世界华人消化杂志
World Chinese Journal of Digestology 세계화인소화잡지
- 主管单位: 华人消化杂志;新消化病学杂志
- 主办单位: 山西省科学技术厅
- 影响因子: 0.00
- 审稿时间: 1-3个月
- 国际刊号: 14-1260/R
- 国内刊号: 李军亮
- 论文标题 期刊级别 审稿状态
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小鼠骨髓树突状细胞改良培养及体外生物学特性的比较
目的:探讨小鼠骨髓树突状细胞体外生物学特性及用自体腹膜培养基代替细胞因子刺激树突状细胞体外生长的可能性.方法:无菌取小鼠的骨髓分离、培养DC前体,分别以小鼠腹膜分泌液和重组细胞因子mGM-CSF,mIL-4刺激培养使DC前体转化为DC,再用混合淋巴细胞增生反应(MLR)、细胞免疫组织化学染色及光镜、扫描电镜观察二种DC生物特性及免疫活性的差异.结果:培养6-8 d,二种方法培养的骨髓DC(BM-DC)均有大量细胞从集落中释放,并呈成熟状态,重组mGM-CSF,mIL-4刺激培养的DC得率稍高(6×106)于腹膜培养组(3×106),但无显著性差异;培养7 d BM-DC的B7-2表达较高,呈强阳性,混合淋巴细胞反应(MLR)中均表现出有强烈刺激同种T细胞增生的能力;尤以重组mGM-CSF,mIL-4组明显高于腹膜培养组,未加任何处理的空白对照组中DC前体具有非成熟DC的形态及功能特征,且无刺激同种T细胞增生的能力.结论:实验结果提示用自体腹膜培养基代替细胞因子刺激树突状细胞体外生长可获得一定数量的树突状细胞并具有相应的生物学特性及功能,基本能满足实验研究的需要,为基层单位开展树突状细胞的研究提供了可能性.
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中药双甲五灵冲剂对免疫性肝纤维化大鼠肝组织中TIMPs蛋白及基因表达的影响
目的:研究在活血化淤基础上辅以软坚散节自制的双甲五灵冲剂对大鼠肝纤维化模型抗纤维化的治疗机制.方法:采用免疫诱导型肝纤维化大鼠模型,80只Wister大鼠,分为5组,A预防组造模同时开始喂食双甲五灵冲剂;B治疗组1在造模结束的同时开始喂食双甲五灵冲剂;C治疗组2在造模结束3 mo后开始喂食双甲五灵冲剂;D秋水仙碱组在造模结束的同时开始喂食秋水仙碱;另设正常对照组10只.采用HE染色观察肝组织改变及Von-Gieson胶原纤维特殊染色以观察肝纤维化程度,并采用肝组织原位杂交及免疫组织化学染色观察大鼠肝脏组织中TIMP-1和TIMP-2 mRNA及蛋白的表达强度.结果:免疫诱导型肝纤维化大鼠,在造模结束后肝组织学改变呈进行性加重,以造膜结束后3 mo为著,其TIMP-1和TIMP-2 mRNA及蛋白呈强阳性表达,而经双甲五灵冲剂治疗后的大鼠与模型组大鼠相比,肝组织结构明显好转,纤维组织明显减少,TIMP-1和TIMP-2 mRNA及蛋白表达明显降低(P<0.05),并且其效果为:预防组效果好,治疗1组较治疗2组效果好,即造模同时开始喂食双甲五灵冲剂好,造模结束同时用药好于造模结束3 mo后用药,三组均明显优于秋水仙碱组.结论:中药双甲五灵冲剂治疗肝纤维化的机制可能通过抑制TIMP-1和TIMP-2 mRNA及蛋白的表达而降低对MMPs的抑制,从而有利于MMPs对细胞外基质的降解.
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苦参素对实验性大鼠肝纤维化防治作用的研究
目的:探讨苦参素对实验性大鼠肝纤维化的预防与治疗作用.方法:采用人血清白蛋白免疫损伤Wistar大鼠造成肝纤维化模型,60只Wister大鼠,分为5组:造模组、秋水仙碱治疗组、试验组Ⅰ(苦参素预防组)、试验组Ⅱ(苦参素治疗组),另设正常对照组.动态观察大鼠肝组织病例变化,采用HE染色观察肝组织改变及Von-Gieson胶原纤维特殊染色观察肝纤维化程度,并采用免疫组织化学染色及肝组织原位杂交检测Ⅰ型、Ⅲ胶原含量及Ⅰ型、Ⅲ型胶原mRNA的表达.结果:试验组肝组织结构明显好转,纤维组织增生程度明显低于肝纤维化模型组;Ⅰ型、Ⅲ型胶原含量及Ⅰ型、Ⅲ型胶原的mRNA表达均低于模型组免疫诱导型肝纤维化大鼠,其效果为试验组Ⅰ(苦参素预防组)效果好,试验组Ⅱ(苦参素治疗组)次之,秋水仙碱治疗组再次之,三组均优于造模组.结论:苦参素可减轻肝脏炎症活动、抑制肝内胶原合成,对实验性大鼠肝纤维化具有防治作用.
