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维拉帕米对c-jun调节睾丸间质细胞睾酮分泌的影响
目的通过c-jun反义寡脱氧核苷酸(ASODNs)观察c-jun在调节人绒毛膜促性腺激素(hCG)诱导的睾丸间质细胞(LC)睾酮(T)分泌的作用. 方法采用c-jun ASODNs拮抗c-jun,维拉帕米阻断钙通道,hCG诱导体外培养大鼠LC的T分泌,放射免疫方法检测T水平. 结果c-jun ASODNs(0～2 μmol/L)呈剂量依赖性抑制hCG诱导的离体LC的T分泌(P＜0.01).维拉帕米(10-5mol/L)可加强c-jun ASODNs抑制T分泌. 结论c-jun促进hCG诱导大鼠LC的T分泌,c-jun表达可能与钙离子相关.
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乙酰肝素酶反义硫代寡脱氧核苷酸对人肝癌细胞系侵袭力的抑制作用
目的探讨乙酰肝素酶反义硫代寡脱氧核苷酸对人肝癌细胞系侵袭力的抑制作用.方法设计合成互补于HPA mRNA起始密码区的硫代反义寡脱氧核苷酸AS-ODN及相应的无义对照寡脱氧核苷酸NS-ODN,以阳离子脂质体OligofectamineTM Reagent包埋后转染SMMC-7721、BEL-7402细胞.采用RT-PCR和Western-blot检测转染前后细胞HPA mRNA及蛋白表达的变化,以基底膜重建实验检测SMMC-7721、BEL-7402细胞侵袭力的变化.结果与正常对照组相比,AS-ODN转染组SMMC-7721、BEL-7402细胞HPA mRNA和蛋白的表达均显著下降(P＜0.01,P＜0.05),转染后两细胞系的侵袭力抑制率分别为55.8%和61.8%.结论HPA硫代反义寡脱氧核苷酸可通过下调HPA mRNA和蛋白的表达抑制肝癌的侵袭力.
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bFGF和VEGF在急性白血病中的表达及对HL-60细胞生长的影响
为了研究急性白血病患者血清及细胞株培养上清中碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)的表达水平,并初步探讨白血病患者VEGF水平的评价方法以及VEGF特异性反义寡脱氧核苷酸(ASODN)的抗血管生成作用,用夹心ELISA法测定患者血清、细胞株(HL-60、U937、NB4、JM和K562)培养上清中bFGF和VEGF浓度,比较其差异,将VEGF血清浓度测定值(pg/ml)、血清浓度测定值经外周血血小板计数标化后标化值VEGF/PLT(pg/106)分别作为比较指示;HL-60细胞经不同浓度VEGF ASODN作用后,利用噻唑蓝、ELISA法分别测定靶细胞的生长状态及其VEGF分泌水平.结果发现:①急性白血病患者血清bFGF阳性率(37.5%)高于健康对照者(10%)(P＜0.01),在5株白血病细胞株中,NB4、U937和K562细胞上清中检测到了bFGF表达;②急性白血病患者及健康者血清VEGF测定值差异无统计学差异,但二者标化值测相差显著(P＜0.05);除U937外,其余4株细胞株培养上清中均有VEGF表达;③HL-60细胞经0.5,1及5 μmol/L VEGF ASODN作用24小时后,其存活率与对照组相比明显降低(P＜0.05);经1,5,20μmol/L VEGFASODN作用24小时后,HL-60细胞培养上清中VEGF浓度均明显低于对照(P＜0.05).结论:在急性白血病患者血管生成调控中bFGF、VEGF均有作用,但以VEGF为主;采用不同计算方法评价患者血清BEGF水平可能得出不同的结论,本研究所用方法较为实际地反应出患者血清中受白血病影响而升高的VEGF量;VEGF ASODN可以抑制急性白血病细胞生长,从而发挥抗血管生成作用.
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黏着斑激酶反义寡核苷酸抑制人胃癌在裸鼠体内生长
黏着斑激酶(FAK)是一种相对分子质量为125 000的非受体型蛋白酪氨酸激酶,具有独特的结构功能特征,在细胞内信号转导中起关键性的作用[1],有胞内第一信号之称. 我们以FAK 基因为靶点,设计其两条反义寡脱氧核苷酸,通过直接注射瘤体的方法,观察其在动物实验中的抑瘤效果.
