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着床期小鼠子宫内膜促血管生成素-2的表达
目的检查促血管生成素-2(Ang-2)蛋白在小鼠着床期子宫内膜的分布及mRNA的表达,以探究Ang-2基因表达在着床过程中的作用和生物学意义(OD).方法取妊娠2、4、6和8 d的小鼠子宫内膜(蜕膜),运用免疫组织化学S-P法和原位杂交技术,检测着床期子宫内膜中Ang 2蛋白的表达及mRNA的转录水平.结合图像分析技术检测不同时期子宫内膜中Ang-2表达的平均光密度(OD).结果结果显示,Ang-2特异性免疫反应产物在基质细胞及腔上皮细胞胞浆中表达,随着妊娠天数的增加,表达逐渐增强(P＜0.01).原位杂交显示,Ang-2 mRNA自妊娠第2天起即表达于基质细胞和腺上皮;第4天血管壁胞浆中也出现阳性表达,且其表达强度在妊娠第6、8天时逐渐增加.平均OD值具有显著性差异(P＜0.01).结论在小鼠妊娠过程中Ang-2和Ang-2 mRNA在着床前小鼠子宫内膜中即开始表达,并随妊娠进程而表达增强,提示Ang-2基因在"胎-母"对话的信号传导过程中起调节作用.
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减肥胶囊减肥机理的分子水平研究
目的 从分子水平探讨减肥胶囊对营养性肥胖大鼠的减肥机理. 方法 采用组织原位杂交技术观察药物治疗组和模型对照组大鼠脂肪组织瘦素基因(LeptinmRNA),下丘脑神经肽Y基因(NPYmRNA)及解偶连蛋白2基因(UCP2mRNA)表达水平,采用放射性免疫技术检测药物治疗组及非药物治疗组大鼠血清瘦素(Leptin)及神经肽Y(NPY)的含量. 结果 减肥剂量高、低剂量组均可降低大鼠血清Leptin水平,但与模型对照组比较,差异无显著性(P＞0.05);用药后高、低剂量组大鼠血浆NPY水平均有降低,与模型对照组比较差异有显著性意义(P＜0.05或P＜0.01).减肥胶囊高剂量组脂肪组织LeptinmRNA及下丘脑NPYmRNA表达水平下降,同模型对照组相比,差异有显著性意义(P＜0.05或P＜0.01);减肥胶囊高、低剂量组UCP2mRNA水平均升高,与模型对照组比较,差异有显著性意义(P＜0.05或P＜0.01). 结论 减肥胶囊的作用机理可能是影响了大鼠脂肪组织Leptin mRNA、下丘脑NPY及UCP2mRNA基因的表达.
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内参照基因表达检测在宫颈石蜡组织原位杂交中的运用及意义
原位核酸杂交目前已广泛运用于组织和细胞基因表达定位和水平测定.但在实际运用中存在两个主要问题:(1)标本间的定量比较,缺乏比较的基准;(2)对于阴性结果,如何区别杂交失败的阴性结果和由于RNA的降解而出现的阴性结果.3-磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)和β-肌动蛋白为细胞的看家基因,其表达水平在不同活动中相对稳定,被广泛运用于基因表达水平检测的内参照基因[1-3],但尚未在原位杂交中作为内参照基因运用.我们通过制备GAPDH和β-肌动蛋白探针,对存档的正常和病理宫颈石蜡组织做了原位杂交检测,并与抑癌基因p53、癌基因c-myc的表达改变相比较,探讨其表达检测是否可作为组织和细胞原位杂交的阳性对照或基准.