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核因子-κB在大鼠实验性溃疡性结肠炎肠组织的表达及其意义
目的:观察大鼠实验性溃疡性结肠炎肠组织核因子-κB(NF-kB)及TNF-α、ICAM-1的表达,探讨NF-κB在溃疡性结肠炎发病过程中的作用.方法:采用三硝基苯磺酸(TNBS)制备大鼠溃疡性结肠炎模型,设正常组、生理盐水组及轻、重模型组共4组.采用免疫组织化学染色检测肠组织NF-κB、TNF-α和ICAM-1表达,生化方法检测MPO含量,并分析NF-κB活性与肠道病理损伤指数、MPO含量、TNF-α及ICAM-1表达的关系.结果:溃疡性结肠炎大鼠肠组织中NF-κB活性,TNF-α、ICAM-1表达及MPO含量较正常组及生理盐水组显著增高(NF-κB:52.14±9.81、30.26±10.20,60.73±13.41、45.24±10.86 vs13.31±4.76、16.95±6.83,11.61±4.85、14.10±5.76;TNF-α:74.50±11.20、48.11±5.95,84.09±14.52、53.40±8.79vs16.99±5.48、20.04±6.76,10.13±1.79、16.03±6.21;ICAM-1:68.15±7.25、44.34±7.54,77.69±8.09、47.01±8.82vs15.34±4.03、17.50±6.95,10.33±2.38、13.41±4.91;MPO:1.69±0.11,0.71±0.06vs0.39±0.07,0.31±0.08;P<0.01),且在病情严重组增高尤为明显.NF-κB表达水平与TNF-α和ICAM-1阳性细胞密度、MPO含量、肠道病理损伤指数呈显著正相关关系(r分别为0.9 304,0.8 680,0.6 865,0.9 292,0.8 462;P<0.001或P<0.005).结论:NF-κB在溃疡性结肠炎发病过程中可能起重要作用.
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正常及实验性肝纤维化大鼠肝脏中的金属蛋白酶组织抑制因子-1
目的:了解金属蛋白酶组织抑制因子-1(TIMP-1)在正常及实验性肝纤维化大鼠肝组织中的定位及表达状态.方法:用人血白蛋白免疫攻击的方法制备实验性免疫性肝纤维化大鼠模型,以正常大鼠为对照.采用免疫组化法及原位杂交技术分别检测肝脏中TIMP-1 mRNA和相关抗原表达,同时用PCR技术检测肝脏中TIMP-1基因水平.结果:实验组肝脏中TIMP-1相关抗原表达在肌成纤维细胞、成纤维细胞,以汇管区及纤维间隔中明显,阳性信号位于细胞胞质中,未见细胞核表达.原位杂交检测结果也展示了上述相同的分布和定位.正常大鼠肝组织中可见TIMP-1基因表达,但表达水平极低.实验组肝组织中TIMP-1呈高水平表达.结论:在肝纤维化中,成纤维细胞及肌成纤维细胞是TIMP表达的主要细胞.随着病损肝脏中肝纤维化程度的加重,TIMP-1基因表达水平随之增高.
