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体外原代培养纯化新生鼠嗅鞘细胞的实验方法:差速贴壁+阿糖胞苷+胰酶法
目的:通过细胞形态学观察及生物学特性鉴定,建立一种经济实用的体外原代培养纯化新生鼠嗅鞘细胞的实验方法.方法:实验于2006-06在武汉理工大学完成.①阿糖胞苷(Sigma,批号w10562);胎牛血清(杭州四季青产品);胰蛋白酶(Amresco);多聚赖氨酸(Sigma);胶质纤维酸性蛋白,神经生长因子受体蛋白抗体(博士德).②选取出生3 d内的Wistar大鼠5只,乙醇浸泡后断头处死,取嗅球的外两层,通过1.25 g/L胰蛋白酶消化分离嗅鞘细胞,体外原代培养.③采用Nash差速贴壁+阿糖胞苷+胰酶法纯化嗅鞘细胞.培养18 h后将未贴壁的细胞悬液转种于另一未涂层的器皿中,再培养36 h,重复上述步骤移人0.1 g/L多聚赖氨酸包被的塑料培养瓶中进行培养,纯化后的细胞在24 h内陆续贴壁,常规培养2 d,加入终浓度为2 mg/L的阿糖胞苷,作用48 h后,换上新的培养基,继续培养1 d,弃去培养基,用无钙镁的Hanks液清洗2次,然后用1.25 g/L的胰酶消化10 min,待细胞突起回缩、胞体变圆时,立刻加入纯血清终止,其血清终浓度为20%,制备单细胞悬液.④倒置显微镜下观察其形态变化,苏木精-伊红染色,同时行神经生长因子受体蛋白和胶质纤维酸性蛋白免疫组化染色鉴定嗅鞘细胞,并计算嗅鞘细胞阳性百分率.结果:①活细胞形态观察:分离培养的嗅鞘细胞具有双极或多极突起,且突起细长,相互交织.②嗅鞘细胞的苏木精-伊红染色鉴定:细胞呈三角形或梭形,有长的突起,胞浆被染成粉红色,胞核呈蓝紫色,胞核内深染的为核仁,有1～3个核仁.③嗅鞘细胞的胶质纤维酸性蛋白免疫组化染色鉴定:细胞呈现棕黄色,胞核淡染,阳性细胞成网状连接,胞体多为三角形,有细长突起,阳性率91.5%.④嗅鞘细胞的P75免疫组化染色鉴定:阳性细胞呈绿色,多数细胞染色阳性,阳性率89%.结论:实验所采用的Nash差速贴壁+阿糖胞苷+胰酶法分离纯化培养嗅鞘细胞切实可行,为神经诱导修复材料的研究提供种子细胞.
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嗅鞘细胞移植治疗肌萎缩侧索硬化症中期安全性评价
目的:在证明嗅鞘细胞移植治疗肌萎缩侧索硬化症的近期安全性的基础上,进一步评价其中期安全性.,方法:本项研究为嗅鞘细胞移植治疗肌萎缩侧索硬化症系列研究的一部分.①随机选择2004-12/2005-05北京西山医院神经疾病研究治疗中心采用嗅鞘细胞移植治疗肌萎缩侧索硬化症患者13例,均经过世界神经病联合会El Escorial诊断标准确诊,病情呈进行性恶化趋势.②所有患者均接受胚胎嗅鞘细胞移植治疗,即取胚胎嗅球,消化成单个嗅鞘细胞后,培养两三周,然后在患者双侧大脑放射冠处各注射50μL嗅鞘细胞悬液,细胞数共约2×106个.③术后采用MRI颅脑扫描进行影像学检查,定期随访,仔细比较注射部位及其周围脑结构的形态学变化,分析嗅鞘细胞移植物的生物安全性.结果:按意向处理分析,嗅鞘细胞移植治疗肌萎缩侧索硬化症患者13例,随访5.1～11.8个月,平均7.5个月,全部进入结果分析.随访期间,无发热、头痛、头晕、恶心及呕吐等神经系统并发症.术前术后MRI扫描对比,颅内移植部位及其周围未发现新生肿瘤、出血、水肿、囊肿形成、神经结构破坏以及感染(脓肿)等病理性改变.结论:本研究首次证明在7个月随访期内,采用嗅鞘细胞移植手术治疗肌萎缩侧索硬化症是安全的.