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反义寡脱氧核苷酸技术治疗慢性疼痛研究进展
慢性痛的机理极其复杂,现有的治疗手段如药物疗法、神经阻滞治疗、小针刀疗法、理疗和针灸等方法的长期疗效都较差,且可能引起一定的副作用,限制了其临床应用效果.
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肿瘤坏死因子α反义寡核甙酸对大鼠肝脏缺血再灌注损伤的保护作用
目的:探讨肿瘤坏死因子α(TNFα)反义寡核苷酸(ASODN)对大鼠肝脏缺血再灌注损伤的保护作用.方法:雄性SD大鼠160只,分为正常对照组、缺血再灌注组、TNFα错配ODN组和TNFα反义ODN组,观察了肝脏缺血60分钟及再灌注1、3、6及12小时后,检测血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、丙二醛(MDA)及肝组织病理学变化.结果:缺血再灌注组和TNFα错配ODN组肝脏缺血再灌注后,肝脏瘀血明显,血浆ALT和MDA含理均显著增高;肝脏缺血再灌注用TNFα反义ODN处理后,血浆ALT和MDA含量明显降低,肝组织瘀血减轻.结论:TNFα反义ODN可以抑制大鼠肝脏缺血再灌注所致的炎症反应,对大鼠肝脏缺血再灌注损伤有保护作用.
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反义寡脱氧核苷酸对人阴茎海绵体平滑肌细胞PDE5的抑制作用
目的观察反义寡脱氧核苷酸对人阴茎海绵体平滑肌细胞5型磷酸二酯酶(PDE5)的抑制作用,为阴茎勃起功能障碍的基因治疗提供理论和实验依据. 方法将PDE5基因反义寡脱氧核苷酸与DOTAP转染人阴茎海绵体平滑肌原代细胞,Western印迹法检测转染后不同时间(1～48 h)海绵体平滑肌细胞内PDE5的浓度变化,观察反义寡脱氧核苷酸对平滑肌细胞内PDE5 的作用. 结果转染后1～6 h, 反义组人阴茎海绵体平滑肌原代细胞内PDE5表达量较对照组显著降低(P=0.000～0.014);转染后12～48 h,三组细胞内PDE5的表达比较,差别无显著性意义(P=0.189～0.962). 结论 PDE5基因反义寡脱氧核苷酸对人阴茎海绵体平滑肌细胞PDE5有抑制作用.
关键词： 反义寡脱氧核苷酸 5型磷酸二酯酶 阴茎 -
反义ICAM-1寡脱氧核苷酸抑制大鼠腹主动脉瘤形成的实验研究
我们建立大鼠腹主动脉瘤(AAA)模型,通过局部缓释反义寡脱氧核苷酸的方法封闭胞间粘附分子(ICAM)-1基因表达,观察动脉瘤形成过程的改变,以进一步研究AAA的发病机制及防治措施.
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针对于K-ras基因点突变的反义寡脱氧核苷酸对人胰腺癌细胞株PC-2作用的研究
目的探讨针对于胰腺癌K-ras基因点突变的反义寡脱氧核苷酸对人胰腺癌细胞株PC-2的作用.方法用脂质体将针对于K-ras基因点突变的反义寡脱氧核苷酸转染体外培养的人胰腺癌细胞株PC-2(反义组),转染正义寡脱氧核苷酸(正义组)和生理盐水(对照组),免疫组化和原位杂交检测靶基因表达,人工计数、噻唑蓝(MTT)和集落形成实验检测细胞增殖情况.结果转染48 h后,反义组ras蛋白和K-ras基因mRNA的表达强度较正义组和对照组均明显降低(P<0.05).人工计数、MTT检测和集落实验均证实反义组细胞增殖受到明显抑制(P<0.05).结论针对于K-ras基因点突变的反义寡脱氧核苷酸转染体外培养的胰腺癌细胞,对靶基因表达和细胞增殖有明显的抑制作用.