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肝细胞生长因子抗肝纤维化作用及对MMP-1,TIMP-1表达的影响
目的:研究肝细胞生长因子对实验性大鼠肝纤维化的防治作用,及其对大鼠肝脏基质金属蛋白酶1(MMP-1)抑制因子1(TIMP-1)表达的影响,探讨HGF抗肝纤维化作用的可能机制.方法:将Wistar ♂大鼠80只随机分为正常对照组(A组,16只),肝纤维化模型组Ⅰ(B组,54只),HGF治疗组Ⅰ(C组,10只),采用CCl4复合因素造模,治疗组于造模同时予HGF 0.5 μg/Kg,ip,qd,6 wk末造模成功处死C组大鼠,同时随机处死A组及B组大鼠各6只;对B组剩下大鼠行二次随机分组为模型对照组Ⅱ(D组,12只),HGF治疗组Ⅱ(E组,1 0只),E组于第7周开始给予HGF治疗,10 wk末处死大鼠.检测大鼠肝功能,血清透明质酸(HA),层粘蛋白(LN),Ⅲ型前胶原(PcⅢ),Ⅳ型胶原(CIV);免疫组化法检测肝组织MMP-1,TIMP-1的表达.结果:C组与B组比较,ALT,AST,HA,LN,CIV,PcⅢ均显著降低(P<0.01),MMP-1活性升高(0.25±0.02,vs0.22±0.05,P<0.05):TIMP-1活性明显降低(0.34±0.05,vs0.45±0.05,P<0.01).E组与D组相较,MMP-1活性变化无显著性,TIMP-1活性有明显降低(0.31±0.07,vs0.42±0.06,P<0.01).结论:肝细胞生长因子对肝纤维化有明显的防治作用,并可能通过促进MMP-1的活性或抑制TIMP-1活性而促进肝纤维化降解.
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丙型肝炎病毒超微结构研究进展
丙型肝炎病毒(HCV)基因组克隆成功后,人们对其基因组的研究已十分深入,但由于HCV病毒颗粒在感染者血中、肝脏中含量很低,血中HCV又往往与免疫复合物和脂蛋白包裹存在,以及缺乏有效的HCV体外培养体系和小动物模型,形态结构研究难度极大而相对滞后,有关HCV超微结构和病毒装配过程还知之甚少,多数研究认为HCV病毒颗粒由外膜及核心组成,外膜表面有钉状突起.HCV感染后的细胞多数可见扩大的胞质囊腔,病毒颗粒多存在胞质囊腔内,这些胞质囊腔认为来自扩大的细胞内质网.细胞核内、胞质、血清、体外培养细胞中HCV颗粒的大小、形式有差异,目前尚无统一认识,其在感染细胞内的形态结构和定位尚不清楚.本文就近年来有关HCV超微结构研究的相关文献进行回顾.
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隐匿性HBV感染是一个潜在的威胁
HAV-HEV 5种嗜肝病毒发现和采取严格的预防措施后仍有不明原因的肝炎发生和流行,10 a来进行了大量寻找新肝炎病毒的工作,但对其致病性至今仍为定论.于是近年又有不少学者深入研究了HBV的血清学谱,发现一部分未明原因肝炎实际由HBV引起.本文就HBsAg阴性HB存在的证据,机制以及如何定义和诊断综述如下.
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抗乙型肝炎病毒核酶的研究进展
全世界大约有3.5亿乙型肝炎病毒(HBV)携带者,这种感染者集中分布于包括我国在内的东南亚、东亚及非洲的撒哈拉地区.HBV的持续存在常可导致肝硬化以及肝癌,对于已感染HBV者,目前常用的化学及免疫疗法通常无效.因此,寻找新的抗HBV感染的手段成为热点.核酶做为一种成熟的、可剪切特异性RNA的分子生物学方法受到广泛重视.由于核酶有严格的序列特异性,长期使用对细胞无副作用,并且结构简单,可人工设计,因此,很有希望成为治疗HBV感染的新方法.目前,核酶已广泛用于抗病毒及抗肿瘤的研究,尤其对HIV的研究,已进入临床工作阶段.本文将从核酶的构成、核酶研究的热点以及抗HBV感染等方面进行阐述.
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IRES特异性IRNA在丙型肝炎抗病毒治疗中作用
丙型肝炎基因治疗是目前研究的热点,HCVIRES是丙肝病毒核酸复制和蛋白翻译的关键结构.目前针对IRES结构的治疗策略主要包括反义核酸、核酶、抑制性RNA等.现就抑制性RNA在HCV感染基因治疗中作用研究进展作简要综述.