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FK506对嗅鞘细胞移植治疗肌萎缩侧索硬化症患者神经功能改善的影响
目的:观察大环内酯类免疫抑制剂FK506对嗅鞘细胞移植后肌萎缩侧索硬化症患者神经功能的干预情况.方法:①取4个月中期流产胚胎(孕妇及其家属知情同意)的嗅球,消化成单个嗅鞘细胞后,培养2周,然后将其移植到患者双额放射冠部位.②报告1例患者:白人男性,49岁,德国籍,进行性四肢无力伴肌萎缩2年.按世界神经病联合会El Escorial诊断标准确诊.先后共接受嗅鞘细胞脑内移植2次.第1次为单纯细胞移植,5个月后接受第2次移植术,术后当天下午即开始口服FK506胶囊3mg,2次/d,共42 d.术前和术后随访疗效评定采用国际统一的肌萎缩侧索硬化症功能评分标准(满分40分代表正常,随病情加重分数减少,低为0分),同时对两次移植治疗效果进行比较.结果:第1次术后,患者的神经功能部分改善,肌萎缩侧索硬化症功能评分由术前26分增至32分(医生评定).第3个月病情又开始加重,至第5个月降至15分(患者及其家属经医师正规培训后独立进行量表评定).第2次移植后,肌萎缩侧索硬化症功能评分由术前16分增至19分(医生评定).随访5个月病情基本稳定,评分为14分(患者及其家属评定).结论:免疫抑制剂和神经营养和保护剂FK506可提高肌萎缩侧索硬化症患者嗅鞘细胞移植的治疗效果,延长神经功能改善时间.
关键词： 免疫抑制剂/治疗应用 嗅球/细胞学 肌萎缩侧索硬化 -
大鼠嗅鞘细胞原代培养克隆样生长的人为干预效应
目的:通过对大鼠嗅鞘细胞早期原代培养的克隆样生长进行人为干预,观察其对细胞的增殖、贴壁及再分布的作用.方法:实验于2005-08/2006-01在云南省肿瘤研究所完成.①将取自成年SD大鼠嗅球的嗅鞘细胞用差速贴壁法进行纯化.②将纯化后的细胞随机分为干预组和对照组,干预组于干预前1 d换液,次日倒掉上清液,加入1.25 g/L胰酶,加入量以刚浸没瓶底为宜.置于37℃培养箱消化3 min,待镜下示胞体回缩变圆时加入DMEM培养基终止消化,并予以尖吸管反复吹打至镜下见大量细胞悬浮无明显克隆样细胞团为止.随后再加入适量培养基置于培养箱中继续培养.对照组不行任何措施.③采用倒置显微镜下观察两组生长的形态学特点,比较干预组干预前后嗅鞘细胞的生长情况及贴壁分布变化.结果:①干预前两组细胞的形态学观察:用差速贴壁法纯化细胞后,发现细胞早期呈克隆样生长,分布不均匀.②干预后两组细胞的形态学观察:干预组细胞经消化吹打干预后均匀贴壁生长,无明显克隆样生长中心,细胞多呈双极或多极样形态,细胞立体感及折光性好,视野清晰,细胞增殖迅速,数天后即可长满瓶底;对照组细胞分布不均,培养至3周仍无法长满瓶底,仍呈克隆样生长状态,周边区域的细胞数量少,增殖缓慢.结论:嗅鞘细胞原代培养的早期需采取人为干预使细胞均匀分布贴壁生长,从而加快细胞的生长速度,缩短实验耗时.
