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2-03 氯丙烯对神经细胞NO含量和NOS活性的影响
目的探讨氯丙烯对神经细胞NO生成系统的影响,进一步研究氯丙烯的中毒机制.方法用NO、NOS检测试剂盒(均由南京建成生物工程研究所提供)研究氯丙烯染毒后(剂量依次为0.30、0.61、1.23 mmol/L)的鸡胚脑神经细胞的NO含量、NOS活性,并与阴性对照组进行比较.结果随着氯丙烯浓度的增高,鸡胚脑神经细胞内NO含量明显增高,低、中、高3个剂量组依次为(4.63±0.37)、(4.65±0.19)、(5.95±0.223)μmo1/L.与对照组相比(3.17±0.89)μmol/L),均有显著增高(P<0.01);细胞培养液中无明显改变(P>0.05).细胞内,中、高剂量组NOS活性分别为(4.85±1.51)、(4.88±1.05)U.mg.protein-1,与对照组[(3.93±0.86)U.mg.protein-1]相比明显增高(P<0.05);细胞外仅高剂量组差异有显著性[高剂量组为(19.96±3.32)U/ml,阴性对照组为(16.22±2.32)U/ml,P<0.01].结论氯丙烯可引起神经细胞NO含量和NOS活性的增加,与我们以前报道的氯丙烯可引起细胞内Ca2+增高的结果相吻合.这可能由于细胞内Ca2+增高,激活cNOS,使其活性增强,导致NO生成增加.
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天津市2002年冬至2003年春流行性感冒病原学检测分析
为了解天津市流行性感冒(流感)流行情况,自2002年10月至2003年3月对天津市四家医院和两所学校采集流感样患者咽拭子标本,用MDCK细胞和鸡胚两种接种方法分离流感病毒.结果共采集流感样患者咽拭子标本305份,分离到流感病毒123株,其中B型90株占73.2%,A(H3N2)亚型33株占26.8%,A(H1N1)亚型未被分离到.总分离率为40.3%,如将2002年12月医院门诊(55/99)与学校采样(9/13)的两组数据汇总,该月的病毒分离率达57.1%(64/112),形成峰顶.所分离的90株B型流感病毒,其中4株为Yamagata系,占4.4%(4/90);其余的95.6%均为Victoria系.123株流感病毒均首先分自MDCK细胞,将对应的标本液直接接种鸡胚,仅收获到3株阳性尿囊液,阳性率2.4%(3/123),且均为B型毒株;阳性细胞液转种,有96.7%的B型毒株能适应生长,而33株A(H3N2)亚型毒株虽经反复转种却无一株转变为鸡胚生长适应株(0%).红细胞凝集试验中96.7%(87/90)的B型毒株的第一代细胞培养液具有D相特征(即与人O型红细胞及鸡红细胞均凝集良好),其余3株(3.3%)B型毒株及全部33株A(H3N2)亚型毒株均具只凝集人O型红细胞的O相特征,将A(H3N2)毒株在MDCK细胞上反复传代,但仍持续保持O相特征.
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草酸促进丹参悬浮细胞生长和丹参酮、酚酸的积累
在培养基中添加诱导子(包括生物诱导子和非生物诱导子)是提高植物细胞次生代谢能力的有效手段,它们的诱导效果都得到了大量试验的验证.Rajemdran等在胡萝卜细胞培养液中加入真菌Aspergillus flavus的菌丝体可使花青素产量提高2倍,大生产量达干重的23.7%.
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重组单克隆抗体的纯化研究
重组单克隆抗体是新一代生物工程技术产品,其通过特定的靶点发挥药效[1]。随着大规模哺乳动物细胞培养技术的发展,工业化细胞培养液体积可达1万升以上,抗体表达量可达5 g/L以上,极大地加重了重组单抗下游纯化的压力[2-3],下游纯化成为限制重组单抗工业化扩大的主要因素[4-6]。重组单抗杂质控制浓度指标见表1,这些指标必须通过离心、过滤和色谱层析纯化后控制在一定浓度以下[7-10]。重组抗体的纯化一般可以分为细胞培养液澄清、抗体捕获、抗体精制纯化、病毒灭活和纯化工艺的放大等流程。
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氧氟沙星、叠氮胸苷单独及与干扰素合用对黄病毒增殖的影响
选用氧氟沙星(OFLX)和叠氮胸苷(AZT)单独投入及与IFN并用,观察其抗病毒活性结果如下: 1 材料和方法 1.1 病毒和细胞所用黄病毒为乙型脑炎病毒JEV的JaGAr-01株。细胞是人肝癌细胞株HepG2。细胞培养所用培养液为DMEM加10%胎牛血清(FCS)。 1.2 感染病毒病毒感染剂量为l0 m.o.i(multiplicityinfection),37℃吸附60min,在5%CO2孵箱中培养。将各种浓度的药物添加至含病毒的细胞培养液中,24h后采取培养上清液,测定病毒的含量。 1.3 病毒滴定用空斑形成方法。将含有病毒的培养上清液按比例稀释,在24孔培养板内单层培养的仓鼠肾细胞株BHK上,添加0.6%的甲基纤维素液和含有1%FCS的MEM培养液,3d后用甲醇固定,l%结晶紫染色,计算空斑数。
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慢性肝炎患者树突状细胞体外负载抗原后的抗病毒作用
近来在抗肿瘤免疫研究中发现,树突状细胞(DC)在抗原的提呈及激活淋巴细胞使其成为肿瘤特异性细胞毒T淋巴细胞(CTL)方面有重要作用,因而有广泛的应用价值.本研究对慢性肝炎外周血树突状细胞进行体外诱导扩增,DC在未成熟阶段摄取纯的HBsAg后发育为成熟的DC,再与自身T淋巴细胞共培养,观察特异性CTL对2.2.15细胞培养液中HBeAg和HBsAg的表达抑制以及产生IFN-γ和IL-12的情况.
