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不同浓度的8型解脲支原体对小鼠早期胚胎发育的影响
解脲支原体(Ureaplasma urealytic-um,Uu)可以是一种病原体,也可以是一种共生菌,为观察Uu在早期胚胎发育中的影响,我们用不同浓度的8型Uu分别与ICR小鼠的2细胞期胚胎共孵育,观察其对小鼠早期胚胎发育的影响.
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精子功能检测技术的应用浅析
人的体外受精初由Roek和Menkin(1944年)进行实验,他们从卵巢取出卵子,培养后与精液共孵育45小时,133个卵子有4个受精,并达到2~3个卵裂球阶段.继而,由Schettles(1955年)将卵子与精子共同培养,并在培养液中加入输卵管液,发现部分受精卵发育到桑葚胚阶段.
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复方利肝冲剂药物血清对肝星状细胞NF-KB结合活性的抑制作用
目的:研究复方利肝冲剂对肝星状细胞NF-κB结合活性的影响,探讨复方利肝中剂抗肝纤维化的主要作用机制.方法:复方利肝冲剂药物血清与鼠肝星状细胞共孵育48h后,NF-kB结合活性的检测采用凝胶电泳移动抑制法,细胞培养液中细胞因子的检测采用ELISA去,细胞凋亡和细胞增殖分别采用流式细胞术和3H-TdR掺入法检测结果:复方利肝中剂药物血清使长外培养的鼠肝星状细胞NFkB结合活性比无药血清对照组显著减弱(图1),细胞培养液中的IL-6和sJCAM水平降低(1.56±0.42ng·L-1vs3.64±0.58ng·L-1.P<0.05;3 82±0.98ng·L-1vs12.64±1.22ng·L-1,P<0.01)星状细胞凋亡增加24.8%± 3.60%vs6.6%± 1.2%,P<0.01,增殖减少2623±654/孔vs5061±346/孔,P<0.01.结论:复方利肝中剂显著抑制体外培养的肝星状细胞NF-κB结合活性,可能为其抗纤维化的重要机制之一.
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多种细胞因子联合诱导大肠癌患者外周血单个核细胞为CIK细胞的免疫表型
目的:用多种细胞因子联合诱导大肠癌患者外周血单个核细胞为细胞因子诱导的杀伤(cytokine-induced killer,CIK)细胞,并了解其在体外的增殖能力及免疫表型的变化.方法:用Ficoll Hypaque淋巴细胞分离液分离获取10例大肠癌患者外周血单个核细胞,rhIFN-γ,rhIL-2,Anti-CD3mAb共孵育.分别在第0,4,7,10,13 d计细胞数,并通过流式细胞术检测细胞免疫表型.结果:大肠癌患者外周血单个核细胞与IFN-γ,IL-2,Anti-CD3mAb共孵育4,7,10,13 d,细胞数分别增加2.69±0.9,14.1±3.7,23.0±5.0和31.2±3.0倍.CD3+,CD4+,CD8+和CD3+CDl6+CD56+细胞在培养第13 d分别从(62.8±7.6)%,(31.5±5.8)%,(44.9±8.2)%和(1.9±0.9)%增加到(90.6±9.0)%,(48.0±6.3)%,(57.3±9.0)%和(41.0±12.7)%.结论:rhIFN-γ,rhIL-2和Anti-CD3mAb能诱导大肠癌患者外周血单个核细胞为CIK细胞,体外增殖力强,是以CD3+CDl6+CD56+为主的异质细胞群.
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CPG-ODN介导活化的人免疫细胞体外抗乙型肝炎病毒作用
目的:探讨CpG-ODN活化的人外周血单个核细胞(PBMC)体外对HBV复制和表达的抑制作用.方法:CpG-ODN体外刺激PBMC,ELISA测培养液IFN-α及IFN-γ的分泌;将CpG-ODN介导活化的PBMC与HepG2.2.15细胞按一定比例共孵育1d、2d和3d后,ELISA检测培养上清液中HBsAg、HBeAg的分泌,荧光定量PCR检测HepG2.2.15细胞内HBV DNA和HBV mRNA的含量;并以MTT和酶学检测活化的PBMC对HepG2.2.15细胞的杀伤作用.结果:CpG-ODN有效诱导PBMC分泌IFN-α和IFN-γ;CpG-ODN本身虽不能直接抑制HBV的复制,但由CpGODN介导活化的PBMC却能显著减少HepG2.2.15细胞对HBsAg、HBeAg的分泌,同时对HBV DNA和HBV mRNA的抑制作用亦明显增强;CpG-ODN介导活化的PBMC对HepG2.2.15的杀伤作用增强.结论:CpG-ODN可通过活化机体免疫细胞,而具有明显的抗HBV复制和表达作用.
