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1-16 酪醇对肝癌细胞NQ01的诱导及细胞增殖的抑制
目的研究酪醇使肝癌细胞Ⅱ相解毒酶NAD(P)H:醌氧化还原酶-1(NQ01)诱导表达和细胞增殖的抑制以及两者之间的关系.方法肝癌细胞SMMC-7721接种后24 h经β-酪醇处理24 h,分别测定酶活性、mRNA表达和细胞增殖情况.NQ01酶活性采用微孔板直接测定法,诱导结果用NQ01比活性(specific activity)=A(NQ01酶活性)/B(细胞数);mRNA水平的变化采用定量RT-PCR;细胞增殖采用结晶紫显色法.结果 NQ01酶活诱导上,酪醇大于60μg/ml时有明显的剂量-效应关系,且每一浓度点(60、70、80、μg/ml)与空白组比较,差异均有显著性(P<0.05),80μg/ml的酪醇与80μnol/L的β-NF(阳性对照)诱导的酶比活性相当;mRNA表达量存在剂量依赖性增加(r=0.824,P<0.05),且与酶比活存在明显的相关性(r=0.951,P<0.01);酪醇在70~100μg/ml范围内,其抑制细胞增殖的能力随着浓度的增加而增加.另外,细胞增殖与酶比活存在负相关(r=-0.410,P<0.01).结论酪醇在培养肝癌细胞SMMC-7721上能使NQ01在酶活性与mRNA表达量诱导性增加,同时酪醇能抑制细胞的增殖,这种增殖抑制与酶活性诱导增加有关.
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低锌浓度培养基对Caco2细胞二价金属离子转运体mRNA表达的影响
锌是人体必需的微量营养素之一,锌缺乏或过量与多种机能紊乱相关.二价金属离子转运体(divalent metal transporter 1,DMT1)是近期发现的哺乳动物金属离子转运体,在机体所有组织几乎均有表达,具有对铁、锌等多种二价金属离子的转运功能[1].我们既往的实验结果显示膳食高锌可以导致断乳小鼠睾丸DMT1 mRNA表达显著降低,约为适锌时表达量的1/3~1/4,提示可能为哺乳期后幼鼠维持锌内稳态的一种反馈保护机制,但是脑组织中的DMT1 mRNA表达未见变化,提示在脑组织锌转运中DMT1可能不作为主要的转运体[2].小肠是锌吸收的重要场所,DMT1是否参与小肠锌吸收过程?我们以不同锌浓度培养的Caco2细胞为模型,观察其对DMT1 mRNA表达的影响及其规律,探讨DMT1在小肠锌吸收中的可能作用.
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基于癌基因组图谱挖掘胃癌预后相关基因
目的 利用癌基因组图谱数据库中的大量胃癌基因组数据,在高频突变或肿瘤组织高表达的基因中挖掘与临床分化和预后相关的基因.方法 从癌基因组图谱数据集中下载胃癌基因组的突变数据,基因表达数据以及病例样本的临床信息资料.筛选并统计出现有害突变频率较高的基因,并比较这些基因在不同分化程度病例中的突变次数.同时利用DESeq2对基因表达数据进行差异表达分析,对于在肿瘤组织中高表达的基因做生存分析,使用Log-rank检验并做FDR校正,筛选出mRNA表达量与胃癌预后相关联的基因.结果 突变分析得到PIK3CA和APC的有害突变频率在不同分化程度的胃癌存在差异(Fisher's exact test:P<0.05).差异表达分析得到2 040个在肿瘤组织中上调的基因,2 357个在肿瘤组织中下调的基因.生存分析得到8个对胃癌预后有影响的基因,1个为保护因素,7个危险因素.结论 本研究通过挖掘癌基因组图谱中的胃癌数据集,得到了ANGPT2、MMP10和WISP3等与胃癌分化及预后相关的基因,为接下来的研究提供了线索和依据,也为临床治疗提示了新的预后指标.
