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建立一种新型凝血因子Ⅴ基因突变小鼠模型：突变小鼠无显著骨组织变化
背景：研究显示，凝血因子Ⅴ基因突变在自发性非创伤性股骨头坏死的发生率比健康对照组和继发性非创伤性股骨头坏死高，血栓形成的发生率与此吻合。凝血因子Ⅴ的失活能够加速和促进凝血酶原的激活及凝血酶的生成。其重链上的3个位点arg-306，arg-506，arg-679的突变导致血栓倾向和高凝状态。文章将调查第506位和679位的同时突变R506Q/R679Q对骨坏死产生的功能和影响。目的：建立凝血因子Ⅴ第506位和679位的谷氨酰胺至精氨酸(Factor VR506Q/R679Q)点突变小鼠模型。方法：应用分子克隆技术构建Factor VR506Q/R679Q点突变打靶载体，将其线性化后电转到胚胎干细胞中，然后筛选G418抗性的胚胎干细胞克隆进行胚泡显微注射，将注射好的胚泡移植至同期发情的假孕受体母鼠输卵管内，获得携带双侧LoxP基因的Chimera小鼠。将突变鼠与CMV-cre转基因鼠杂交后，得到只含Factor VR506Q/R679Q的点突变鼠。PCR法进行基因型鉴定后，将突变小鼠和野生小鼠的骨苏木精-伊红染色和空骨陷窝率等进行比较，对其骨组织情况及骨量进行分析。结果与结论：①与野生鼠相比，Factor VR506Q/R679Q点突变鼠胚胎及生后的生长发育无明显异常，骨量及空骨陷窝率并无显著变化；②结果提示，成功建立了凝血因子 Factor VR506Q/R679Q点突变小鼠，但突变小鼠并无显著骨组织变化。之后的研究应关注在外加因素刺激下突变小鼠的骨坏死诱发率。
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低氧对脂肪干细胞和关节软骨细胞三维共培养成软骨能力的影响
背景：多项体内外研究表明低氧和共培养均促进干细胞向软骨细胞方向分化。
目的：观察低氧对脂肪干细胞和关节软骨细胞三维共培养成软骨能力的影响。
方法：脂肪干细胞和关节软骨细胞二者按3∶1比例混合，以5×1010 L-1接种于聚乳酸-羟基乙酸共聚物/明胶支架上，分别在常氧(体积分数为20% O2)、低氧(体积分数为5% O2
结果与结论：低氧组苏木精-伊红染色显示大量细胞及细胞外基质生成，阿尔新蓝染色显示有大量糖胺多糖生成，免疫组化显示Ⅱ型胶原表达强阳性，且DNA、糖胺聚糖、羟脯氨酸等各项指标均高于常氧组。表明低氧促进脂肪干细胞和关节软骨细胞共培养成软骨分化。
行组织学分析，阿尔新蓝染色鉴定糖胺多糖的合成，免疫组化鉴定Ⅱ型胶原的表达，并测定各组支架-细胞复合物的DNA、糖胺聚糖、羟脯氨酸含量。 -
超顺磁性氧化铁标记对诱导多功能干细胞体外分化的影响
背景:超顺磁性氧化铁标记技术是一种经典的干细胞活体无创示踪手段,目前已广泛应用于干细胞移植相关的基础与临床研究中.诱导多功能干细胞是目前有潜力用于细胞移植治疗的种子细胞之一,超顺磁性氧化铁标记技术是否也能够用于诱导多功能干细胞的无创示踪,关键看该材料标记后是否严重影响细胞的分化,目前这方面的研究鲜有报道.目的:探究超顺磁性氧化铁标记对诱导多功能干细胞体外分化的影响.方法:分离、培养大鼠皮肤成纤维细胞,用高效重组载体和病毒包装含有目的基因(Oct4,Sox2,Klf4和c-Myc)的质粒共转染293T细胞,进行病毒包装和生产.使用包装有目的基因的慢病毒载体感染大鼠皮肤成纤维细胞,得到诱导多功能干细胞.实验分2组:实验组诱导多功能干细胞采用超顺磁性氧化铁体外标记后行神经诱导分化,对照组诱导多功能干细胞(未用超顺磁性氧化铁体外标记)直接行神经诱导分化.对磁标记诱导多功能干细胞进行普鲁士蓝染色和透射电镜观察.免疫组化检测诱导分化后神经元特异性烯醇化酶的表达,流式细胞仪检测分化为神经元样细胞及胶质样细胞的比例.结果与结论:①超顺磁性氧化铁粒子标记后普鲁士染色和透射电镜观察可见细胞胞浆内含致密铁颗粒;②诱导多功能干细胞进行神经诱导分化后神经元特异性烯醇化酶呈阳性表达;③实验组诱导多功能干细胞分化为神经元样细胞及胶质样细胞的比例与对照组相比差异无显著性意义(P > 0.05);④结果表明,超顺磁性氧化铁粒子标记对诱导多功能干细胞向神经元样细胞分化无明显影响,合理应用这种新型细胞标记术将促进对再生医学种子细胞的研究.