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中药双甲五灵冲剂对免疫性肝纤维化大鼠肝组织中TIMPs蛋白及基因表达的影响
目的:研究在活血化淤基础上辅以软坚散节自制的双甲五灵冲剂对大鼠肝纤维化模型抗纤维化的治疗机制.方法:采用免疫诱导型肝纤维化大鼠模型,80只Wister大鼠,分为5组,A预防组造模同时开始喂食双甲五灵冲剂;B治疗组1在造模结束的同时开始喂食双甲五灵冲剂;C治疗组2在造模结束3 mo后开始喂食双甲五灵冲剂;D秋水仙碱组在造模结束的同时开始喂食秋水仙碱;另设正常对照组10只.采用HE染色观察肝组织改变及Von-Gieson胶原纤维特殊染色以观察肝纤维化程度,并采用肝组织原位杂交及免疫组织化学染色观察大鼠肝脏组织中TIMP-1和TIMP-2 mRNA及蛋白的表达强度.结果:免疫诱导型肝纤维化大鼠,在造模结束后肝组织学改变呈进行性加重,以造膜结束后3 mo为著,其TIMP-1和TIMP-2 mRNA及蛋白呈强阳性表达,而经双甲五灵冲剂治疗后的大鼠与模型组大鼠相比,肝组织结构明显好转,纤维组织明显减少,TIMP-1和TIMP-2 mRNA及蛋白表达明显降低(P＜0.05),并且其效果为:预防组效果好,治疗1组较治疗2组效果好,即造模同时开始喂食双甲五灵冲剂好,造模结束同时用药好于造模结束3 mo后用药,三组均明显优于秋水仙碱组.结论:中药双甲五灵冲剂治疗肝纤维化的机制可能通过抑制TIMP-1和TIMP-2 mRNA及蛋白的表达而降低对MMPs的抑制,从而有利于MMPs对细胞外基质的降解.
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针刺治疗急性脑卒中引发心脏损伤及心律失常研究
本课题为了揭示针刺保护急性脑卒中引发心脏损伤的作用机制及探讨急性脑卒中引发心脏损伤的病生理机制,从临床和实验研究两个方面,采用心电描记、高压液相、放射免疫、生物化学及组织原位杂交等技术观察了急性脑卒中患者的心电图、心肌酶谱、心率变异性改变,检测了血中儿茶酚胺、内皮素及一氧化氮含量,同时利用实验性脑出血大鼠模型观察了急性脑出血后的脑组织、心肌形态学观察;脑出血及周围区、心肌和中枢心血管特定调节区域--下丘脑、脑干及海马区儿茶酚胺、乙酰胆碱、内皮素、一氧化氮含量及ET mRNA的表达.同时观察了针刺对此的干预作用,并进行了不同针法的疗效比较研究,结果发现:
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葛根素抑制HCY所致血管内皮细胞凋亡及其相关机制的研究
目的:差异筛选葡萄糖凋节蛋白78(glucose regulated protein 78,GRP78)基因,观察其在动脉粥样硬化(athemsclero-sis,AS)病灶中的表达水平,探讨葛根索抗AS的可能机制.方法:建立同型半胱氨酸(homocysteinemia,HCY)诱导的人主动脉血管内皮细胞损伤模型,与不同浓度葛根素(10-7mol/L、10-6mol/L、10-5mol/L)共同培养48 h,Annexin V-FITC检测血管内皮细胞凋亡率,RT-PCR筛选差异表达的GRP78基因片段,制备地高辛标记探针,高脂饲料复制兔AS模型,主动脉组织原位杂交检测GRP78 mRNA表达水平.结果:经葛根素处理48 h后,各组血管内皮细胞凋亡率均低于HCY组(P<0.05、P<0.01),且随葛根素剂量增加而减少;筛选出全长648bp的基因片断与兔葡萄糖调节蛋白78基因高度同源,组织原位杂交显爪该基因在AS病灶血管内皮细胞胞质中高表达.结论:GRP78基因参与AS病变形成;葛根素拮抗HCY诱导的血管内皮细胞凋亡,下调GRP78基因表达水平可能是其作用机制之一.