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氮乙酰半胱氨酸增强IL-1β诱导NOS的作用
氮乙酰半胱氨酸(NAC)作为一种巯基抗 氧化物,可增加细胞内GSH的合成量, 能增强IL-1β诱生型一氧化氮合酶(iNOS)在小鼠血管平滑肌细胞中的表达。那么,其它抗 氧化剂是否具有此功能呢?是否NAC增强IL-1β诱生NOS是通过激活丝裂原激活蛋白激 酶(MAPK)而实现的呢? 新近的研究表明,NAC对IL-1β诱生亚硝酸盐的产量和i NOS的表达量 都有增强作用,这一点与其它抗氧化剂(L-半胱氨酸,D-半胱氨酸,不含巯基的L-抗坏血 酸等)类似。IL-1β可以激活P44/42 MAPK,而NAC可以促进激活。无论是否存在NAC,选 择性抑制剂PD98059对P44/42 MAPK磷酸化的抑制都可以显著降低iNOS的表达。联系以往的 实验结果,可以推断:P44/42 MAPK的激活是IL-1β诱生NOS过程中所必需的。NAC 促进激 活,不仅是由于使细胞内GSH合成增加,而且很可能作为一种还原剂,通过一个氧化还原 过程,加强细胞因子(IL-1β)对P44/42 NAPK信号通路的激活,来辅助iNOS的表达。
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重组单克隆抗体的纯化研究
重组单克隆抗体是新一代生物工程技术产品,其通过特定的靶点发挥药效[1]。随着大规模哺乳动物细胞培养技术的发展,工业化细胞培养液体积可达1万升以上,抗体表达量可达5 g/L以上,极大地加重了重组单抗下游纯化的压力[2-3],下游纯化成为限制重组单抗工业化扩大的主要因素[4-6]。重组单抗杂质控制浓度指标见表1,这些指标必须通过离心、过滤和色谱层析纯化后控制在一定浓度以下[7-10]。重组抗体的纯化一般可以分为细胞培养液澄清、抗体捕获、抗体精制纯化、病毒灭活和纯化工艺的放大等流程。
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甲醛固定及石蜡包埋组织的蛋白质组学研究进展
人体内多数疾病都有其独特的生物学特征,如某些蛋白质表达量的改变,新的肿瘤特异性蛋白质的出现等.近年来蛋白质组学及其相关技术为发现新的疾病特异性生物标志物以及探讨疾病发生发展机制,提供了高效便捷的工具~([1]).
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乙型肝炎病毒S基因变异对人白细胞抗原表达的影响
人类白细胞抗原(human leukocyte antigen,HLA),可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ类分子.HLAⅠ在正常肝细胞表达很弱或全无表达,HBV感染肝细胞时,表达量与炎症程度呈正相关.我们将所构建的野生型和变异型乙肝表面抗原中蛋白基因重组质粒转染HepG2细胞,以研究HBV/S基因变异株对宿主细胞HLA表达的影响,从而对变异株造成的肝脏炎症程度作出初步的推论.
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系统性红斑狼疮患者外周血单个核细胞IL-17表达的初步观察
目前IL-17的研究已发现,其在一些自身免疫性疾病如移植肾排斥反应、类风湿性关节炎、多发性硬化、支气管哮喘等存在表达、分泌的异常,但在系统性红斑狼疮(SLE)患者中,其表达、分泌是否存在异常,目前国内、外尚未见研究报告〔1〕。本研究通过测定SLE患者血清、无刺激或加不同刺激培养外周血单个核细胞(PBMC)上清液IL-17蛋白水平和其PBMC内IL-17 mRNA水平的表达量,以了解SLE患者PBMC表达、分泌IL-17有无异常及其与SLE疾病活动性的关系。
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GHRP-6对心衰模型大鼠心肌细胞 PI3 K/Akt/Caspase-9信号通路调节作用
目的::观察GHRP-6对心力衰竭模型大鼠心脏功能的调节作用和其对PI3 K/Akt/ Caspase-9信号转导通路的影响。方法:建立GHRP-6对心力衰竭模型大鼠心肌细胞的保护模型,比较PI3 K p110α、Akt p-Thr308和Akt p-Ser473在正常对照组、假手术组和模型组大鼠心肌细胞左心室后壁和室间隔心肌细胞内的表达。流式细胞术( FCM)检测模型组与正常对照组和假手术组大鼠心肌细胞的凋亡率。结果:在大鼠心肌细胞左心室后壁和室间隔心肌细胞内,模型组大鼠心肌细胞的PI3 K p110α、Akt p-Thr308和Akt p-Ser473阳性表达量较正常对照组和假手术组显著降低( P<0.05);与正常对照组、假手术组和模型组大鼠心肌细胞的分别比较,GHRP-6治疗组大鼠心肌细胞的阳性表达量显著升高(P<0.05)。