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内参照基因表达检测在宫颈石蜡组织原位杂交中的运用及意义
原位核酸杂交目前已广泛运用于组织和细胞基因表达定位和水平测定.但在实际运用中存在两个主要问题:(1)标本间的定量比较,缺乏比较的基准;(2)对于阴性结果,如何区别杂交失败的阴性结果和由于RNA的降解而出现的阴性结果.3-磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)和β-肌动蛋白为细胞的看家基因,其表达水平在不同活动中相对稳定,被广泛运用于基因表达水平检测的内参照基因[1-3],但尚未在原位杂交中作为内参照基因运用.我们通过制备GAPDH和β-肌动蛋白探针,对存档的正常和病理宫颈石蜡组织做了原位杂交检测,并与抑癌基因p53、癌基因c-myc的表达改变相比较,探讨其表达检测是否可作为组织和细胞原位杂交的阳性对照或基准.
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先兆子痫胎盘中细胞因子信号转导相关基因表达的变化
为探讨细胞因子与先兆子痫病理发生关键事件之间的关系,采用基因芯片检测技术观察了细胞因子信号转导相关基因在先兆子痫胎盘组织中的表达.胎盘组织取自我科住院病例,正常及先兆子痫患者(各3例)的年龄均限制在24~25周岁,2组患者的一般情况基本一致.基因芯片购自日本Takara生物技术公司,分别点样有约220种人类细胞因子相关基因和约220种人类环境激素相关基因,每枚芯片上还点样有包括β-actin、α2-tublin、GAPDH等在内的看家基因共计56点或48点作为内参照.
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3种富集胃癌患者外周血中胃癌细胞方法的比较
目的:建立一种富集胃癌患者外周血中癌细胞的有效方法.方法:先将不同浓度胃癌MGC-803细胞加入到健康人外周血中,再用淋巴细胞分离液收集单核细胞,然后等分成3份,并用3种方法处理-A方法,用CD45磁珠去除白细胞;B方法,用Ber-EP4磁珠富集癌细胞;C方法,先后使用上述2磁珠.后用定量RT-PCR检测看家基因β2微球蛋白(β2MG)mRNA的量.同法检测30例胃癌患者外周血.结果:β2MG mRNA扩增曲线的交叉点(crossing point,Cp)数值与癌细胞数间有良好的负相关(方法A,P<0.05,方法B或C,P<0.01).方法C检测到的Cp值为3种方法中大的;其灵敏度为1 mL血中含有1个癌细胞.用A、B和C方法检测30例胃癌患者外周血癌细胞的阳性率分别为70.00%,60.00%和36.57%(C与A比较,X2=5.79,P<0.05;C与B比较,x2=4.92,P<0.05).结论:在检测胃癌患者外周血癌细胞的实验中,联用阴性和阳性免疫磁珠可减少来自外周血白细胞的污染.
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中枢和外周神经损伤后胞体区看家基因表达的变化
目的:观察并比较几种常用的看家基因,包括β-actin,GAPDH,18s RNA,cyclophilin A等在中枢和外周神经损伤后胞体分布区神经组织中表达的变化.方法:Wistar雄性大鼠随机分为右侧坐骨神经夹伤,右侧坐骨神经结扎和胸段脊髓半横断三组.手术后7d,用相对定量RT-PCR的方法检测几种看家基因在受损神经元胞体分布区神经组织中的表达水平.结果:GAPDH和Cyclophilin A的表达在不同模型中的变化幅度较小,损伤与对照侧比较差异均无显著性.β-actin和18sRNA的表达在不同模型中变化不同,在脊髓损伤和坐骨神经结扎后表达的变化有统计学意义.结论:本研究结果为研究神经系统损伤后相关基因表达变化时内参照基因的选择提供参考,同时也为进一步认识看家基因更加广泛的功能提供依据.
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多位点序列分型技术及其研究进展
多位点序列分型(multilocus sequence typing, MLST)技术是一种基于核酸序列测定的基因分型方法,该方法选用多个看家基因(housekeeping gene)进行序列分析,通过序列的变化反映菌株之间的进化关系,具有较高的分辨率,可通过网络实现实验室间数据共享及比较,已广泛用于细菌基因分型研究.该文综述了MLST技术的原理、设计方法、结果分析及应用等方面的进展,并与其他分型方法进行了比较.
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一种快速检测CpG胞嘧啶甲基化的方法
脊椎动物基因5'端的CpG岛甲基化状态能够调控基因的转录,几乎所有的看家基因和近一半的组织特异性表达基因的表达受CpG岛甲基化调控.在正常生理条件下,大部分CpG岛处于非甲基化状态.DNA修复基因、肿瘤抑制基因都是看家基因,在肿瘤组织中其CpG岛常常处于异常甲基化状态,导致基因转录失活.肿瘤抑制基因的异常甲基化成为继基因结构变异之外的又一种重要基因失活方式.