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3种疱疹科病毒DNA提取方法的建立
采用HSV1、HSV2和HCMV 3种疱疹科病毒的病毒细胞培养液,用冻融法、煮沸法、蛋白酶K法、NP40(乙基苯基聚乙二醇)法、综合法及改良通用法提取病毒DNA.综合法是将3种病毒细胞培养混合物各2ml,2500r/min离心10min,用2ml冷PBS缓冲液溶解沉淀,1200r/min离心5min,用1ml胰酶(0.25%)溶解沉淀,50℃保温18h,加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(25241),3000r/min离心10min,取水相加入1/2体积7.5mol/L的NH4(AC),2倍无水乙醇,-20℃放置30min,10000r/min离心10min,沉淀用70%乙醇洗涤,干燥,溶于50μl TE缓冲液.改良的通用法是在综合法基础上于提取前将病毒细胞液反复冻融3次,3000r/min离心40min纯化病毒;采用蛋白酶K(100μg/ml)38℃消化30min;4℃沉淀DNA时,18000r/ml离心20min;其余步骤同综合法.
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支气管哮喘急性期与缓解期血浆内皮素-1测定的临床意义
内皮素-1(ET-1)是日本学者Yanangisawa等在1988年首次从猪主动脉内皮细胞培养液中分离纯化的一种生物活性肽,其主要作用是收缩血管平滑肌.ET-1对支气管平滑肌及肺血管平滑肌亦有收缩作用[1],并参与许多肺部疾病的病理生理过程.为进一步探讨血浆ET-1在支气管哮喘急性发作时的作用,我们观察了哮喘患者急性期与缓解期血浆中ET-1变化.
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复方利肝冲剂药物血清对肝星状细胞NF-KB结合活性的抑制作用
目的:研究复方利肝冲剂对肝星状细胞NF-κB结合活性的影响,探讨复方利肝中剂抗肝纤维化的主要作用机制.方法:复方利肝冲剂药物血清与鼠肝星状细胞共孵育48h后,NF-kB结合活性的检测采用凝胶电泳移动抑制法,细胞培养液中细胞因子的检测采用ELISA去,细胞凋亡和细胞增殖分别采用流式细胞术和3H-TdR掺入法检测结果:复方利肝中剂药物血清使长外培养的鼠肝星状细胞NFkB结合活性比无药血清对照组显著减弱(图1),细胞培养液中的IL-6和sJCAM水平降低(1.56±0.42ng·L-1vs3.64±0.58ng·L-1.P<0.05;3 82±0.98ng·L-1vs12.64±1.22ng·L-1,P<0.01)星状细胞凋亡增加24.8%± 3.60%vs6.6%± 1.2%,P<0.01,增殖减少2623±654/孔vs5061±346/孔,P<0.01.结论:复方利肝中剂显著抑制体外培养的肝星状细胞NF-κB结合活性,可能为其抗纤维化的重要机制之一.
