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SARS实验室诊断技术研究现状
严重急性呼吸综合征(Serve Acute Respiratory Syndrome,简称SARS)是2003年主要在我国暴发流行的一种以发热和严重肺部感染为主要特征的新发急性传染病.经过国内外专家学者的病原体的分离和基因图谱的协作研究,2003年4月16日,WHO正式宣布,确认冠状病毒的一个变种是引起SARS的病原体[1].自加拿大科研人员率先成功地分离出SARS相关冠状病毒(SARS-CoV)以来[2],世界上不同实验室相继成功地分离出了SARS-CoV[3-5],同时研制开发出了不少可用于SARS-CoV感染的特异性实验室检查技术.这些实验室诊断技术主要可以分为以下几类:(1)病毒分离;(2)聚合酶链反应(PCR);(3)特异性抗体检测;(4)免疫组化法检测病毒抗原;(5)电子显微镜检查.这些技术大多未经多家实验室之间的标准化,在用于SARS-CoV诊断中其特异性、敏感性、准确性等方面还存在着差异.现就这些技术的研究情况作一综述.
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G-CSF及与辛伐他汀联合应用对大鼠急性心肌梗死后细胞凋亡的影响
随着凋亡相关研究的进展,心肌细胞凋亡与心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)的关系逐渐受到重视.本实验联合应用粒细胞集落刺激因子(granulocyte-colony stimu-lating factor,G-CSF)和辛伐他汀动员干细胞修复AMI后的梗死心肌,通过流式及免疫组化法检测细胞凋亡率和BCL-2/BAX比值,评价其干细胞动员作用对梗死后心肌细胞凋亡的影响.
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多药耐药蛋白P-gP170在胃癌中的表达
肿瘤对化疗药物的耐药性,常常影响化疗药物的效果,其耐药机理之一是由多药耐药基因(mdr-1)表达产物P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp 170)增高介导的多药耐药性(multidrugresistance,MDR)[1,2].本文应用免疫组化法检测了133例原发性胃癌P-gp170的表达,探讨其表达与组织学类型、生物学行为间的关系.
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免疫组化法检测胃癌患者淋巴结内微小转移灶
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不同级别胶质瘤中c-kit的表达及与预后的关系
近年来,有关c-kit基因与恶性肿瘤关系方面的研究有了很多新进展,指出c-kit基因高表达、突变与肿瘤的恶性生物学行为及预后有关.胶质瘤是中枢神经系统难治的常见恶性肿瘤,约占成人颅内肿瘤的40%~50%,为能进一步反映该肿瘤的生物学行为,我们应用免疫组化法检测c-kit基因蛋白在不同级别胶质瘤中的表达,分析其与胶质瘤分级及与患者生存期的关系,可望为胶质瘤恶性程度分级和预后判定找到一些新的提示.
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免疫组化技术诊断肾综合征出血热病毒的研究
肾综合征出血热病毒(hemorrhagic fever with renal syndrome virus,HFRSV)在我国广泛流行,其发病率和病死率均高,对人群的生命健康造成严重危害.目前,特异性诊断方法多为ELISA和免疫荧光技术,现在广泛应用尚存在一定难度,采用高效价优质抗原片进行酶免疫组化法检测,能早期快速诊断,方法简便易行,敏感性高,特异性强.
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器官移植术后人类巨细胞病毒感染的诊断
外周血白细胞(WBC)中人类巨细胞病毒(HCMV)抗原的出现称之为抗原血症,我们采用EnvisionTM免疫组化法检测外周血白细胞中HCMV抗原从而诊断HCMV感染,达到了早期、快速的目的,并指导临床合理治疗.研究对象为广州地区122例器官移植术后受者,其中肾移植86例,骨髓移植20例,肝移植12例,脐血造血干细胞移植4例.移植术后2周起,每周采血1次,2ml/次.共采集抗凝外周全血328份.
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趋化因子受体CXCR3在慢性乙肝患者肝脏组织中的表达
趋化因子是反映炎症活动的新型敏感指标,趋化因子受体是能够特异性结合趋化因子的细胞膜蛋白,通过与相应配体结合对表达该受体的多种淋巴细胞趋化和激活,在机体防御、抗感染等多种炎症性疾病中起重要作用.为了解趋化因子受体CXCR3在慢性乙肝致病过程中的作用,本文选择45例慢性乙肝患者以SP(streptavidin-peroxidase)免疫组化法检测患者肝活检组织中CXCR3蛋白表达水平下.