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肌萎缩侧索硬化症患者嗅鞘细胞移植后的短期随访及磁共振波谱评价
目的:采用运动皮质及相关脑区的质子磁共振波谱检查,分析上运动神经元明显受累的肌萎缩侧索硬化症患者嗅鞘细胞移植后质子谱变化.方法:于2004-12/2005-02在北京市石景山区西山神经再生和功能重建研究所治疗的7例肌萎缩侧索硬化症患者,均符合El Escorial诊断标准.在嗅鞘细胞移植术前及术后2周检查其神经功能状态、肌萎缩侧索硬化症功能评分(分值越高神经功能越好)、肌电图和质子磁共振波谱.分别于大脑脚、内囊膝部、内囊后肢、放射冠和中央前回测量N-乙酰天冬氨酸/肌酐和胆碱复合物/肌酐比值.结果:7例肌萎缩侧索硬化症患者均进入结果分析.①嗅鞘细胞移植后2周2例患者功能评分较术前明显改善(术前29,30,术后34,30),肌电图波幅较术前明显升高.其余5例上述2项指标保持稳定.②7例患者N-乙酰天冬氨酸/肌酐和胆碱复合物/肌酐比值整体水平降低(波幅比值:1.624±0.347,1.531±0.193;1.030±0.269,0.919±0.115;曲线下面积:1.697±0.354,1.021±0.182;1.625±0.230,0.912±0.118),但2例改善的患者在其相应的解剖区域N-乙酰天冬氨酸/肌酐升高.结论:肌萎缩侧索硬化症患者N-乙酰天冬氨酸/肌酐和胆碱复合物/肌酐比值整体水平降低,可能是由于疾病的进展或穿刺操作的干扰有关.其中2例患者显示N-乙酰天冬氨酸/肌酐比值增高,而且与神经学检查发现相印证,并为肌电图检查所支持.
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大鼠自体嗅黏膜移植修复胸髓损伤:形态学和行为学的验证
目的:采用自体嗅黏膜作为组织供体修复脊髓损伤,从形态学和行为学角度验证嗅成鞘细胞移植治疗脊髓损伤的作用及效果,为应用自体嗅成鞘细胞移植治疗临床脊髓损伤提供实验依据.方法:实验于2002-06/2004-10在北京大学基础医学院解剖学与组织胚胎学系中枢神经发育与再生研究室完成.选取清洁级6周龄雄性SD大鼠18只,随机分为自体嗅黏膜移植组10只,冻融对照组8只.两组均建立脊髓损伤模型,自体嗅黏膜移植组取位于鼻中隔后上部的嗅黏膜移植于脊髓损伤处,冻融对照组将自体嗅黏膜冷冻于-20℃冰箱5 min,取出后室温放置5 min解冻,重复5次后将冻融自体嗅黏膜移植于脊髓损伤处.术后6周于脊髓损伤节段上下各5 mm处取材,片厚20μm.然后两组分别以神经丝蛋白和神经生长因子受体蛋白免疫荧光双标染色、激光共聚焦显微镜检测移植效果.免疫组织化学染色观察移植嗅黏膜与周围组织的生长情况.通过BBB行为学评分对两组动物后肢恢复功能进行评估.结果:实验选取SD大鼠18只,全部进入结果分析.①免疫组织化学摄片观察移植细胞在脊髓组织中再生情况:自体嗅黏膜移植组有部分空洞形成,但有部分神经纤维穿过移植区,可见神经生长因子受体蛋白免疫反应阳性的嗅成鞘细胞呈束状排列.冻融对照组无再生纤维通过且形成较大空洞,神经生长因子受体蛋白p75免疫组化反应阴性.②两组大鼠的神经丝蛋白和神经生长因子受体蛋白免疫荧光双标染色结果:自体嗅黏膜移植组免疫荧光标记纤维中夹有神经生长因子受体蛋白p75标记的存活的嗅成鞘细胞,细胞随标记的神经丝蛋白纤维走行方向排列,与宿主组织愈合良好.冻融对照组未见神经生长因子受体蛋白p75标记的嗅成鞘细胞以及神经丝蛋白标记的再生纤维,且形成较大空洞.③两组大鼠手术前后行为学评分结果:与冻融对照组比较,术后2,3,4,5,6周自体嗅黏膜移植组BBB行为学评分显著升高[(3.8±0.7),(5.6±1.4);(4.1±0.6),(9.7±1.3);(4.6±1.7),(12.5±1.2);(5.8±0.9),(13.5±0.9);(6.3±0.9),(13.8±0.9)分;P＜0.05或0.01].结论:嗅黏膜移植以及其中的嗅成鞘细胞对大鼠脊髓损伤修复具有明显的促进作用,并可恢复损伤神经的部分功能.同时自体嗅黏膜移植还有助于脊髓损伤部位神经纤维的再生.