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温郁金对胃癌细胞的抑制作用及其对IGF-I、IGF-Ⅱ表达的影响
目的:探讨温郁金对人胃癌细胞SGC-7901的抑制作用及其作用机制.方法:采用超临界二氧化碳萃取法提取温郁金挥发油成分,以氟尿嘧淀(5-Fu)为阳性对照药物,采用MTr法,测定温郁金提取物对体外培养胃癌细胞SGC-7901增生的影响;应用放射免疫测定法分析温郁金提取物对细胞培养液中IGF-I、IGF-Ⅱ浓度水平的影响.结果:超临界二氧化碳萃取法提取温郁金获得温郁金提取物1和提取物2.温郁金提取物1、提取物2对胃癌细胞的生长有显著的抑制作用(均P<0.01),且抑制率随药物浓度的升高而增高,存在明显的量效关系.200 mg/L浓度的温郁金提取物1和提取物2对胃癌细胞生长的抑制率分别为64.44%、60.80%,在这个浓度水平,其抑制肿瘤细胞生长作用与阳性对照药物5-Fu效果相当.温郁金提取物1、提取物2能降低胃癌细胞培养液中IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ的浓度水平(均P<0.05).结论:温郁金提取物对人胃癌细胞SGC-7901生长有抑制作用,其抑癌作用的机制可能与抑制胃癌细胞分泌IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ有关.
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反义VEGF寡核苷酸与碘油混合肝动脉注入转染鼠肝癌的可行性
目的:探讨反义VEGF寡核苷酸(antisense oligodeoxynucleotides,ASODN)转染Walker-256瘤细胞及其与碘油混合后肝动脉注入转染鼠肝癌及在鼠肝、肺、肾组织的分布情况.方法:将异硫氰酸荧光素(5'-FITC)标记的VEGF ASODN加入培养的Walker-256瘤细胞培养液中,不同时间用荧光显微镜观察细胞内ASODN的分布.12只Walker-256移植性大鼠肝癌模型,一组肝动脉内注入荧光标记的VEGFASODN(TAI组,n=6),另一组肝动脉内注入荧光标记的VEGF ASODN与超液态碘油的混合液(混合组,n=6),两组分别于术后1 d、3d、6d取动物的肝、肺、肾组织行冰冻切片,荧光显微镜观察各组织内ASODN的分布情况.结果:荧光标记的ASODN与Walker-256瘤细胞共同培养后2 h时可见瘤细胞胞质内有点状荧光染色,6 h胞核内有荧光染色,12 h荧光染色强,胞核及胞质中均可见荧光染色,24h荧光物质减少,48h完全消失.1 d和3 d时混合组肝癌组织及肝组织内荧光染色强于TAI组,而肺、肾组织荧光染色弱于TAI组;6 d时TAI组肝、肺、肾组织内荧光染色基本消失,而混合组肝、肺、肾组织仍有少许荧光染色.ASODN可以进入肝癌细胞及瘤周肝细胞.结论:VEGF ASODN可以转染Walker-256细胞,其与碘油混合后可以延长ASODN在肝内的停留时间,增加对肝癌组织的转染率,减少其在肝外组织的分布.与碘油混合后肝动脉注入是VEGF ASODN反义基因治疗肝癌的理想给药方法.
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沉默唯BH3蛋白Bim的表达对缺氧致大鼠心肌细胞凋亡的影响
目的:探讨唯BH3蛋白Bim在缺氧致大鼠心肌细胞凋亡中的作用。
方法:在体外原代培养出生1~3天的大鼠心肌细胞,并用抗ɑ-横纹肌肌动蛋白免疫组化法进行鉴定。用脂质体法将Bim-siRNA瞬时转染细胞,制作缺血缺氧损伤模型(转染48 h后给予缺氧12 h处理)。实验分组:①正常对照组;②缺氧组;③缺氧+阴性对照siRNA组;④缺氧+脂质体组;⑤缺氧+Bim-siRNA组。用倒置显微镜观察并记录心肌细胞搏动频率与节律;用全自动生化分析仪测定细胞培养液中乳酸脱氢酶(LDH)释放量,以判断细胞损伤情况;用MTT法检测细胞存活率;用流式细胞仪检测细胞凋亡情况;用Western blot检测Bim、Bax、Bcl-2和p-P38MAPK在心肌细胞中的表达情况。 -
老年原发性肺癌患者血浆中血管内皮生长因子测定的临床意义
免疫组化研究表明,肺癌组织中存在血管内皮细胞生长因子(VEGF)的过度表达,VEGF能促进血管的生长及增加血管的通透性,在癌细胞培养液中可检测到VEGF的存在[1].我们于1999年2月至2002年6月测定老年人各期原发性肺癌患者血浆中VEGF水平及其治疗前后的变化,并与老年健康人及肺良性疾病患者进行比较,旨在探讨其在老年人原发性肺癌诊断、监测预后中的意义.