模型组大鼠心肌细胞的Caspase-9和Caspase-3阳性表达量较正常对照组和假手术组显著增高( P<0.05);与正常对照组、假手术组和模型组分别比较,GHRP-6治疗组阳性表达量显著降低(P<0.05)。 FCM结果显示,模型组大鼠心肌细胞与正常对照组和假手术组比较,凋亡率显著升高( P<0.05);GHRP-6治疗组与模型组比较,凋亡率明显降低( P<0.05)。相关程度分析显示, PI3 K p110α与Akt p-Thr308、p-Ser473蛋白阳性表达量均呈中度正相关;Akt p-Thr308、p-Ser473与Caspase-9蛋白阳性表达量均呈中度负相关;Caspase-9与Caspase-3蛋白阳性表达量呈高度正相关。结论:GHRP-6通过调控PI3 K/Akt/Caspase-9/Caspase-3信号转导通路,抑制心力衰竭模型大鼠心肌细胞凋亡,是其实现心肌细胞保护作用机制之一。
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基质金属蛋白酶-2,-9及铁蛋白对鉴别良恶性腹水的意义
目的:检测良恶性腹水中MMP-2,MMP-9及SF的含量,为鉴别良恶性腹水提供科学依据.方法:收集腹水患者37例,其中肝硬化腹水12例,结核性腹膜炎腹水13例,消化系恶性肿瘤腹水12例.采用ELISA法分别检测腹水中MMP-2,MMP-9及SF的含量.结果:消化系恶性肿瘤组中MMP-2,SF含量依次为(161.85±85.88)μg/L,(458.47±47.05)μg/L,明显高于肝硬化组[(93.00±31.69)μg/L,(188.80±148.35)μg/L]和结核性腹膜炎.组[(107.11±38.70)μg/L,(218.16±30.88)μg/L],(P<0.05,P<0.001).MMP-9在肝硬化腹水、消化系恶性肿瘤腹水、结核性腹膜炎腹水中依次升高,分别为(9.02±2.18)μg/L、(18.36±8.26)μg/L、(48.90±16.37)μg/L.结论:MMP-2,SF在恶性腹水中的表达量明显高于良性腹水组,MMP-9在结核性腹膜炎腹水中明显升高.因此MMP-2,MMP-9及SF可作为良恶性腹水的鉴别指标.
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干扰素α/β受体慢性乙型肝炎肝组织的免疫组化定位
目的:IFNα/βR在慢性乙型肝炎患者肝脏组织内的免疫组化定位及其对干扰素应答的预测作用.方法:应用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶连接法,对40例慢性乙型肝炎患者肝脏组织内IFNα/βR的分布特点进行了观察.结果:IFNα/βR在慢性乙型肝炎患者肝脏组织肝细胞膜和胞质内均有不同程度的表达,其中2例患者血管内也有分布.结论:慢性乙型肝炎患者肝肝组织内非溶性的IFNα/βR的表达量可能系IFNα干扰素应答率更为有效的预测指标.
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肝细胞生成素快速诱导肝再生相关基因mRNA的表达
目的:观察人重组肝细胞生成素(rhHPO)迅速诱导瞬时早期反应基因表达情况.方法:利用PT-PCR方法观察HPO刺激原代培养大鼠肝细胞24h内选择性肝再生相关基因mRNA表达情况.结果:HPO在原代培养大鼠肝细胞体系中可迅速诱导瞬时早期反应基因c-fos,LRF-1d的表达,对PC3和Tec基因也有诱导表达的作用,高峰出现在刺激后的0.5-2h,表达量增加3-5倍.结论:HPO可迅速诱导瞬时早期反应基因表达,可能是HPO促肝细胞增生的分子作用机制,首次报道PC3和Tec基因是一种与肝再生调控密切相关的早期反应基因
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基质金属蛋白酶和消化道肿瘤的相关性
基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMPs)是一种依赖金属锌离子并以细胞外基质(extraceller matrix,ECM)成分为水解底物的蛋白水解酶,主要由肿瘤细胞和肿瘤细胞周边间质细胞产生,几乎能降解细胞外基质的所有成分,通过对细胞外基质的改造而促进肿瘤新生血管的生成,从而实现肿瘤的侵袭和转移.近年来大量研究发现:不同类型基质金属蛋白酶在人类的各种消化道肿瘤中都有表达,其表达量与肿瘤的进展程度,浸润与转移以及预后都密切相关.提示人们可以通过阻断基质金属蛋白酶的作用来抑制消化道肿瘤的侵袭和转移,从而达到控制和治疗肿瘤的目的,为将来的抗癌治疗提供新的目标与方向.