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肠外高营养对重症溃疡性结肠炎患者血清胃动素,肽YY,IgG和糖蛋白含量的影响
目的:肠外高营养对重症溃疡性结肠炎患者血清胃动素,肽YY,IgG和糖蛋白含量的影响并讨论其变化的临床意义.方法:重症溃疡性结肠炎患者89例,男51例,女38例,年龄23-57(平均38±13)岁,均经电子结肠镜检查和X线钡灌肠检查,以及组织学检查确诊,并连续粪培养2次排除细菌感染,同时排除阿米巴肠病,血吸虫病,肠道肿瘤和内分泌疾病.病变部位包括乙状结肠45例,降结肠21例,结肠脾曲15例和横结肠8例;临床类型包括复发型44例,持续型30例和初发型15例.采取肠外静脉补充足够的营养,完全胃肠道休息.并于确诊后3 d内和治疗缓解后的上午07:00空腹采血,用放射免疫法(RIA)测定血清胃动素(MTL),肽YY(PYY)和IgG,用血清电泳法测定α1,α2和γ糖蛋白.结果:经过4 wk治疗后痊愈27例(30%),好转48例(54%),无效14例(16%),总有效率84%.与对照比较,重症溃疡性结肠炎患者血清MTL(ng/L,311.6±99.8vs207.3±98.4,P<0.01),PYY(pmol/L,1.6±.8 vs1.1±.6,P<0.05),IgG(g/L,23.6±10.2vs 13.1±6.9,P<0.01)和α1球蛋白(g/L,2.7±1.2vs1.5±0.9,P<0.01)明显升高,而α 2球蛋白(g/L,4.2±2.6 vs 6.8±2.3,P<0.05)则降低,但经过治疗后可恢复,治疗有效和无效患者间上述变化无明显差异(P>0.05).全部患者血清AST,ALT在正常范围,血清白蛋白治疗后明显好转(g/L,34.2±9.6vs21.4±8.7,P<0.05),组织学也明显改善.结论:重症溃疡性结肠炎肠外静脉高营养疗法是一种有效可行的方法,且可以改善血清MTL,PYY,IgG和α 1,α 2糖蛋白水平.
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COX-2在胰腺癌组织中的表达及其与P53的相关性研究
目的探讨环氧化酶-2(COX-2)和p53在胰腺癌组织中的表达与生物学行为之间的关系并探讨二者的相关性及可能机制.方法:用免疫组织化学Envision法对51例胰腺导管癌和11例癌旁非肿瘤胰腺组织的COX-2和p53的表达进行检测.结果:51例胰腺导管癌中COX-2和p53蛋白的表达率分别为74.5%和60.8%;二者在11例癌旁非肿瘤胰腺组织中均未发现阳性表达.COX-2的表达与临床分期和淋巴结转移有关(P=0.022,0.036),而与组织学分级关系不大(P=0.152);p53的表达与淋巴结转移有关(P=0.035),而与组织学分级、临床分期关系不大(P=0.131,0.078);COX-2的表达与p53的表达密切相关(r=452,P=0.001).二者的表达与患者的性别、年龄、肿瘤的大小、部位均无关.结论:COX-2和p53的协同作用可能在胰腺癌的发生发展过程中起重要作用,可能为胰腺癌的治疗提供了新的靶点.
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基因疫苗的基础研究及应用现状
基因疫苗已成为疫苗研究领域中的热点之一,特别是其研究方向与世界卫生组织儿童免疫长远目标-用一种疫苗预防多种疾病相吻合.从效力到成本的潜在优点已使基因疫苗成为今后疫苗制造的选择,故澳大利亚昆士兰医学所的Waine和McManus在
上论证,基因疫苗为第三次疫苗革命.令人鼓舞的是艾滋病和T细胞淋巴瘤的基因疫苗已进入到了临床前阶段.基因疫苗不仅能预防某些传染病,还可做为治疗用疫苗来治疗一些复杂难治的疾病,例如病毒性肝炎、癌症等.这些均已显示出基因疫苗的巨大潜力和应用前景.但是,基因疫苗的历史毕竟很短,实验结果均来自动物,在用于人体之前还有许多工作必须完成,其中重要的是解决基因疫苗对人体的安全性和效力问题,例如:(1)须用与人类疾病相关的动物模型证实其效果;(2)须用高度敏感的PCR技术等确证所注射的DNA不与宿主细胞基因组DNA整合,这是确保DNA疫苗遗传学安全性的重要指标之一;(3)终还需要近期和长期的临床试验以明确其毒副作用和免疫保护效果.我国已制定了基因转移治疗的管理条例,基因免疫作为预防性基因治疗技术,同样应遵守此条例,这样才有利于基因治疗的健康发展. -
抗HBV感染治疗中患者体内病毒学和耐药性等因素的动态变化及其临床意义
近年来应用即时荧光定量PCR技术对慢性乙型肝炎患者体内病毒载量动态变化进行分析,结合临床症状、肝功能以及相关资料,不仅有助于探讨乙肝致病机制,而且有助于判断慢性感染的进程和临床结局.根据不同患者病毒载量动态变化规律、耐药性和病毒准种的特点及其临床意义,适时调整治疗策略,进而指导临床医师开展有针对性的个体化抗病毒序贯治疗.