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刺五加注射液对脑缺血再灌注模型脑组织bcl-2及p53表达的影响
既往实验研究表明,刺五加注射液对脑缺血再灌注造成的损伤有保护作用,但在细胞凋亡方面的研究尚未见报道.今以免疫组化法检测bcl-2及p53在脑缺血大鼠脑组织中的动态变化表达,进一步研究刺五加注射液对脑缺血再灌注的保护作用.
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十二指肠溃疡患者H pylori根治前后NO、TNFα含量和NOS表达的变化及意义
目的:观察H pylori感染对十二指肠溃疡(DU)患者NOS、NO和TNFα的影响,探讨H.pylori感染、NO和TNFα在DU中的作用和意义.方法:随机选择经电子胃镜和病理检查确诊的H pylori阳性DU患者60例,采用快速尿素酶试验、组织涂片Gram染色和Warthin-Starryz银染色进行Hpylori检测.用兰索拉唑+阿莫西林+克拉霉素治疗7 d,于H pylori根治前后检测血清NO、TNFα的含量、免疫组化法检测胃窦黏膜eNOS和iNOS蛋白的表达,并与内镜和病理检查证实胃黏膜大致正常H.pylori阴性的15名健康志愿者作对照观察.结果:H pylori根治率为82.14%(46/56),溃疡愈合率89.28%(50/56).正常人胃黏膜以eNOS表达为主、iNOS表达很少,NO、TNFα含量少,H pylori感染后胃黏膜eNOS、iNOS表达和NO、TNFα含量较正常对照增加(3568.78±624.34,238.43±72.92与2448.27±723.31,138.53±59.65;P<0.001),iNOS表达更显著.H pylori根除后,eNOS、iNOS的表达以及NO和TNFα含量(2908.74±717.58,142.43±58.63)均低于治疗前(P<0.001),但iNOS和NO仍高于正常对照组(P<0.05).结论:iNOS过度表达和NO、TNFα含量增加可能在消化性溃疡的发病机制中发挥一定作用,有可能是H pylori感染导致消化性溃疡的发病机制之一.NO在溃疡的愈合中也起一定作用.
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脆性组氨酸三联体基因蛋白表达与炎症性肠病的临床关系
目的:探讨脆性组氨酸三联体基因(fragile histidine trail,FHIT)蛋白在38例溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)、25例Crohn's病、11例UC相关性腺癌和13例正常对照组中的表达情况.方法:标本常规石蜡包埋,采用免疫组化法检测FHIT在UC、Crohn's病、UC相关性腺癌和正常对照组中的表达.结果:38例UC中,25例FHIT蛋白表达阴性;25例Crohn's病中,19例表达阴性;11例UC相关性腺癌中,6例表达阴性.FHIT蛋白在UC和正常对照组(71.43% vs 7.69%,x2=18.80,P<0.01)、Crohn's病和正常对照组(76%vs 7.69%,x2=18.88,P<0.01)、UC相关性腺癌和正常对照组(54.55% vs 7.69%,X2=7.75,P<0.05)间均有显著性差异;而在UC和UC相关性腺癌中无显著性差异(54.55% vs 71.43%,X2=0.05,P>0.05).结论:FHIT蛋白在炎症性肠病(inflammatory bowel disease,IBD)和UC相关性腺癌中呈低表达或缺失,提示该基因可能与IBD和UC相关性腺癌发生有关.
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大鼠胃电节律失常模型胃肌间Cajal间质细胞含量的变化
目的:观察胃电节律失常大鼠模型中胃肌间Cajal间质细胞(Interstitial Cells of Cajal,ICC)含量的变化,以探讨该模型病理机制,为今后的研究奠定基础.方法:采用不规则喂养法制备大鼠胃电节律失常模型,用免疫组化法检测其胃肌间c-kit阳性ICC含量的变化.结果:胃电节律失常模型大鼠的胃肌间c-kit阳性ICC含量比正常对照组明显升高(P<0.001).结论:张氏大鼠胃电节律失常模型中作为起搏细胞的ICC的增加,可能导致异常的胃电起搏点的增加,从而引发胃电节律失常.