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结石性胆囊炎及胆囊腺瘤性息肉黏膜组织MUC1粘蛋白的检测
目的:检测胆囊息肉、胆固醇结石、胆红素结石时胆囊黏膜MUC1粘蛋白的(半)定量表达及规律.方法:采用Western-blot法:称取液氮保存胆囊黏膜组织100--200mg加入组织裂解液lml匀浆、离心、去上清、分装、测蛋白含量、电泳、电转移、杂交、化学发光试剂检测.结果:ODu结果分别为34.29±6.06(对照组),142.11±38.49(胆红素结石组),39.72±11.46(胆固醇结石组),174.59±41.6(胆囊息肉组).结论:对照组胆囊、结石性胆囊及腺瘤性息肉胆囊有MUC1粘蛋白的表达,且表达量逐渐增高.正常胆囊-结石性胆囊炎-胆囊息肉MUC1粘蛋白的表达是上调表达;用Western-Blot可以较好地检测各种胆囊组织黏膜MUCl粘蛋白的对比含量和带形分布,不同疾病粘蛋白含量不同,带形分布不一样,相同疾病标本粘蛋白含量也不尽相同.
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温热对BGC-823胃癌细胞HSP70表达及超微结构的影响
目的:探讨热处理BGC-823人胃癌细胞后,HSP70表达与细胞凋亡及超微结构改变的关系.方法:采用MTT法及流式细胞术对BGC-823胃癌细胞株在42℃及43℃两个温度,分别热处理2、7、12 h后,进行细胞增生、凋亡及HSP表达测定,同时在透射电镜下观察肿瘤细胞的超微结构特点.结果:高热对肿瘤细胞的杀伤作用明显,各加热组均可使BGC-823细胞高表达HSP70,在43℃条件下热休克7 h后,HSP70表达量高,并与细胞的凋亡有关.随着时间延长,对肿瘤细胞超微结构的影响加大.大多数细胞表现出染色质浓缩、DNA分裂的形态学特征.结论:热处理对肿瘤细胞具有杀伤作用,43℃/7 h为诱导BGC-823细胞凋亡的适宜条件,凋亡是BGC-823细胞热诱导死亡的重要机制,热处理后HSP70过表达可能与肿瘤细胞凋亡有关.
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FAK在大肠癌中的表达及其临床意义
目的:研究黏着斑激酶(FAK)在大肠癌及癌旁组织中的表达及其与肿瘤细胞分化、浸润、转移等生物学行为的关系.方法:应用免疫组织化学LSAB法检测60例大肠癌及癌旁组织石蜡标本中FAK蛋白的表达水平.结果:FAK在癌组织中的表达明显高于癌旁组织(X2=42.553,P=0.000),低分化癌组织较高分化、中分化组织中FAK的表达水平高(X2=4.848,P=0.028),浸润程度越深表达越高(X2=11.518,P=0.001),有淋巴结转移较无转移的组织的表达水平高(X2=9.613,P=0.002).结论:FAK可能既是一种转化相关酶又是一种演变相关酶.FAK的表达量可作为肿瘤发生、发展过程中一种较有价值的病理指标.
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IRES特异性IRNA对HCV IRES启动蛋白翻译细胞内抑制作用
目的:研究核糖体内部进入位点(internal ribosome entry site,IRES)特异性抑制性RNA(inhibitor RNA,IRNA)细胞内对丙型肝炎病毒(HCV)IRES介导蛋白翻译的抑制作用.方法:体外应用脂质体细胞转染法,将IRNA及其突变体mIRNA真核表达载体pcRz-IRNA/pcRz-mIRNA转染人肝癌细胞株(HHCC),经G418筛选4 wk后建立IRNA及mRRNA表达株;以相同的方法构建pcHCVcluc转染株;以脂质体介导细胞转染法将pCMVNCRLuc转染IRNA及mIRNA细胞株,于转染后48 h检测荧光素酶表达量;将IRNA及mIRNA真核表达体转染pcHCVcLuc表达株,于转染后不同时间检测荧光素酶表达量.结果:HCVIRES介导蛋白翻译在IRNA表达株明显受到抑制,同样IRNA对HCV翻译复制子的蛋白翻译作用有明显抑制性;突变体mIRNA表达株和空载体对照株中未见相似的抑制性.结论:pcHCVcluc在HHCC细胞中获得有效表达;IRES特异性IRNA能有效的抑制HCVIRES介导细胞内蛋白翻译作用.