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Attractin蛋白和mRNA在不同日龄大鼠睾丸中的表达
目的:已知成熟大鼠睾丸组织中有Attractin蛋白的广泛表达,本文旨在进一步探讨Attractin蛋白和Attractin mRNA在各年龄段大鼠睾丸组织中的分布.方法:取出生第1 d(新生鼠)、第5 d(青春前期)、第20 d(青春中期)、第50 d(青春后期)及第70 d(成年期)大鼠睾丸和附睾组织固定,采用酶免疫组织化学和原位杂交方法检测Attractin和Attractin mRNA在大鼠睾丸组织中的表达.结果:免疫组化显示各年龄段大鼠睾丸生精小管和间质细胞、管周肌样细胞上均有Attractin蛋白的表达,分布于胞膜和胞质,精子和附睾上未见表达.随着日龄的增加,间质细胞的表达逐渐增强.原位杂交显示各年龄段大鼠睾丸生精小管和间质细胞、管周肌样细胞、支持细胞上也均有AttractinmRNA阳性棕色颗粒杂交信号,主要表达于胞核及胞质.且随着日龄的增加,睾丸生精细胞表达略强于间质细胞.精子和附睾上未见表达.结论:Attractin mRNA和Attractin蛋白在各日龄大鼠睾丸组织中均有广泛的分布,且分布一致.提示各日龄大鼠睾丸组织都具有合成Attractin蛋白的能力.其生理功能和机制尚有待进一步探讨.
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心脉通对家兔颈动脉内皮损伤后原癌基因c-myc表达的影响
目的:探讨中药复方制剂心脉通胶囊防治经皮腔内冠状动脉成形术(PTCA)后再狭窄的作用机理.方法:用Fishman空气干燥法,建立家兔颈动脉内皮损伤模型,以组织原位杂交方法观察心脉通对家兔颈动脉内皮损伤后原癌基因c-myc表达的影响.结果:心脉通组基因杂交阳性颗粒表达信号弱,而华法令和手术空白对照组基因表达信号显著增强,杂交阳性细胞数、杂交信号平均光度对比、杂交信号实面积、杂交信号积分光密度,均明显少于华法令和手术空白对照组.结论:心脉通具有抑制家兔动脉内皮损伤后c-myc基因高表达的作用,其有效防治PTCA后再狭窄的作用机理之一可能是通过抑制动脉内皮损伤后c-myc表达,从而间接抑制PDGF等生长因子分泌,达到抑制平滑肌细胞增殖的作用.
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丹参酮ⅡA拮抗血管内皮细胞凋亡相关机制研究
目的:观察葡萄糖调节蛋白78 (glucose regulated protein 78,GRP78)基因在动脉粥样硬化(athemsclerosis,AS)病灶中的表达情况及丹参酮ⅡA对同型半胱氨酸(homocysteinemia,Hcy)诱导的血管内皮细胞凋亡的影响,探讨丹参酮ⅡA抗AS的可能机制.方法:建立Hcy所致血管内皮细胞损伤模型,用不同浓度丹参酮ⅡA药物干预,Annexin V-FITC法检测凋亡率；高蛋氨酸饲料复制兔AS模型,地高辛标记探针组织原位杂交检测GRP78 mRNA表达水平.结果:丹参酮ⅡA组血管内皮细胞凋亡率低于Hcy组(P＜0.01),组织原位杂交显示GRP78基因在AS病灶血管内皮细胞胞质中高表达.结论:丹参酮ⅡA拮抗Hcy诱导的血管内皮细胞凋亡,下调GRP78基因表达水平,减缓内质网应激可能是其血管内皮细胞保护作用途径之一.