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IRES特异性IRNA对HCV IRES启动蛋白翻译细胞内抑制作用
目的:研究核糖体内部进入位点(internal ribosome entry site,IRES)特异性抑制性RNA(inhibitor RNA,IRNA)细胞内对丙型肝炎病毒(HCV)IRES介导蛋白翻译的抑制作用.方法:体外应用脂质体细胞转染法,将IRNA及其突变体mIRNA真核表达载体pcRz-IRNA/pcRz-mIRNA转染人肝癌细胞株(HHCC),经G418筛选4 wk后建立IRNA及mRRNA表达株;以相同的方法构建pcHCVcluc转染株;以脂质体介导细胞转染法将pCMVNCRLuc转染IRNA及mIRNA细胞株,于转染后48 h检测荧光素酶表达量;将IRNA及mIRNA真核表达体转染pcHCVcLuc表达株,于转染后不同时间检测荧光素酶表达量.结果:HCVIRES介导蛋白翻译在IRNA表达株明显受到抑制,同样IRNA对HCV翻译复制子的蛋白翻译作用有明显抑制性;突变体mIRNA表达株和空载体对照株中未见相似的抑制性.结论:pcHCVcluc在HHCC细胞中获得有效表达;IRES特异性IRNA能有效的抑制HCVIRES介导细胞内蛋白翻译作用.
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丙型肝炎病毒锤头结构核酶的细胞内免疫
目的:探讨预先转染丙型肝炎病毒(HCV)核酶(Rz213)的人肝癌细胞对HCV再转染的抑制作用.方法:应用从前构建的HCV锤头结构Rz(Rz213),通过脂质体介导的基因转染方法,转染人肝癌细胞(HHCC),经G418筛选转染Rz213的基因克隆,应用luc报告基因的表达活性,观察该细胞克隆对靶基因(pCMVNCRluc)转染的抑制作用.结果:G418 筛选能使 Rz213 在转染细胞内有效表达 RzRNA,转染Rz的多克隆细胞能有效地阻断靶基因的再转染.结论:我们构建的Rz213真核表达载体能在HHCC细胞内有效表达,预先转染发挥细胞内免疫作用,可防止HCV感染.
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复制缺陷型HCV C基因腺病毒表达载体的构建包装及鉴定
目的:构建能表达HCV C基因的复制缺陷型腺病毒表达载体.方法:将HCV H株C区基因定向插入到腺病毒穿梭质粒pAd.CMV-Link.1中,获得重组质粒pAd.HCV-C,再与pJM1 7共转染293细胞,包装腺病毒表达载体.通过酶切、PCR及测序对穿梭质粒进行了鉴定.对腺病毒载体进行了感染性鉴定、电镜鉴定及双引物PCR鉴定.利用间接免疫荧光法和Western blot检测了腺病毒载体在人肝癌细胞HepG2中的表达.结果:酶切、PCR及测序鉴定证实,穿梭质粒插入片段为HCV C区基因.包装的腺病毒载体具有良好的感染性,可以在293细胞中形成病毒颗粒,腺病毒载体内携带HCV C区基因,并可以在HepG2细胞中表达HCV C抗原.结论:包装成功的复制缺陷型腺病毒载体可以在HepG2细胞中表达HCV C抗原,为丙型肝炎的基因治疗及疫苗的进一步研究奠定了基础.
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乙型肝炎病毒准种异质性对干扰素应答性的影响
目的:了解乙型肝炎病毒(HBV)准种遗传异质性对干扰素(IFN-α)应答性的影响.方法:用构象敏感凝胶电泳(CSGE)对20例(完全应答者和无应答者各10例)已接受IFN-d治疗的慢性乙型肝炎患者治疗前血清中HBV准种的异质性进行检测,分析准种的异质性与IFN-α应答性的关系.结果:HBV DNA含量在IFN-d应答患者和非IFN-d应答患者之间无差异(7.27 ×1010±8.79×1010vs5.16×1010±5.13×10 10,P>0.05),但是,在无应答患者HBV准种的复杂性和遗传差异性明显高于应答患者(830±1.89 vs185±2.68,P<0.001和0.926±0.008vs0.869±0.016,P<0.001).结论:HBV准种的异质性对IFN-α的应答性有影响.