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HCVNS3蛋白对正常人源肝细胞生长及MAPK磷酸化的影响
目的:研究丙型肝炎病毒非结构区3(HCV NS3)蛋白对正常人源肝细胞的转化及MAPK磷酸化调节的作用.方法:利用脂质体介导转染技术和G418筛选得到稳定表达NS3蛋白的正常人源性肝细胞QSG7701,PCR和免疫组化S-P法检测细胞中NS3的表达;细胞记数和软琼脂实验鉴定其生物学性质;抗磷酸化MAPK抗体和抗MAPK抗体Westem blot检测转染细胞MAPK活性及表达.结果:HCV NS3转染的QSG7701肝细胞,其NS3蛋白过度表达于细胞质;真核表达质粒pRcHCNS3-5'转染细胞倍增时间为12 h,较pRcHCNS3-3'、pRcCMV转染细胞和未转染的QSG7701明显缩短(分别24 h,26 h和28 h).pRcHCNS3-5'、pRcHCNS3-3'和pRcCMV转染细胞及正常肝细胞在软琼脂中的克隆形成率分别为33%、1.33%、1.46%、1.11%,pRcHCNS3-5'形成的克隆明显高于其他三种细胞(P<0.01).pRcHCNS3-5'转染细胞MAPK磷酸化程度明显高于其他三种细胞(分别为8 858±877,5 612±656,2 212±245和989±188).(P<0.01),而MAPK的表达量没有差异(P>0.05).结论:人源性正常肝细胞QSG7701是研究HCV NS3蛋白致病机制的较好的细胞系;HCV NS3蛋白N端多肽具有促进细胞增生和改变细胞表型的作用;HCV NS3蛋白N端多肽能上调MAPK活性,不影响MAPK的表达量.
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肝细胞癌hOGG1 mRNA及其蛋白的表达
目的:通过检测DNA修复酶hOGGl mRNA及其蛋白在肝细胞癌中表达程度,探讨hOGGl在肝细胞癌发生、发展中的作用.方法:应用RT-RCR研究正常肝细胞株L-02、肝癌细胞株SMMC7721,HepG2和肝癌(26例)及癌旁组织(21例)中hOGGl mRNA的表达,同时用免疫组织化学方法检测了上述肝癌组织(17例)及癌旁组织(15例)中hOGGl蛋白的表达.结果:三株细胞均有hOGGl mRNA表达,但hOGGlmRNA在正常肝细胞株L-O2中的表达显著低于肝癌细胞株SMMC7721、HepG2中的表达(分别为0.270±0.014,0.66±0.011,0.624±0.020,P<0.05).肝癌组织hOGGlmRNA表达较癌周组织明显降低(P<0.05).HOGGl蛋白肝组织表达阳性率为87.2%,主要在肝细胞胞质表达,在肝癌组织中表达比癌周组织明显降低(P<0.05).结论:hOGGlmRNA及其蛋白在肝癌细胞株及癌周组织中表达量升高,这可能是肝细胞癌恶性演变过程中的一个早期预警指标.
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胃癌相关基因GCRG224的克隆及其在大肠杆菌中的表达
目的:利用硫氧还蛋白融合表达系统表达胃癌相关基因GCRG224.方法:采用PCR技术从pGEM-T质粒上扩增出含完整ORF的GCRG224 cDNA序列,将其克隆至硫氧还蛋白融合表达载体pET102/D-TOPO中,转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达重组融合蛋白,SDS-PAGE分析表达产物.结果:高效表达出相对分子量约16 800的重组融合蛋白.薄层凝胶扫描显示,其表达量占菌体总蛋白质的22.3%.结论:在大肠杆菌中成功表达了GCRG224重组融合蛋白.