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hTR反义PS-ODN联合顺铂对人胃癌裸鼠皮下移植瘤作用的体内研究
目的 探讨hTR反义寡脱氧核苷酸(ASODN)联合顺铂对人胃癌裸鼠皮下移植瘤的治疗作用.方法30只裸鼠建立胃癌皮下移植瘤模型后,随机分成5组,予以不同条件处理,对照组(瘤周注射RPMI1640培养液)、ASODN组(瘤周注射反义寡脱氧核苷酸)、RODN组(瘤周注射随机寡脱氧核苷酸)、DDP组(瘤周注射化疗药物顺铂)、ASODN+DDP组(瘤周注射反义寡脱氧核苷酸和顺铂).治疗后定期观察肿瘤体积,计算肿瘤抑制率.采用TRAP PCR-ELISA法检测移植瘤的端粒酶活性.结果ASODN+DDP组、ASODN组、DDP组和RODN组的高肿瘤抑制率分别为94.2%、843%,92.8%和26.9%.在端粒酶活性检测中,4个治疗组间均有统计学意义.结论hTR反义PS-ODN对人胃癌裸鼠皮下移植瘤生长及端粒酶活性有一定抑制作用,且可增强DDP的上述作用.
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高效液相色谱法测定C-sis硫代磷酸反义寡脱氧核苷酸血清浓度
目的:建立C-sis硫代磷酸反义寡脱氧核苷酸(C-sis PS-AODN)血清浓度测定的HPLC法.方法:采用醋酸缓冲液-乙腈-水(3:9:88)流动相,氰基色谱柱,采用乙腈沉淀的样品处理方法.结果:C-sis PS-AODN在19.6～314.0μg@mL-1血清浓度范围内线性良好,r=0.9998,回收率为(97.9±3.3)%,日内和日间变异系数均在1.4%～8.2%范围内.结论:本方法适用于C-sis PS-AODN体内、外血清浓度分析和药代动力学研究.
关键词： 反义寡脱氧核苷酸 硫代磷酸反义寡脱氧核苷酸 高效液相色谱法 -
不同质量浓度磁性c-erbB-2反义探针对SK-Br-3肿瘤细胞株形态及表达的影响
目的 探讨不同质量浓度磁性c-erbB-2反义探针转染乳腺癌SK-Br-3细胞株后,对其形态及表达的影响.方法将反义探针含铁质量浓度分别定为5、10、25、50、100 mg/L,转染乳腺癌SK-Br-3细胞24 h.采用普鲁士蓝染色并在光学显微镜及透射电镜下直接观察细胞铁颗粒,原子吸收光谱法测定细胞内铁含量,台盼蓝排除实验、CCK-8试剂盒观察细胞活性,Western blot法检测蛋白质表达,磁共振成像研究信号强度的变化.结果 SK-Br-3细胞对反义探针在一定质量浓度范围内(5、10、25 mg/L)呈依赖式摄取.当探针质量浓度为25 mg/L时,细胞内铁含量为(18.38±0.28) pg,细胞活力、存活率及细胞内c-erbB-2蛋白表达量明显降低(P均＜0.05),磁共振扫描图像显示该组细胞T2值出现明显降低(P＜0.05).50及100 mg/L组各项结果与25 mg/L组比较差异无统计学意义(P均＞0.05).结论 当磁性c-erbB-2反义探针质量浓度为25 mg/L时,可有效转染并特异性抑制SK-Br-3细胞株的表达,并被磁共振成像所检测.