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基因芯片技术检测HBV HCV及HBV YMDD变异株
目的:探讨基因芯片技术在乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)及HBV YMDD变异株检测中的应用.方法:采用HBV、HCV联合基因芯片检测40份血清标本,并与HBV,HCV基因定量检测方法比较;采用HBVYMDD变异株芯片检测20份血清标本,并与错配PCR及DNA序列测定方法比较.结果:HBV,HCV联合基因芯片与HBV DNA定量检测的符合率为85%(34/40),HBV检出率为83%(19/23),假阳性率为12%(2/17);与HCV RNA定量检测的符合率为85%(34/40),HCV检出率为58%(7/12),假阳性率为4%(1/28).HBV YMDD变异株芯片与本室设计的错配PCR符合率为70%(14/20),5份芯片检测的标本与DNA序列测定结果一致,该芯片尚可检测出不同病毒体或变异体的混合感染.结论:HBV,HCV联合基因芯片对HBV的检测有较高的敏感性,但存在一定程度的非特异性;对HCV的检测敏感性偏低,但特异性较高.HBV YMDD变异株芯片敏感性和特异性均较高,同时能检测出病毒变异体的共生现象.
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慢型丙型肝炎患者干扰素治疗前后HCV HVR1准种的动态变化
目的:探讨感染HCV1b型慢型丙型肝炎患者HCV HVR1区准种的复杂性与干扰素疗效的关系,以便对干扰素治疗疗效进行预测.方法:应用IFN治疗的慢性丙型肝炎患者共20例,于治疗前、治疗后3 mo、6 mo留取血清,-70℃冻存待测.治疗方案为:干扰能3 mu,3次/wk,肌肉注射,共24 wk.HCV HVR1准种的检测采用单链构象多态性聚合酶链反应法(SSCP法).结果:IFN治疗前,35%(7/20)的患者表现为SSCP低复杂性(SSCP条带数≤3),65%(13/20)表现为高复杂性(SSCP条带数>3).治疗3 mo后,4例患者HCV RNA阴转,均发生在低复杂性组,其余大部分患者SSCP条带数减少1-2条带.治疗6mo时,7例患者HCVRNA阴转,仅2例发生在高复杂性组.治疗结束时13例(65%)无应答患者中,8例患者SSCP条带数均较治疗前减少,2例无变化,1例恢复到治疗前水平,2例较治疗前升高.结论:HCV HVR1区准种的复杂性可以对IFN治疗进行疗效预测,治疗前准种数少者可预测对IFN治疗有较好的应答.
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DNA疫苗对小鼠HCV-C皮下移植瘤的防治
目的:从病理组织学方面验证DNA疫苗对小鼠HCV-C皮下移植瘤的预防及治疗作用,为将来的临床应用提供动物实验依据.方法:利用脂质体转染技术将pcDNA HCV-C质粒转染SP2/0细胞并将稳定表达HCV C抗原的SP2/0细胞皮下接种于Balb/c小鼠,成瘤后取小鼠瘤组织,用病理组织学方法验证DNA疫苗对HCV-C皮下移植瘤的预防及治疗作用.结果:肿瘤组织中以T淋巴细胞浸润为主;HCV-C抗原表达主要在SP2/0细胞的细胞质和胞膜上,少数位于胞核中;对照组HCV-C抗原表达明显强于实验组.结论:HCV-C DNA疫苗对HCV的感染有预防和治疗作用.
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肝靶向十六酸拉咪呋啶酯固体脂质纳米粒抗乙肝病毒的研究
目的:探讨肝靶向十六酸拉咪呋啶酯固体脂质纳米粒抗HBV的作用.方法:以半乳糖苷为载体,构建十六酸拉咪呋啶酯固体脂质纳米粒(PLN-LAGS),将其靶向导入2.2.15细胞,共同温育10 d后,观察对细胞的毒性作用;同时将LAP-GSLN尾静脉注入小鼠体内,R P-H P L C测定拉米呋定(lamivudine,LA)在血清、肝、肾、肺及脾中的分布,用ELISA和荧光定量PCR检测多个时期培养上清中HBsAg,HBeAg和HBV DNA.结果:LAP-GSLN在肝脏中具有靶向性,LAP-GSLN组肝脏的含药量为LA组的3.3倍;导向后4d出现对HBV-DNA的抑制,在药物浓度10.0 m/L时LAP-GSLN组HBV DNA<1.11×107拷贝/L,而单纯LA组则为5.06×109拷贝/L;6 d出现对HBsAg,HBeAg抑制,在药物浓度0.01mg/L时,LAP-GSLN,LA组对HBsAg,HBeAg抑制率分别为52.9%,53.9%;32.2%,31.1%;在药物浓度10.0 mg/L时,LAP-GSLN,LA组对HBsAg,HBeAg抑制率分别为67.2%,69.0%;45.1%,41.0%.未发现对2.2.15细胞的毒性作用.结论:小剂量半乳糖介导十六酸拉米呋定脂质纳米粒能快速有效的抑制HBV抗原表达和DNA复制.