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COX-2在肿瘤组织的表达及其化学预防靶点的意义
环氧合酶(Cyclooxygenase,COX)是催化前列腺素生物合成的限速酶,能将花生四稀酸(AA)转化为前列腺素G2和H2.COX有两种形式,即COX-1和COX-2,它们在氨基酸序列上有60%的同源性,具有相同的酶活性.然而,尽管它们催化相同的反应,但具有不同的生物学功能[1~3].COX-1是哺乳类动物的结构基因,被称为看家基因,它参与胃粘膜的保护作用,调节肾血流,控制血小板聚集.而COX-2mRNA及蛋白质在正常组织几乎检测不到,但可被炎症前和丝裂原包括细胞因子、内毒素、白细胞介素和佛波酯所诱导[4~8],近年来发现COX-2在不同的肿瘤组织有高表达.本文综述了COX-2在不同肿瘤组织表达及其作为肿瘤化学预防靶点的意义.
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泛耐药鲍氏不动杆菌看家基因和水平转移基因样本聚类分析
目的 了解20株泛耐药鲍氏不动杆菌的菌株亲缘性.方法 完成该组泛耐药鲍氏不动杆菌2种与耐药相关的看家基因和54种水平转移获得与β-内酰胺类、氨基糖苷类、喹诺酮类耐药相关基因以及13种接合性质粒、转座子、插入序列、整合子等可移动遗传元件遗传标记检测,并对检测结果作样本聚类分析.结果 20株泛耐药鲍氏不动杆菌已经发生演化,并存在2个克隆传播:1-4-6号菌株和2-5-7-8-9-10-11-12-13-14-15-16-17-18-19号菌株.结论 与耐药相关的看家基因和水平转移获得的耐药基因均为显性遗传,本研究耐药菌所观察的表型与之相对应,为追溯耐药菌传播途径提供了方便.
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幽门螺杆菌jhp基因与胃十二指肠疾病的关系
幽门螺杆菌(H.pylori)是一类基因组结构变异较大的细菌,除具有一般共同特征、看家基因、插入序列、致病岛和质粒外,还具有特殊的毒力基因.H.pylori基因组结构的不断阐明,为其临床和流行病学研究以及感染的预防和控制打下了坚实的基础.新发现的H.pylori致病因子,如jhp0917-0918、jhp0947和jhp0949基因均与胃十二指肠疾病相关,提示其可能成为H.pylori新的流行病学标志.
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常规TACE术联合RAD-p53动脉灌注治疗原发性肝癌的初步研究
肝细胞肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一,病程发展迅速,患者就诊时往往已属中晚期,绝大多数已失去手术机会[1-2].肝动脉插管化疗栓塞术(TACE)因其疗效确切、微创、简便,目前已成为治疗原发性肝癌的有效手段之一,尤其作为中晚期肝癌的首选治疗措施得到了广泛认可,但离彻底根治肿瘤还很遥远.研究表明抑癌基因p53是一种抑制肿瘤的基因,是细胞内关键的"看家基因",可影响多种基因的表达,调节细胞生长,防止细胞癌变.近年来,人们在探索用抑癌基因p53治疗恶性肿瘤.经我院伦理委员会讨论并同意,我科使用重组人p53腺病毒(RAD-p53)注射液动脉灌注联合TACE治疗中晚期肝癌,现对其安全性及近期疗效作初步分析.
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泛耐药鲍氏不动杆菌与耐药相关基因检测及亲缘性分析
目的:了解泛耐药鲍氏不动杆菌(PDR- ABA)的菌株亲缘性。方法对20株PDR- ABA进行3种耐药相关看家基因(carO、gyrA、parC)和54种水平转移获得的与β-内酰胺类、氨基糖苷类和喹诺酮类药物耐药相关基因以及12种接合性质粒、转座子、插入序列、整合子等可移动遗传元件的遗传标记检测。结果20株PDR- ABA中检出4种β-内酰胺类获得性耐药基因,5种氨基糖苷类获得性耐药基因,2种获得性抗菌制剂外排泵基因和5种可移动遗传元件。耐药相关看家基因carO、gyrA、parC均存在有义突变。结论 PDR- ABA存在5个克隆传播,其中1-3-4-5-9-15-16-18-20号菌株呈流行趋势。
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胃癌中还氧化酶和错配修复酶的研究
近年来,研究结果显示直肠癌、胃癌、肝癌、子宫内膜癌及卵巢癌等肿瘤组织中普遍存在错配修复酶hMLH1、hMSH2的缺乏,从而发生微卫星不稳定性(MSI),导致肿瘤的发生;同时对还氧化酶(COX)进行了大量的研究,COX-1被认为是"看家基因",合成生理性前列腺素,维持正常的生理功能,COX-2被认为是"快速反应基因",参与了肿瘤的发生、发展.我们应用免疫组织化学对胃癌组织中4者表达及其与临床病理特征的关系进行了研究.