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嗅鞘细胞移植对脊髓损伤大鼠诱发电位的影响
目的:观察嗅鞘细胞移植对脊髓损伤大鼠感觉及运动诱发电位的影响,尝试用嗅鞘细胞移植修复脊髓损伤后受损的传导通路.方法:实验于2004-09/2006-07在西安交通大学口腔医学实验中心完成.①选取成年健康SD大鼠40只,取16只大鼠用于嗅鞘细胞的培养与纯化,剩余24只随机数字表法分为4组:假手术组、模型对照组、嗅鞘细胞移植组、DF12培养液组,6只/组.②模型对照组、嗅鞘细胞移植组、DF12培养液组采用脊髓横切法制作脊髓损伤模型,以T10为中心的后正中切口入路,切除T10全椎板及T9,T11的部分椎板,显露脊髓,以特制探针横预置3-0丝线于待损伤脊髓腹侧硬膜外,以剃须刀片于预置线头侧0.5 mm(T10水平)将脊髓横断.假手术组仅切开T10全椎板及T9,T11的部分椎板,对脊髓未作横断处理.③造模后,嗅鞘细胞移植组以距脊髓断端1 mm的平面与正中线交点为进针点,每一进针点按1.75 mm,1.25 mm,1.00 mm,0.50 mm 4个不同深度分别注射嗅鞘细胞培养液0.5 μL,注射速度0.1 μL/min,每注射位点留针5 min.DF12培养液组同法注射0.5 μL无血清的D/F12培养液.假手术组、模型对照组未作处理.④术后8周,各组大鼠麻醉后使用Dantec Keypoint型四导诱发电位肌电图仪测定感觉及运动诱发电位的潜伏期及波幅变化.结果:24只大鼠全部进入结果分析.①嗅鞘细胞移植术后大体观察:术后6周,嗅鞘细胞移植组双后肢拖步爬行、双侧膝踝关节处溃疡和压疮等失神经支配征象逐渐好转,股四头肌肌力明显恢复,拖步爬行现象改善;而模型对照组、DF12培养液组大鼠失神经支配征象无改善,假手术组未见异常.②术后8周感觉诱发电位检测结果:模型对照组、DF12培养液组均未引出感觉诱发电位波形.与假手术组比较,嗅鞘细胞移植组感觉诱发电位潜伏期明显延长[(2.640±0.294),(14.575±2.117)ms,P＜0.01],波幅显著降低[(3.797±0.140),(0.403±0.078)μV,P＜0.01].③模型对照组、DF12培养液组均未引出运动诱发电位波形.与假手术组比较,嗅鞘细胞移植组运动诱发电位潜伏期明显延长[(5.825±0.350),(10.750±1.184)ms,P＜0.01],波幅显著降低[(5.200±0.432),(0.10±0.001)μV,P＜0.01]. 结论:嗅鞘细胞移植治疗可以调节损伤脊髓的内在微环境,加强体感诱发电位和运动诱发电位的恢复表达,改善神经功能.