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高压氧加自由基拮抗剂对大鼠肝脏基质金属蛋白酶-2表达的影响
目的:观察高压氧加自由基拮抗剂对大鼠肝脏损伤早期及肝纤维化形成过程中肝脏基质金属蛋白酶-2(MMP-2)表达的影响方法:用CCl4建立大鼠肝纤维化模型,在2 wk和8 wk分别给予高压氧结合自由基拮抗剂、高压氧、自由基拮抗剂处理,放免法测定血清透明质酸(HA)的含量,以了解细胞外基质合成情况,免疫组化法检测肝组织MMP-2蛋白以及其调节相关的生长因子TGF-β1蛋白的表达;应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测MMP-2 mRNA水平.结果:实验2 wk末模型组高压氧结合自由基拮抗剂组肝脂肪变性和水样变性及点状坏死与模型组相比明显减轻,MMP-2蛋白及mRNA,TGF-β1蛋白表达均低于模型组,差异显著(MMP-2:5.04±1.34 vs 56.75±3.03,P<0.01;MMP-2 mRNA:0.155±0.005 vs 0.547±0.013,P<0.01;TGF-β1:3.28±0.33 vs 4.96±0.28,P<0.01).血清HA虽低于模型组,但无显著差异(P>0.05).实验8 wk末模型组肝小叶内纤维结缔组织增生明显并形成粗细不等的纤维条索,高压氧结合自由基拮抗剂组以肝细胞脂变和细胞水肿为主,纤维结缔组织无明显增生,肝组织MMP-2蛋白及mRNA,TGF-β1蛋白表达和血清HA水平与模型组相比均明显为低(MMP-2:12.53±2.51 vs 160.57±5.54,P<0.01;MMP-2 mRNA:0.506±0.013 vs 0.685±0.014,P<0.01;TGF-β1:4.97±0.35 vs 7.76±0.39,P<0.01;HA:116.8±17.7μg/L vs 87.8±31.6μg/LP<0.01).高压氧组、自由基拮抗剂组在2 wk末和8 wk末肝损伤略轻于模型组,MMP-2蛋白和TGF-β1蛋白表达均低于模型组,且高压氧组MMP-2 mRNA表达亦较模型组低.结论:高压氧结合自由基拮抗剂可以降低CCl4损伤大鼠肝脏MMP-2表达,可以迟滞肝纤维化病变的发展.
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中药健胃愈疡颗粒剂治疗大鼠实验性胃溃疡
目的:研究健胃愈疡颗粒治疗消化性溃疡的机制.方法:采用改良Okabe法复制大鼠胃溃疡模型.76只SD大鼠随机分为4组,除正常组外,其余三组均手术造模,每日灌胃分别饲以蒸馏水和不同药物,连续7 d或14 d后取溃疡胃组织,作常规病理检查,观察溃疡情况,TUNEL法检测细胞凋亡,免疫组化法检测各指标蛋白表达,原位杂交法法检测各指标mRNA表达.结果:JWYY治疗组在7 d和14 d后,溃疡指数(1.7±0.5,0.8±0.4)、凋亡指数(3.0±0.4,2.0±0.5)明显降低;MK蛋白(33.7±3.7,38.0±4.1)和mRNA(22.6±2.9,30.5±3.7)、EGFR蛋白(39.6±4.9,31.9±6.8)和mRNA(26.6±5.0,17.4±1.6)表达明显升高,较模型组和胃苏组有显著统计学差别(P<0.01或0.05).JWYY组7 d时TNF-α蛋白(18.7±3.3)和mRNA(11.4±3.0)表达显著低于模型组(26.1±3.8,;17.1±2.7;P<0.01),而高于正常组(4.0±0.9,3.3±1.0,P<0.01);14d时各组则无明显统计学差别(P>0.05).JWYY组7d和14d时Bcl-2蛋白(33.5±6.8,32.9±9.6)、mRNA(26.1±4.5,23.0±6.2)及mRNA Bcl-2/Bax(1.4±0.3,1.5±0.4),蛋白Bcl-2/Bax(1.3±0.3,1.7±0.7)均显著高于模型组(P均<0.05或0.01).结论:JWYY颗粒通过提高Bcl-2、Bcl-2/Bax抑制细胞凋亡,降低TNF-α表达,提高MK、EGFR表达而促进溃疡愈合,提高溃疡愈合质量.