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线粒体自噬参与Ox-LDL诱导的THP-1来源泡沫发生发展过程
目的:探索线粒体自噬在泡沫细胞形成过程中的作用。
方法:不同剂量ox-LDL(25μg/ml、50μg/ml 或100μg/ml)分别与THP-M共孵育6、12、24、36、48、60、72 h,油红染色观察THP-M细胞内脂质沉积量,并提取细胞蛋白利用Western blot检测不同阶段泡沫细胞中LC3Ⅱ,Beclin-1, P62和Parkin蛋白的表达量,观察线粒体自噬的变化情况;然后,利用Parkin siRNA干扰Parkin蛋白的表达,ox-LDL(50μg/ml)与THP-M共孵育48 h,通过JC-1 indicator,荧光共定位、western blot、油红染色以及电镜观察Parkin蛋白表达量的变化对线粒体自噬、泡沫细胞形成的影响。 -
再生障碍性贫血患者骨髓间充质干细胞的造血实验研究
再生障碍性贫血(AA)是一种高度异质性的疾病.骨髓间充质干细胞(MSC)及其分化的基质细胞、微循环、支配神经及体液调节因子组成造血微环境,微环境的紊乱势必影响造血.本实验将56例AA按发病机制分组后,使造血微环境功能缺陷组与正常人MSC共孵育,探讨MSC能否支持再障微环境功能缺陷组的造血,为MSC治疗AA提供理论依据.
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肿瘤坏死因子α介导的体外培养人血管平滑肌细胞基质金属蛋白酶及其组织抑制剂的表达
目的采用肿瘤坏死因子(TNF-α)与胎儿主动脉平滑肌细胞(SMCs)共孵育,通过抗体阻滞实验方法,探讨中和抗体对TNF-α介导的基质金属蛋白酶(MMPs)及组织型金属蛋白酶抑制剂(TIMPs)表达增强的影响,试图在细胞和分子的水平上探讨动脉粥样硬化不稳定斑块相关的发病机制,为临床防治提供新的思路.
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亚甲蓝对精子运动及质膜完整性的影响
体外研究发现亚甲蓝( methylene blue,MB)会抑制人精子的活力[1].为进一步研究MB对精子的毒性作用,我们通过低剂量MB与人精子共孵育2h的体外实验以及高剂量MB连续灌服大鼠14 d的在体实验,观察MB对精子生成、精子活力以及精子质膜完整性的影响.
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生存素、Bcl-2在幽门螺杆菌诱导胃癌细胞增殖和凋亡中的表达
细胞增殖和凋亡失衡是胃癌发生的重要机制之一[1].近年的研究表明,幽门螺杆菌(Hp)对体外培养的胃上皮细胞增殖和凋亡存在影响,但机制尚未明确.本研究用不同浓度Hp与SGC 7901细胞共孵育,观察Hp对体外培养的胃癌细胞增殖与凋亡的影响,并用RT-PCR法检测凋亡相关基因的表达,探讨其可能的分子机制.
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碱性成纤维细胞生长因子基因敲除肝细胞与结肠癌细胞的关系
我们通过建立一个全新的三维细胞共培养模型观察肿瘤细胞与宿主细胞之间的关系.同时观察来源于野生型及碱性成纤维细胞生长因子(FGF)-2基因敲除的小鼠的肝细胞对结肠癌细胞的移行、增殖的影响,以及共孵育一段时间后培养液内表皮细胞生长因子(EGF)、血管内皮生长因子(VEGF)浓度的变化.
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Urotensin II诱导HepG2细胞胰岛素抵抗模型的建立及机制探讨
目的:采用Urotensin II( UII)体外诱导法建立HepG2细胞胰岛素抵抗模型,并探讨其机制。方法:采用含不同UII浓度的DMEM培养基培养HepG2细胞,后半小时与1×10-7 mol/L insulin共孵育,葡萄糖-己糖激酶法检测不同时点培养基中葡萄糖含量,以HepG2细胞蛋白进行定量,确定胰岛素抵抗佳作用浓度及时间;多功能酶标仪检测UII诱导hepG2细胞内活性氧( ROS)变化;Western blot法检测胰岛素受体结合物IRS-1及Akt蛋白的表达。结果:hepG2细胞产生胰岛素抵抗的佳作用时间为24 h,佳UII浓度为1×10-7 mol/L。与空白对照相比,UII刺激hepG2细胞后ROS增高明显( P<0.05);且UII孵育组IRS-1及Akt蛋白的表达明显降低(P<0.05),提示UII可能通过增高hepG2细胞中ROS而使hepG2细胞产生胰岛素抵抗。结论:采用UII体外诱导的方法,UII浓度为1×10-7 mol/L,作用24 h后,可建立HepG2细胞胰岛素抵抗模型,且UII可能通过诱导HepG2细胞ROS的增高而引起胰岛素抵抗。
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Tau蛋白通过募集蛋白磷酸酯酶2 A加速细胞外信号调节激酶的去磷酸化