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超顺磁性氧化铁标记反义寡脱氧核苷酸探针在转染细胞磁共振成像中的应用
目的 制备超顺磁性氧化铁(SPIO)标记的反义寡脱氧核苷酸(ASODN)探针,探讨其应用于转染细胞磁共振(MR)成像的可行性.方法 采用化学交联法将SPIO标记于c-erbB2癌基因的ASODN制成ASODN探针,原子力显微镜检测探针形态,高效液相凝胶色谱法检测联接率和生物活性,聚丙烯酰胺凝胶电泳法检测稳定性.将ASODN探针转染高表达c-erbB2癌基因的SK-Br3肿瘤细胞株,普鲁士蓝染色后于光学显微镜下观察细胞内铁分布,原子吸收光谱法测定细胞内铁含量,MR扫描观察细胞信号强度变化情况.结果 制备的ASODN探针近似球形,粒径在25～40 nm间,分散均匀,联接率为100%,仍保持原有生物活性,稳定性好.转染ASODN探针后的SK-Br3细胞胞浆内可见多少不等的蓝色铁颗粒,细胞内铁含量明显高于未转染ASODN探针的其他各组细胞(P均＜0.01);MR扫描显示其信号强 度弱,信噪比值明显低于其他各组细胞(P均＜0.05).结论 成功制备SPIO标记ASODN探针,该探针能有效进入SK-Br3细胞内,明显降低MR扫描下的转染细胞信号强度.
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乙酰肝素酶反义寡核苷酸对人乳腺癌细胞株MDA435侵袭力的抑制作用
目的探讨乙酰肝素酶(HPSE)反义寡脱氧核苷酸对人乳腺癌细胞株MDA435侵袭力的抑制作用.方法设计合成互补于HPSE mRNA起始密码区的硫代反义寡脱氧核苷酸AS-ODN及相应的无义对照寡脱氧核苷酸NS-ODN,以阳离子脂质体Lipofectin包埋后转染MDA435细胞,以逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测转染后HPSE mRNA表达的变化,以Western印迹检测HPSE蛋白表达的变化,以定量Matrigel侵袭实验检测MDA435细胞侵袭力的变化.结果与正常对照组、脂质体对照组和NS-ODN相应浓度组相比,AS-ODN各浓度组对HPSE mRNA和蛋白的表达及细胞侵袭力均有明显抑制作用(P＜0.01),其抑制效应在不同浓度组间差别显著(P＜0.01).AS-ODN在终浓度为0.1 μmol/L、0.2 μmol/L和0.4 μmol/L时对MDA435细胞的侵袭力抑制率分别为34.0%、57.8%和79.7%.结论 HPSE反义寡脱氧核苷酸通过下调HPSE mRNA和蛋白的表达可显著抑制人乳腺癌细胞株MDA435的侵袭力,并呈剂量依赖性.
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99mTc标记c-erbB2反义寡脱氧核苷酸对乳腺癌显像的实验研究
用放射性核素标记癌基因反义寡脱氧核苷酸(antisense oligodeoxynucleotides,ASODN)对肿瘤进行显像,可以探测只有癌基因激活、扩增和过度表达还没有形成实体的肿瘤组织,以实现对肿瘤的早期诊断[1,2].乳腺癌是妇女发病率和死亡率高的主要恶性肿瘤[3],如果能在肿瘤早期鉴别其癌基因的表达类型及临床分期,施行"量体裁衣"式的治疗,可提高乳腺癌治疗的效果.c-erbB2是乳腺癌原癌基因,与乳腺癌的恶性转化和不良预后密切相关[4].本课题以c-erbB2为靶基因,设计一段15 mer与目的基因mRNA互补的反义寡脱氧核苷酸,用放射性核素锝(99mTc)标记,与表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)联接,得到反义探针.探针获得受体/配体特异结合的导入特性,通过肿瘤细胞膜上表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)的介导进入细胞,增加寡核苷酸的细胞摄取率.本文拟对反义探针在荷瘤小鼠体内的组织分布,以及对癌基因过度表达肿瘤组织的显像进行研究.