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幽门螺杆菌感染与慢性胃炎胃黏膜组织中COX-2、iNOS表达的相关性研究
目的:探讨幽门螺杆菌(Hpylori)感染对曼性胃炎胃黏膜环氧化酶-2(COX-2)、一氧化氮合酶(iNOS)表达以及对胃上皮细胞增生与凋亡的影响,阐明Hpylori可能的致癌机制.方法:22例经胃镜及病理确诊为慢性浅表性胃炎患者,采用快速尿素酶及改良Giemsa染色法检测Hpylori;采用半定量RT-PCR和免疫组化法检测胃黏膜中COX-1、COX-2和iNOS的表达;以染色法原位检测胃上皮细胞的凋亡;以免疫组化法检测胃上皮细胞的增生.结果:与正常对照组相比,Hpylori相关性胃炎胃黏膜组织COX-2和iNOS表达明显增高,增生、凋亡指数差异显著;Hpylori感染导致的COX-2和iNOS表达程度与胃黏膜上皮细胞增生、凋亡呈正相关(r=0.716,0.603,P<0.01;r=0.665,0.572,P<0.01).结论:Hpylori感染导致胃黏膜COX-2和iNOS的高表达,与胃上皮细胞的增生与凋亡失衡有关,从而参与致癌.
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肝细胞生长因子抗肝纤维化作用及对MMP-1,TIMP-1表达的影响
目的:研究肝细胞生长因子对实验性大鼠肝纤维化的防治作用,及其对大鼠肝脏基质金属蛋白酶1(MMP-1)抑制因子1(TIMP-1)表达的影响,探讨HGF抗肝纤维化作用的可能机制.方法:将Wistar ♂大鼠80只随机分为正常对照组(A组,16只),肝纤维化模型组Ⅰ(B组,54只),HGF治疗组Ⅰ(C组,10只),采用CCl4复合因素造模,治疗组于造模同时予HGF 0.5 μg/Kg,ip,qd,6 wk末造模成功处死C组大鼠,同时随机处死A组及B组大鼠各6只;对B组剩下大鼠行二次随机分组为模型对照组Ⅱ(D组,12只),HGF治疗组Ⅱ(E组,1 0只),E组于第7周开始给予HGF治疗,10 wk末处死大鼠.检测大鼠肝功能,血清透明质酸(HA),层粘蛋白(LN),Ⅲ型前胶原(PcⅢ),Ⅳ型胶原(CIV);免疫组化法检测肝组织MMP-1,TIMP-1的表达.结果:C组与B组比较,ALT,AST,HA,LN,CIV,PcⅢ均显著降低(P<0.01),MMP-1活性升高(0.25±0.02,vs0.22±0.05,P<0.05):TIMP-1活性明显降低(0.34±0.05,vs0.45±0.05,P<0.01).E组与D组相较,MMP-1活性变化无显著性,TIMP-1活性有明显降低(0.31±0.07,vs0.42±0.06,P<0.01).结论:肝细胞生长因子对肝纤维化有明显的防治作用,并可能通过促进MMP-1的活性或抑制TIMP-1活性而促进肝纤维化降解.
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不同来源的人肠上皮细胞内毒素相关受体的表达
目的:研究人肠上皮细胞内毒素相关受体的表达规律,探讨其耐受内毒素的分子机制,为炎症性肠病(IBD)发病机制的阐明拓宽新的视野和思路.方法:用核糖核酸酶保护法(RPA)检测原代培养人正常肠上皮细胞(HNIEC)和人小肠上皮细胞株(HIC)内毒素相关受体CD14,Toll样受体4(TLR4)和MD-2 mRNA的表达;用免疫组化法检测人正常小肠黏膜上皮细胞和结肠黏膜上皮细胞CD14,TLR4和MD-2蛋白的表达.以表达TLR4,CD14和MD-2的人单核细胞系THP1细胞作为阳性对照.结果:HNIEC CD14、TLR4、MD-2mRNA均呈低表达,HIC CD14,TLR4,MD-2 mRNA均无表达.小肠黏膜上皮细胞和结肠黏膜上皮细胞3种内毒素受体CD14,TLR4,MD-2蛋白均无表达.结论:肠上皮细胞表面CD14、TLR4和MD-2呈低表达或不表达可能是其耐受内毒素作用的重要分子机制之一.