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吗啡依赖大鼠部分脑区表达突触结构改变及其地卓西平的影响
阿片依赖是一种慢性复发性脑病,严重危害个体身心健康、家庭幸福及社会安定.戒毒成败关系着民族兴衰及国家兴亡.现有戒毒方法均难以有效地降低复吸率,其重要原因在于对阿片依赖的神经可塑性机制了解较少.我院张瑞岭教授在建立SD大鼠吗啡依赖及药理干预模型的基础上,有机地将行为学观测、免疫组化、组织原位杂交、透射电镜技术结合起来,系统研究模型大鼠部分脑区AC-Ⅷ、突触素Ⅰ、PENK、DBI、DAT、5-HTT基因表达、突触界面结构参数改变,以及NMDA受体拮抗剂-地卓西平对部分上述研究指标的影响.研究结果不但为阿片依赖神经可塑性理论提供了直接科学依据并且也为NMDA受体在阿片依赖神经可塑性中的重要作用提供了科学依据.
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慢性酒精刺激对大鼠海马突触素ⅠmRNA表达的影响
目的探讨慢性酒精刺激对大鼠海马突触素Ⅰ(synapsin Ⅰ)mRNA表达的影响.方法设立正常对照组(即纯水组)与实验组,两组动物分别以纯水、10%酒精为唯一饮料连续喂养,两组动物又分30d与60d两组.用组织原位杂交技术观察海马突触素ⅠmRNA表达的变化.结果正常对照组大鼠海马CA各区及齿状回有强的突触素ⅠmRNA表达.慢性酒精刺激30d后突触素ⅠmRNA在海马的表达与正常对照组相比有显著下降.慢性酒精刺激60d后突触素ⅠmRNA在海马的表达与30d相比进一步下降.结论慢性酒精中毒引起大鼠海马突触素ⅠmRNA表达的下降,其表达的下降可能与学习记忆障碍有关.
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多囊卵巢综合征与卵泡抑素关系的初步研究
目的检测卵泡抑素(FS)mRNA在人卵巢组织囊状卵泡中的表达,初步探讨FS与PCOS的关系.方法应用组织原位杂交技术,检测FS mRNA在15例PCOS患者及10例非PCOS对照妇女卵巢组织囊状卵泡中的表达情况.结果PCOS患者卵巢囊状卵泡颗粒细胞中FS mRNA的表达呈阳性;卵泡膜细胞无信号表达.非PCOS妇女卵巢囊状卵泡的颗粒细胞和卵泡膜细胞中均无信号表达.结论与非PCOS妇女相比,FS mRNA在PCOS患者卵巢囊状卵泡颗粒细胞中的表达增强,提示FS mRNA的异常表达表达可能与PCOS发病相关.
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原发性肝癌和癌旁组织中TTVDNA的原位杂交研究
目的:通过对肝癌组织、癌旁组织和肝炎组织中TTVDNA的分布情况分析,探讨TTV感染与原发性肝癌的发病关系.方法:选择符合全国诊断标准并感染乙型肝炎病毒的原发性肝癌病人的肝癌组织及癌旁组织和乙型肝炎肝组织切片各为87、87和39份.以地高辛标记物制备TTVDNA探针,原位杂交法检测组织切片中TTVDNA.结果:肝癌组织中浆型阳性率明显高于癌旁组织(P<0.05),但两者核型阳性率差异无统计学意义(P>0.05);肝炎组织中浆型和核型阳性率与癌旁组织比较差异无统计学意义(P>0.05,).肝癌组织中浆型阳性率明显高于肝炎组织(P<0.01),相反,肝炎组织中核型阳性率明显高于肝癌组织(P<0.01);癌旁组织中浆型+核型阳性率与肝炎组织比较差异无统计学意义(P>0.05);肝癌组织和癌旁组织浆型+核型阳性率明显高于肝炎组织(P<0.01).结论:有3种可能:①TTV感染与原发性肝癌发生存在一定关系,TTV感染肝细胞后在肝炎期主要分布于肝细胞核内,当肝细胞发生癌变后,TTV主要分布向肝细胞浆内转移;②浆型TTV感染可能与乙型肝炎病毒协同而易发生癌变;③TTV亦仅仅是乙型肝炎病毒的伴随病毒.