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乙型肝炎病毒慢性感染者血清中不同类型病毒转录体的检测及其意义
目的:建立针对乙型肝炎病毒(HBV)全长型(fRNA)和顿挫型转录体(trRNA)的血清学检测方法,并探讨其临床应用价值.方法:自患者血清中提取病毒核酸,经PCR及PRT-PCR进行扩增,琼脂糖电泳显示产物,Southem印迹验证反应的特异性.取代表性产物克隆,测序.结果:在HBV慢性携带者的血清中检测到了在上述不同poly(A)位点成熟的病毒RNA.血清中fRNA的检出与e抗原阳性和较强的病毒DNA信号相对应,与转氨酶活性呈正相关,这一血清学指标反映了病毒复制;而trRNA的检出与e抗原阳性和转氨酶活性无关,不象fRNA那样依赖于血清中病毒DNA的量.二者检出率随年龄有不同变化,前者随年龄增加而进行性减低乃至转阴;而后者在10-20岁期间检出率升至80%,以后维持在较高水平.即使在某些表面抗原阴性血清中,也能检测到trRNA和不在上述两个位点成熟的病毒RNA.这些转录体在某些隐源性肝硬变和丙型肝炎患者血清中也存在.结论:病毒转录体的血清学检测有助于确定目前尚不认识的HBV感染期,可用来更准确地区分复制期和非复制期以及检出隐匿性HBV感染.
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不同载体表达核酶对HBV mRNA细胞内表达的阻断作用
目的:探讨多位点自剪切核酶及突变核酶对细胞内HBVmuRNA的切割作用.方法:构建5个不同的多位点核酶及突变核酶的真核表达载体,将他们分别与乙型肝炎病毒全基因序列共转染HepG2细胞,用ELISA,共聚焦定量及图像分析的方法观察多位点核酶在细胞内对HBV mRNA切割作用.结果:构建的真核表达载体在细胞内确可表达出多位点核酶,核酶及突变核酶在细胞内对HBV基因的表达均有抑制作用,不同表达载体的抑制率不同,以tRNA启动子的表达载体抑制效率高,达81%,突变核酶亦有部分反义RNA的抑制效果.结论:抗乙型肝炎病毒核酶在细胞内可抑制HBV基因的表达,不同表达载体其核酶的表达效率不同.
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透射电镜及激光共聚焦技术观察体外丙型肝炎病毒感染的人胎盘滋养层细胞
目的:探讨体外分离培养的人体胎盘滋养层细胞感染丙型肝炎病毒(HCV)的可能性,以及滋养层细胞感染HCV后的超微结构改变.方法:采用胰蛋白酶消化法及Percoll密度梯度分离法分离培养人胎盘组织中滋养层细胞后,以HCV RNA阳性血清对滋养层细胞进行体外感染试验,应用RT-PCR法定性及定量检测感染后细胞培养上清中HCV RNA,透射电镜观察HCV感染后滋养层细胞的超微结构改变,并用激光共聚焦技术观察免疫荧光染色后HCV NS5在滋养层细胞中的定位.结果:HCV感染后的细胞培养上清中可间断检测到HCVRNA,而对照组始终未检出;激光共聚焦观察显示HCV NS5主要定位于细胞核周;HCV感染后滋养层细胞超微结构发生了明显改变,主要表现为溶酶体大量增生,粗面内质网增生,脂滴减少,出现空泡状结构,并可观察到病毒样颗粒.结论:HCV可以感染滋养层细胞,并导致滋养层细胞的超微结构发生类似黄病毒科病毒感染后的改变.