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cFLIP基因表达与胃癌的关系研究
目的:探讨cFLIP基因在胃癌组织中表达状况及其与胃癌发生发展的关系.方法:采用免疫组化法检测cFLIP short/long基因在48例胃癌、48例肠化胃黏膜及42例慢性胃炎黏膜中的表达,并经计算机图像分析,计算阳性细胞百分率.统计采用方差分析.结果:cFLIPshort/long基因全部表达于胃癌组织,部分表达于肠化胃黏膜及慢性胃炎黏膜.胃癌组织中cFLIP基因表达强度(强阳性占70.8%)显著高于肠化胃黏膜(P<0.01)及慢性胃炎黏膜(P<0.01),且与胃癌浸润深度(P<0.05),胃癌TNM分期(P<0.05)显著相关.而肠化胃黏膜与慢性胃炎中cFLIP基因表达差异无显著性(P>0.05).结论:cFLIPshort/long基因特异性高表达于胃癌组织且在胃癌转化过程中是一较晚期事件,与胃癌的发生及浸润转移密切相关.
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反义IGF-Ⅰ寡核苷酸转染对人肝癌细胞生长的抑制作用
目的:利用反义核酸技术,研究体外胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)反义寡核苷酸转染对肝癌细胞增生、分化及凋亡的影响,探讨寡核苷酸转染治疗肝癌的可行性.方法:合成针对IGF-Ⅰ的寡核苷酸片段,利用脂质体包裹反义IGF-Ⅰ寡核苷酸片段瞬时转染人肝癌细胞系BEL-7402细胞,MTT法检测细胞增生;放免法检测培养细胞上清中AFP,CEA的分泌量;免疫组化法检测转染细胞AFP,PCNA表达的变化;采用末端标记(Tunel)法检测细胞凋亡的变化.结果:MTF法检测转染反义IGF-Ⅰ寡核苷酸的人肝癌细胞系BEL-7402A值由0.44±0.09下降为0.30±0.07(P<0.01),上清液AFP和CEA水平分别由12.5±2.2 μg/L和6.8±2.3μg/L下降为2.5±0.3μg/L和2.2±1.5μg/L(P<0.01,P<0.05),凋亡阳性细胞数由16.4±2.3%增加至23.1±3.7%(P<0.05).结论:反义IGF-Ⅰ寡核苷酸转染人肝癌细胞系BEL-7402细胞可以降低细胞增生,减少细胞去分化并诱导肝癌细胞凋亡.
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热盐水致胃黏膜细胞凋亡及对热休克蛋白表达影响
目的:研究热盐水灌胃导致的大鼠萎缩性胃炎(CAG)胃黏膜组织中的凋亡细胞、增生细胞和Bcl-2、Fas、HSP60、HSP70、HSP90α及P53表达状态,以探讨CAG发病机制及长期热咸饮食与慢性萎缩性胃炎发生的关系.方法:采用脱氧核糖核酸转移酶介导等缺口末端标记(TUNEL)技术及免疫组织化学染色技术.细胞凋亡时DNA含量分析采用流式细胞检测技术.结果:TUNEL检测细胞凋亡显示:在热盐水所致的大鼠萎缩性胃炎中凋亡细胞数明显增多,在黏膜全层均可见到,呈弥漫性分布.萎缩性胃炎中凋亡细胞指数显著高于正常大鼠胃黏膜(P<0.05);免疫组化法检测凋亡相关基因和PCNA,显示:Bcl-2、Fas、HSP60、HSP70、HSP90α、P53及PCNA在热盐水灌胃所致的萎缩性胃炎中的表达率显著高于正常胃黏膜(P<0.05);流式细胞检测显示:在萎缩性胃炎时,在G0/G1峰前可见一个亚G0/G1峰,也即凋亡细胞峰出现,而在正常胃黏膜时未显示亚G0/G1峰.结论:热盐水灌胃可导致大鼠胃黏膜组织细胞增生和细胞凋亡异常,其调控基因(Bcl-2、Fas)及HSP60、HSP70、HSP90α、P53在热盐水所致的大鼠萎缩性胃炎发生中起重要作用.