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c-myb对小鼠体外受精的影响及作用机制的分析
目的: 本文采用免疫组织化学方法观察Myb转录因子家族成员c-myb蛋白在小鼠精子和卵母细胞-卵丘复合物中的分布.方法: 建立小鼠体外受精模型,用不同浓度反义c-myb寡脱氧核苷酸(c-myb ASODNs)与精子、卵母-卵丘细胞复合物共孵育观察其对小鼠体外受精率的影响,并进一步探讨c-myb ASODNs对小鼠体外受精率的影响机制.结果: 在颗粒细胞胞核和精子的头部有c-myb蛋白分布.c-myb ASODNs呈剂量依赖性抑制小鼠体外受精率(小鼠体外受精率在空白组、低、中、高浓度c-myb ASODNs组、无义tat ODNs组分别为34.97%、30.89%、20.14%、16.68%、34.47% ).GABA、P4、Verapamil和dbcAMP与c-myb ASODNs共同作用时,GABA、P4、dbcAMP三者均逆转c-myb ASODNs对受精的抑制作用,(小鼠体外受精率在空白组、中浓度c-myb ASODNs组、GABA、P4、Verapamil和dbcAMP组、分别为34.81%、22.96%、40.83%、39.12%、7.463% 、40.61%),GABA、P4、和dbcAMP三者对精子中的c-myb蛋白免疫组化染色阳性的细胞百分率无明显影响.Verapamil能抑制小鼠体外受精,并协同c-myb ASODNs的抑制作用,且使精子中的c-myb蛋白免疫组化染色阳性的细胞百分率明显下降.结论: c-myb ASODNs与受精密切相关, Verapamila可能通过调节精子中的c-myb表达,从而抑制小鼠体外受精,而GABA、P4和dbcAMP可能不是通过c-myb来影响受精过程.
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c-erbB2与小鼠体外受精及作用机理研究
目的和方法:用免疫组织化学的方法观察ErbB2在小鼠睾丸、附睾、卵巢、输卵管、卵母细胞-卵丘细胞复合物及精子细胞上的分布.用不同浓度反义c-erbB2寡脱氧核苷酸(c-erbB2 ASODNs)与精子和卵母细胞-卵丘细胞复合物共孵育,观察其对小鼠体外受精率的影响,并进一步探讨其机制.结果:在附睾的小管上皮细胞的管腔面,卵丘细胞和精子的细胞膜上有ErbB2蛋白分布.c-erbB2 ASODNs呈剂量依赖方式抑制小鼠体外受精率.小鼠体外受精率在空白对照组、低、中、高浓度c-erbB2 ASODNs组、无义tat ODNs组分别为38.3%、19.6%、10.7%、5.0%、33.8% ,同时伴有精子细胞上ErbB2免疫组化染色明显下降,中、高c-erbB2 ASODNs浓度组卵丘细胞贴壁生长受抑制.GABA和dbcAMP均能增加精子小鼠体外受精率,两者均部分逆转 c-erbB2 ASODNs对受精的抑制作用,但对精子细胞上ErbB2免疫组化染色均无明显影响,而Verapamil能抑制小鼠体外受精率,并协同c-erbB2 ASODNs的抑制作用,且使精子细胞膜上ErbB2免疫组化染色明显下降.结论:c-erbB2 ASODNs与受精密切相关,阻断Ca2+内流后能通过抑制精子的c-erbB2表达,从而抑制小鼠体外受精,而GABA、dbcAMP可能不是通过c-erbB2来影响受精过程.
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c-fos、c-myb和c-erbB-2与大鼠卵巢颗粒细胞生孕酮调控关系的研究
目的和方法:用离体细胞体外孵育法,观察反义c-fos、c-myb和c-erbB-2 寡脱氧核苷酸(c-fos ODN、c-myb ODN和c-erbB-2 ODN)对hCG诱导大鼠颗粒细胞孕酮产生的影响,同时观察内皮素-1、γ-氨基丁酸和钙离子通道阻断剂维拉帕米对颗粒细胞中c -fos、c-myb和c-erbB-2蛋白的影响.结果:反义c-fos、c-myb和c-erbB -2 ODN均明显抑制hCG诱导颗粒细胞孕酮的产生,并伴有各自癌基因蛋白染色阳性的颗粒细胞百分率下降;而无义tat ODN没有相应的作用.2×10-7mol/L内皮素-1和5×10 -6mol/L γ-氨基丁酸能显著抑制hCG诱导颗粒细胞孕酮的产生,同时使c-fos、c-my b和c-erbB-2蛋白染色阳性的颗粒细胞百分率下降;而1×10-6mol/L维拉帕米对hCG 诱导颗粒细胞孕酮的产生和c-fos、c-myb和c-erbB-2蛋白染色阳性的颗粒细胞百分率均无明显影响.结论:c-fos、c-myb和c-erbB-2与hCG诱导颗粒细胞孕酮的产生密切相关;内皮素-1、γ-氢基丁酸能通过调节这些癌基因在颗粒细胞中的表达而影响hCG诱导颗粒细胞孕酮的产生;而Ca2+无相应的作用.