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拉咪呋啶预防乙肝相关性肝硬化肝移植术后乙肝再感染的临床对照研究
目的:了解乙肝相关性失代偿肝硬化肝移植术后使用拉咪呋啶预防移植物乙肝再感染的疗效及乙肝标志物在血清及肝组织中的动态变化.方法:用酶联放免法,血清HBVDNA荧光定量法、肝穿组织免疫组化LSAB法及HBV DNA原位杂交法定期检测25例受体血清及肝穿组织,观察肝移植术后HBV标志物在血清及肝组织中的动态变化.本研究设计为前瞻的开放的非随机的临床对照研究.25例被分为乙肝病毒活跃复制(15例)及非活跃复制组(10例)两组,皆以拉咪呋啶100 mfd术前后服用预防,非活跃复制组中有3例未能及时服用拉咪呋啶作为对照组.结果:在HBV活跃复制组,术前口服拉咪呋啶平均2 wk能使80%以上的患者血清HBVDNA阴转;继续口服,术后表面抗原消失,部分血清乙肝病毒抗体(表面抗体HBsAb 9/15,核心抗体HBcAb 13/15及HBeAb 11/15)可在术后1-2 wk出现,至6 mo可逐渐消失;血清中HBVDNA荧光定量可一直维持阴转的状态;肝穿组织中HbsAg,HBcAg及HBVDNA原位杂交可长期维持阴性.10例乙肝病毒活跃复制受体其HBV血清标志物在12--44 wk之间完全消失;本组中2例(2/15,13.3%)在2 a时发生拉咪呋啶预防失败而致移植物再感染或乙肝复发;在HBV非活跃复制组,乙肝病毒抗原抗体表达同活跃复制组:表面抗原术后即消失,乙肝病毒抗体即在1-2 wk出现(BsAb4/7,HBcAb 6/7,HBeAb 2/7),6 mo左右消失.3例(43%,3/7)在近2 a时血清及肝组织中HBV标志即完全消失.本组无移植物再感染,乙型肝炎复发及乙肝病毒相关死亡.若血清中重新出现表面抗原或HBVDNA荧光定量阳性或肝穿组织免疫组化或HBVDNA原位杂交阳性则可诊断为HBV再感染.未能及时服用拉咪呋啶的3例非活跃复制的乙肝受体分别在术后8、10、12 mo移植物感染及复发新肝乙型肝炎,移植物再感染率及乙肝复发率为100%,其中1例死于纤维淤胆性肝炎,后二者经加用拉咪呋啶治疗为主的综合治疗而缓解.本研究除对照组外,拉咪呋啶预防下移植物总的乙肝再感染率为9.1%(2/22),受体HB复发率为4.5%(1/22),1-2 a生存率达87%.结论:拉咪呋啶能有效地预防失代偿期乙肝相关性肝脏疾病受体、尤其是乙肝病毒活跃复制受体肝移植术后移植物乙肝病毒的再感染及乙型肝炎复发,甚至使血清中及移植物的乙肝病毒达到临床清除.远期疗效正在进一步的评价中.
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HCVNS3蛋白对正常人源肝细胞生长及MAPK磷酸化的影响
目的:研究丙型肝炎病毒非结构区3(HCV NS3)蛋白对正常人源肝细胞的转化及MAPK磷酸化调节的作用.方法:利用脂质体介导转染技术和G418筛选得到稳定表达NS3蛋白的正常人源性肝细胞QSG7701,PCR和免疫组化S-P法检测细胞中NS3的表达;细胞记数和软琼脂实验鉴定其生物学性质;抗磷酸化MAPK抗体和抗MAPK抗体Westem blot检测转染细胞MAPK活性及表达.结果:HCV NS3转染的QSG7701肝细胞,其NS3蛋白过度表达于细胞质;真核表达质粒pRcHCNS3-5'转染细胞倍增时间为12 h,较pRcHCNS3-3'、pRcCMV转染细胞和未转染的QSG7701明显缩短(分别24 h,26 h和28 h).pRcHCNS3-5'、pRcHCNS3-3'和pRcCMV转染细胞及正常肝细胞在软琼脂中的克隆形成率分别为33%、1.33%、1.46%、1.11%,pRcHCNS3-5'形成的克隆明显高于其他三种细胞(P<0.01).pRcHCNS3-5'转染细胞MAPK磷酸化程度明显高于其他三种细胞(分别为8 858±877,5 612±656,2 212±245和989±188).(P<0.01),而MAPK的表达量没有差异(P>0.05).结论:人源性正常肝细胞QSG7701是研究HCV NS3蛋白致病机制的较好的细胞系;HCV NS3蛋白N端多肽具有促进细胞增生和改变细胞表型的作用;HCV NS3蛋白N端多肽能上调MAPK活性,不影响MAPK的表达量.