结果显示,成骨诱导后关节和椎间盘来源软骨干细胞的Ⅰ、Ⅹ型胶原基因相对表达量明显高于BMSCs(P＜0.05),耳软骨来源干细胞与BMSCs比较差异无统计学意义(P＞0.05);成软骨诱导后,3种亚型软骨组织来源干细胞Aggrecan、Ⅱ型胶原基因相对表达量均高于BMSCs (P＜0.05);成脂诱导后,3种来源软骨干细胞Adiponectin及FAS基因相对表达量均低于BMSCs,但比较差异无统计学意义(P＞0.05).结论 不同亚型的猪软骨组织中均存在软骨干细胞,具有干细胞的典型特征.
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早期兔骨关节炎软骨CD105+/CD166+细胞及其软骨分化潜能的实验研究
目的 探讨早期骨关节炎(osteoarthritis,OA)软骨组织中CD 105+/CD 166+细胞的变化规律及其软骨分化潜能,为软骨自身修复机制的研究奠定实验基础. 方法 8～12月龄成年新西兰大白兔30只,建立右膝OA模型.将实验分为5组,分别获取左膝关节正常软骨细胞(A组),造模后2、4、8周右膝OA软骨细胞(分别为B、C、D组)以及兔BMSCs(E组).将各组培养细胞标记CD105和CD166,流式细胞仪分析CD 105+/CD 166+细胞百分比并采用免疫磁珠分选法将CD 105+/CD 166+细胞分选出来.激光共聚焦显微镜观察CD105和CD166在各组细胞中的表达分布情况;成软骨诱导培养后分别行阿尔新蓝细胞化学染色和Ⅱ型胶原免疫组织化学染色;成骨诱导培养后检测各组钙含量;成脂诱导培养后行油红O染色. 结果 A、B、C、D组CD 105+/CD 166+细胞百分比显著低于E组(P＜ 0.05);B、C、D组高于A组(P＜ 0.05),D组显著高于B、C组(P＜0.05),但B、C组间差异无统计学意义(P＞0.05).共聚焦显微镜观察示,A、B、C、D组软骨细胞及E组BMSCs中均可见CD105+、CD 166+细胞,各组间无明显差异.各组细胞微球成软骨培养1周后,CD 105+/CD 166+细胞均可见蛋白多糖和Ⅱ型胶原阳性表达,各组间无明显差异.成骨诱导培养2周时,E组钙含量显著高于A、B、C、D组(P＜ 0.05),A、B、C、D组间比较差异无统计学意义(P＞0.05).成脂诱导培养4周,E组可见较多红色脂滴;A、B、C、D组红色脂滴数量较E组少,成片状,大小不一,A、B、C、D组间无差别. 结论 早期兔OA软骨组织中CD 105+/CD 166+细胞增多,这些细胞有软骨细胞分化潜能.
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动态压应力对大鼠干骺端软骨干细胞PTHrP mRNA表达的影响
目的 研究动态压应力对大鼠干骺端软骨干细胞甲状旁腺激素相关蛋白(PTHrP)mRNA 表达的影响,进一步探索纤维形肌动蛋白(F-actin)是否参与该力学信号转导过程.方法 免疫磁珠法分离培养大鼠干骺端软骨干细胞.第 3 代大鼠干骺端软骨干细胞按照动态压应力强度的大小随机分为4 组:0%、3%、6%、12%形变组,使用自行制备的动态压应力培养装置对各组细胞施加不同强度的压应力刺激24 h,流式细胞术检测各组细胞周期分布及凋亡率,实时定量PCR检测各组细胞PTHrP mRNA表达水平.进一步,第 3 代大鼠干骺端软骨干细胞按照是否施加压应力及细胞骨架松弛素D随机分为4 组:对照组、单纯压应力组(6 %形变)、压应力+细胞骨架松弛素D组、单纯细胞骨架松弛素D组,各组细胞施加干预 24 h后以鬼笔环肽染 F-actin纤维,置于激光共聚焦显微镜下观察,以及实时定量 PCR检测各组细胞PTHrP mRNA表达水平.结果 流式细胞术结果显示:0%、3%、6%、12%形变组细胞 G0/G1、G2/M及S期比例差异无统计学意义(P＞0.05);3%、6%形变组凋亡率与0%形变组相比,差异无统计学意义(P＞0.05),12%形变组凋亡率明显高于对照组(P＜0.05).激光共聚焦显微镜观察结果表明:单纯压应力组 F-actin纤维排列较对照组整齐,相互平行,与受力方向趋于一致;压应力+细胞骨架松弛素 D组及单纯细胞骨架松弛素 D组细胞内 F-actin纤维结构破坏,相互聚集缠绕成团块状.实时定量PCR结果显示:3%形变组细胞 PTHrP mRNA 表达水平与 0%形变组差异无统计学意义(P＞0.05),6%及 12%形变组细胞PTHrP mRNA表达量明显高于 0%形变组(P＜0.05);单纯压应力组细胞PTHrP mRNA表达量明显高于对照组(P＜0.05),单纯细胞骨架松弛素D组细胞PTHrP mRNA表达量与对照组相比差异无统计学意义(P＞0.05),压应力+细胞骨架松弛素D组细胞PTHrP mRNA表达量高于对照组,但低于单纯压应力组(P＜0.05).结论 适当强度的动态压应力可以上调大鼠干骺端软骨干细胞 PTHrP mRNA表达,在该力学信号转导过程中有 F-actin的参与.