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成纤维细胞生长因子-10上调人角朊细胞TGFα的分泌
目的:探讨成纤维细胞生长因子-10(FGF-10)促创面肉芽组织形成的作用机制.方法:将不同浓度的FGF 10分别加入细胞培养液中,于作用后24、48和72h收集细胞培养上清,采用ELISA方法测定粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子GM-CSF的含量,同时进行细胞计数.结果:当细胞接种密度为2 500细胞/cm2时,24h的培养上清中未能检测到GM-CSF,48h的上清中125 ng/ml和500ng/ml FGF-10组GM-CSF的浓度及单个细胞的GM-CSF的分泌均显著高于对照组(P<0.05).72h的培养上清中仅500ng/ml FGF-10组GM-CSF的分泌量显著高于对照组(P<0.05).当细胞接种密度为5 000细胞/cm2时,16~500ng/ml的FGF-10各组GM-CSF浓度显著高于对照组(P<0.05),但单个细胞的GM-CSF分泌量与对照组无显著差异(P>0.05),48h收集的培养上清中,与对照组相比,FGF-10各组的GM-CSF均未升高,且48h各组单个细胞的GM-CSF分泌量与该培养皿中的细胞总数呈负相关(r=-0.881,P<0.05).结论:实验结果提示FGF-10可能通过刺激GM-CSF的分泌,从而间接作用于成纤维细胞、内皮细胞等,促进创面肉芽组织形成.
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抗骨质疏松药XW630对成骨细胞碱性磷酸酶mRNA表达的影响
目的研究新设计的抗骨质疏松药物XW630对成骨细胞碱性磷酸酶基因表达的影响,为其治疗骨代谢性疾病提供理论和实验依据.方法以成骨细胞MC3T3-E1为体外实验模型,用含有10-6mol/L浓度的XW630,雌酚酮,四环素及四环素加雌酚酮的细胞培养液DMEM培养细胞,24 h和72 h提取细胞总RNA并与碱性磷酸酶cDNA进行Northern杂交.结果 XW630对成骨细胞MC3T3-E1合成和分泌碱性磷酸酶具有明显的促进作用.结论 XW630具有明显的促进成骨作用.
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血管平滑肌细胞培养液和膀胱匀浆上清对大鼠骨髓间充质干细胞的诱导分化
我们利用已经分化成熟的血管平滑肌细胞(VSMC)培养液和膀胱组织匀浆上清对骨髓间充质干细胞(MSC)体外诱导分化进行了研究,现报告如下.
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上尿路结石中纳米细菌的检测
纳米细菌是20世纪90年代新兴的研究课题,研究认为肾结石可能是一种纳米细菌疾病[1].我们从上尿路结石中培养出纳米细菌并通过电镜鉴定.现报告如下.材料与方法主要试剂:DMEM细胞培养液(高糖型,Hyclon公司),类标准胎牛血清(兰州民海生物公司),Hoechst33258DNA染色试剂盒(江苏碧云天生物公司).
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血管内皮抑素与卵巢癌发生、发展关系的研究进展
卵巢癌是严重威胁妇女健康的主要恶性肿瘤之一,死亡率居于妇科恶性肿瘤之首.研究表明,卵巢癌组织的发生、发展依赖于肿瘤血管的形成,肿瘤微血管密度与其恶性程度和生物学特性密切相关,抑制肿瘤新生血管生成对肿瘤的治疗具有重要意义.目前,已发现几种血管生成抑制剂具很强抑制血管生成的作用,O′Reilly等[1]继1994年分离出相对分子质量为38 000的血管生长抑素(angiostatin)后,1997年从小鼠血管内皮瘤细胞培养液中分离出血管内皮抑素(endostatin),其强大的抑制血管生成及抑制肿瘤生长、侵袭和转移的作用引起广泛关注.现就血管内皮抑素与卵巢癌发生、发展关系的研究进展作一综述.
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重组腺病毒载体转导的脑源性神经生长因子在大鼠体外培养海马神经元谷氨酸损伤模型中的保护作用
近年来研究表明,脑缺血缺氧损伤机制与兴奋性氨基酸兴奋毒性、钙超载和细胞凋亡等有关.谷氨酸具有毒性损伤作用,但其是否能够引起细胞凋亡尚不确定.大量文献报道,在细胞培养液中加入谷氨酸可模拟体内兴奋性氨基酸损伤状态,但这种损伤与细胞凋亡的关系尚未完全明了.脑源性神经生长因子(BDNF)是神经营养因子之一,这类因子可促进神经元分化生长,对应激状态也有保护作用,但机制尚不完全明了.
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脑肿瘤干细胞起源的探讨
一、脑肿瘤干细胞1.脑肿瘤干细胞的发现:1997年,Bonnet和Dick~([1])率先在人类急性粒细胞自血病中发现了肿瘤干细胞,后来用干细胞培养液对恶性胶质瘤组织进行培养,得到了一群悬浮生长,能够自我更新,并且表达干细胞标记物的细胞,称之为脑肿瘤干细胞~([2-3]),在传过上千代的胶质瘤细胞株中也得到了这种细胞~([4]).