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LASS1基因在鼠脑皮层中的表达研究
目的 探讨LASS1基因在大脑衰老中的作用.方法 分别从胎鼠、新生鼠、1月龄、3月龄、6月龄、11月龄、18月龄和24月龄鼠大脑皮层组织提取总RNA,RT-PCR扩增获得LASS1的cDNA片段并植入pGEM-T载体,以重组质粒载体为定量标准模板,采用Taqman荧光探针,一步法实时定量RT-PCR检测LASS1 mRNA表达,并以肌动蛋白基因(β-actin)和18S rRNA基因作为看家基因.结果 在胎鼠至青壮年鼠(1~3个月龄)发育过程中大鼠脑皮层LASS1表达水平呈上调趋势,之后随年龄增长逐渐下降;β-actin表达量在胎鼠及新生鼠明显高于成年鼠和老年鼠;18S rRNA基因表达相对稳定.结论 成功建立了大鼠LASS1基因表达的荧光实时定量RT-PCR检测方法;大鼠脑皮层中LASS1基因转录水平随年龄变化呈现相应的规律性,这将为进一步研究该基因在衰老过程中的作用提供实验室依据;同时,作为看家基因用于衰老研究,18SrRNA较β-actin基因更为可靠.
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小鼠哮喘模型颈静脉-结状神经节内参基因的筛选
目的 观察12个常用看家基因在正常小鼠和哮喘小鼠颈静脉-结状神经节的表达变化, 选择合适的内参基因为进一步基因表达分析研究得到可信数据提供依据.方法 雌性BALB/c小鼠随机分为哮喘模型组和对照组,制备哮喘模型,用实时荧光定量PCR技术,经geNorm及Normfinder程序分析,评价了12个常用看家基因CYC1、UBC、RPL13、YWHAZ、18srRNA、B2M、SDHA、ATP5B、CANX、ACTB、EIF4A2和GAPDH在小鼠颈-结状神经节的表达稳定性. 结果 12个候选看家基因在小鼠神经节的表达差异较大,其中GAPDH、18srRNA、CANX、ACTB和EIF4A2表达相对稳定,而CYC1、UBC和RPL13的表达在两组小鼠神经节变化幅度较大,结合两种分析证实GAPDH是其中稳定的内参基因. 结论 本研究结果提示GAPDH是研究哮喘小鼠和正常小鼠颈静脉-结状神经节基因表达的佳内参基因,同时也为进一步认识在不同实验模型确定适宜内参基因的重要性提供依据.
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葡萄球菌属不同靶基因序列种水平鉴定能力的比较评价研究
目的:比较评价靶基因16S rRNA、tufA、femA、rpoB和gap序列对葡萄球菌种水平的鉴定能力.方法:选择60株菌种鉴定明确的葡萄球菌(涵盖18个种),比较评价16S rRNA基因序列及VITEK 2全自动微生物生化鉴定系统对常见葡萄球菌鉴定的准确性;采用PCR方法特异扩增60株菌tufA、femA、rpoB和gap的基因序列,并对阳性扩增产物进行核酸测序,利用Mega 7.0和DNASP 5.0软件分析靶基因序列多样性,通过序列聚类关系分析,进一步评价不同靶基因序列对葡萄球菌种水平的分子鉴定能力.结果:16S rRNA基因序列比对不能有效区分山羊葡萄球菌和头状葡萄球菌,而VITEK方法则将巴氏葡萄球菌错误鉴定为沃氏葡萄球菌.序列多样性分析表明,尽管靶基因tufA、femA、rpoB和gap序列比16S rRNA基因序列多样性更强,但基于tufA、femA、rpoB和gap序列的聚类分析在种水平仍会错误鉴定部分葡萄球菌,如表皮葡萄球菌、头状葡萄球菌、腐生葡萄球菌和科氏葡萄球菌等.进一步评价16S rRNA基因序列分别与靶基因tufA、femA、rpoB和gap的串联序列对葡萄球菌种水平的鉴定能力,结果表明只有靶基因emA与16S rRNA基因的串联组合能够实现对18种葡萄球菌的准确鉴定,而其他靶基因与16S rRNA基因的串联组合对于葡萄球菌种水平的鉴定能力没有明显改善.结论:基于单个靶基因的序列分析会造成部分葡萄球菌种水平的错误鉴定,而基于16S rRNA与femA基因的串联序列分析则能够显著提高对葡萄球菌种水平鉴定的准确性.