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HBV DNA在血清HBV标志物阴性肝炎肝组织中的表达
1.资料与方法:肝穿刺活检组织45例均取自1995～1997年传染科住院患者,用ELISA法检测血清HBV标志物及常规PCR检测血清HBV DNA均为阴性.男39例,女6例,年龄12～56岁.临床诊断:急性黄疸性肝炎24例;慢性肝炎:轻度13例,中度3例,重度1例;肝硬化4例.肝组织原位杂交:带有HBV全基因组的重组PCR10质粒,经PCR扩增,获S基因500bp片段,经DNA回收试剂盒回收.以其作为裸探针,采用地高辛标记试剂盒制备探针.常规脱蜡入水,0.2盐酸室温消化20 min,蛋白酶K消化10 μ g/ml,37℃20 min,加入600ng/ml浓度的地高辛标记探针于42℃杂交过夜.用系列SSC洗涤,2%的羊血清封闭,加入1:500稀释的地高辛抗体碱性磷酸酶,37℃作用2 h,按操作说明加底物NBT/BCIP暗处显色3 h,镜下观察结果.
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一条新肺腺癌多药耐药相关基因cDNA片段在肺癌组织中表达的研究
目的检测所获得的一条新肺腺癌多药耐药相关基因cDNA片段在多种肺癌组织及其相应癌旁正常组织中的表达情况.方法 (1)用地高辛和32P分别将回收的目的基因片段标记为探针;(2)运用原位杂交技术和Northernblot方法分别确定这条cDNA片段在细胞中的定位及表达情况.结果 (1)组织原位杂交结果显示:在检测的12例肺腺癌标本中10例表达阳性,阳性率83.3%(51.6%～97.9%),癌旁正常组织中无表达,在其他检测的肺癌组织及其癌旁正常组织中无表达.(2)Northern blot检测结果显示:在检测的12例肺腺癌标本中8例表达阳性,阳性率66.67%(34.9%～90.1%),癌旁正常组织中无表达,在其他检测的肺癌组织及其癌旁正常组织中无表达.结论目的基因片段在部分肺腺癌组织中有表达,这可能与部分肺腺癌的化疗效果较差有关,值得作进一步的实验和临床研究.
关键词： 肺肿瘤 多药耐药基因 组织原位杂交 Northern blot 基因表达 -
人TSARG4真核表达载体的构建及稳定转染HeLa细胞系的建立
目的: 构建人TSARG4基因真核表达载体,转染HeLa细胞,建立稳定转染TSARG4的HeLa细胞系.方法: 应用 RT-PCR从人睾丸中扩增TSARG4的开放阅读框(ORF),并将 PCR产物插入到pUCm-T载体中测序验证.随后,将TSARG4进一步克隆到pcDNA3.1(+)真核表达载体中.用脂质体将经过测序、验证的pcDNA3.1(+)/TSARG4质粒转染HeLa细胞,通过G418筛选建立TSARG4稳定转染的HeLa细胞系.RT-PCR和组织原位杂交技术检测TSARG4在稳定转染的HeLa细胞系中的表达.结果: 成功构建了pcDNA3.1(+)/TSARG4表达质粒,建立了稳定转染的HeLa细胞系.RT-PCR和组织原位杂交检测结果表明,TSARG4基因在该细胞系中成功表达.结论: TSARG4真核表达载体成功构建和稳定转染HeLa细胞系的建立为进一步体外研究TSARG4的功能奠定了基础.
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微波脱钙在骨组织原位杂交中的应用
脱钙是制作骨组织切片的必需步骤,目前常用的酸性脱钙液效果不甚理想.笔者利用乙二胺四乙酸二钠(EDTA)作为脱钙液在微波作用下脱钙,并将脱好钙的骨组织用于原位杂交实验,取得较理想的效果.