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超声造影剂联合超声介导耐药基因反义寡脱氧核苷酸转染裸鼠肝癌细胞逆转多药耐药效应的研究
肝癌是常见的恶性肿瘤之一,严重危害人类的健康.研究肝癌多药耐药(multi-drug resistance,MDR)是肝癌临床治疗迫切需要解决的问题,肝癌MDR与耐药基因mdr-1、mrp和相应表达蛋白P-gp、MRP(P190)密切相关[1].本研究以mdr1、mrp-反义寡脱氧核苷酸(antisense oligodeoxynucleotide,ASODN)+超声造影剂+超声转染裸鼠QGY/CDDP肝癌移植瘤,以期实现在体对瘤细胞MDR的逆转并探讨其效应和作用机制.
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聚酰胺—胺型树枝状高聚物纳米载体介导的组织因子反义寡脱氧核苷酸防治心肌缺血再灌注损伤机制的初步研究
目的 研究聚酰胺-胺型树枝状高聚物(PAMAM-D)纳米载体介导组织因子(TF)反义寡脱氧核苷酸防治大鼠心肌缺血再灌注损伤的分子机制.方法 分别设计合成针对大鼠TF的反义寡脱氧核苷酸(AS/TF)、正义寡脱氧核苷酸(S/TF)和错配寡脱氧核苷酸(Sc/TF),分别耦联于PAMAM-D纳米载体,构建ODN-PAMAM-D的聚合物.将100只雄性Lewis大鼠随机等分为假手术组、缺血再灌注组、AS/TF防治组、S/TF对照组和Sc/TF对照组.除假手术组和缺血再灌注组大鼠静脉分别注入生理盐水和PAMAM-D外,其余3组大鼠分别注入与PAMAM-D相耦联的相应寡核苷酸.各组大鼠于注射后10 h开胸暴露心脏,除假手术组以外的其他4组大鼠于冠状动脉左前降支中1/2处结扎造成心肌缺血.心肌缺血90 min后,解除结扎,再灌注3 h.假手术组的大鼠于冠状动脉左前降支中1/2处只穿线,不结扎,持续4 h 30 min.分别于缺血90 min和再灌注结束后取各组大鼠的血液检测肌钙蛋白T(TnT)和乳酸脱氢酶(LDH)的含量.并于实验结束后取梗死区及边缘区心肌组织检测TF基因的转录、TF的促凝活性(TF∶C)和TF的抗原含量(TF∶Ag)以及活性氧簇(ROS)、蛋白酶激活受体-1(PAR-1)和p38 有丝分裂原激活蛋白激酶(p38 MAPK)的表达.结果 心肌缺血90 min及再灌注3 h后,缺血再灌注组大鼠血液中的TnT和LDH含量均显著高于假手术组,而AS/TF防治组均明显低于其他3个缺血再灌注组(P<0.05);梗死区及边缘区心肌组织中TF基因的转录和表达均强于假手术组,AS/TF防治组则较其他3个缺血再灌注组明显减弱(P<0.01).流式细胞学检测显示,心肌缺血再灌注3 h后,各缺血再灌注组大鼠心肌组织中ROS、PAR-1和p38 MAPK的表达均显著增多,AS/TF防治组则明显低于缺血再灌注组、S/TF对照组和Sc/TF对照组(P<0.05).结论 TF不仅介导了凝血过程,而且通过激活PAR-1和p38 MAPK诱发了炎性反应,从而加重了心肌组织损伤.TF是心肌缺血再灌注损伤的"中心分子",针对TF的反义寡脱氧核苷酸耦联G10代PAMAM-D纳米载体不仅抑制了TF的转录和表达,而且减轻了心肌缺血再灌注损伤.