目的:探讨tau蛋白对蛋白磷酸酯酶2A(PP2A)的调节作用以及对细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)的影响。方法:用Western blotting分别检测野生型和tau基因敲除型小鼠海马组织ERK1/2的蛋白表达及磷酸化水平;用纯化的磷酸化ERK分别与野生型和tau基因敲除型小鼠海马组织匀浆液共孵育,通过免疫共沉淀实验以及丝/苏氨酸磷酸酯酶活性实验检测与ERK结合的PP2A活性。结果:与野生型小鼠相比,tau基因敲除型小鼠海马组织内ERK1/2磷酸化水平明显增高。体外实验显示:纯化的磷酸化ERK与tau基因敲除型小鼠海马组织匀浆液共孵育后,其去磷酸化过程受到明显抑制,这一过程在加入重组的tau蛋白后得到逆转。免疫共沉淀实验以及丝/苏氨酸磷酸酯酶活性实验显示:与野生型小鼠相比,tau基因敲除型小鼠海马组织内与ERK结合的PP2A明显减少,活性显著下降。结论:Tau蛋白通过募集PP2A加速ERK1/2的去磷酸化。
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PI3 K/Akt/FoxO1介导的PKG转录抑制参与了硝酸甘油耐受形成
目的:PKG在血管硝酸甘油(nitroglycerin, NTG)耐受形成中起重要作用,PI3K/Akt信号通路与血管张力调节关系密切,本研究旨在探讨该通路在NTG耐受形成中的作用及其机制。方法:通过猪离体冠状动脉孵育NTG(10-5 mol/L,24 h)建立离体NTG耐受模型;通过皮下注射NTG(20 mg/kg体重,每天3次,连续3 d)建立小鼠在体NTG耐受模型;运用离体血管环灌流、Western blot、实时定量PCR及免疫荧光等方法进行研究。结果:离体和在体研究表明,耐受组血管对硝酸甘油的舒张反应较对照组显著减弱,并且耐受组血管的p-Akt (Ser473)蛋白水平显著增加。 PI3K的特异阻断剂LY294002与NTG共孵育冠状动脉24 h,可显著抑制耐受组引起的p-Akt (Ser473)蛋白水平升高,同时部分改善了血管对NTG的反应性。耐受组冠状动脉PKG的蛋白和mRNA水平较对照组明显降低,且均可被LY294002所反转。耐受组血管的p-FoxO1( Ser256)蛋白水平较对照组显著升高,且出现由胞核向胞浆的转位,以上现象均可被LY294002所阻断。结论:活化的PI3K/Akt通过促进FoxO1的出核,抑制了PKG的表达,从而导致NTG耐受。
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有免疫兴奋作用的氟喹诺酮类--芦氟沙星的药理与临床(二)
表3结果表明芦氟沙星与细菌及吞噬细胞同时共孵育的吞噬作用比无芦氟沙星者明显增多.无芦氟沙星被吞噬的活细菌可保持孵育期90 min,其细胞内存活指数大于2.有芦氟沙星者活菌减少,3 h内下降60%~97%.
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血管紧张素Ⅱ对肝星状细胞增殖及胶原合成影响
1.材料与方法:雄性SD大鼠,体重400-450 g.购于上海医科大学实验动物中心.肝星状细胞(HSC)的分离采用原位酶消化法.链酶蛋白酶、胶原酶、Nycodenz 等均为Sigma公司产品.将不同浓度(10-9、10-8、10-7、10-6、10-5mol/L)血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)与无血清培养HSC共孵育.AngⅡ对HSC增殖的影响采用MTT法测定.对HSC胶原合成的影响采用3H-晡氨酸掺入法测定.培养上清液透明质酸、层粘连蛋白采用放射免疫法测定(试剂盒购于上海海军医学研究所).HSC平滑肌动蛋白(α-SMA)表达采用免疫组织化学染色.
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用免疫组化ABC法的漂片法做好脑片实验的体会
ABC法是将亲和素作为桥,把生物素化的抗体与生物素结合的酶连接起来.首先,以Ⅰ抗与组织切片共孵育,使特异性Ⅰ抗与组织中的相应抗原结合,之后加上生物素标记的Ⅱ抗,Ⅱ抗与Ⅰ抗通过抗原-抗体反应结合,后加入ABC复合物,Ⅱ抗上的生物素则与ABC复合物中的亲和素上空下的位点结合.用ABC法中的漂片法做脊髓冰冻切片的染色比较容易做出结果,但如果是用此法做大鼠脑的冰冻切片染色则较难做出结果,特别是做出漂亮的脑片更难.作者在用ABC漂片法做脑组织冰冻切片的免疫组织化学实验的过程中,通过改变常规的操作步骤环节,使做出的脑片质量大为提高.以下实验技术介绍的是将免疫组化ABC法的漂片法用于脑组织冰冻切片中的几点体会.
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免疫磁技术在分离人外周血树突状细胞中的应用
免疫磁珠技术(Immuno-magnetic bead metho d,IMBM)是70年代起步,80年代兴起的,在国内、外应用较多的一种新型细胞分离技术.该项技术以免疫学为基础,渗透到病理学等各个领域,应用日趋广泛.尤其是在细胞分离等方面取得巨大进展.本文就IMBM及其在树突状细胞(dendritic c ell简称DC)分离纯化中的应用进行简单介绍.一、IMBM简介:1.免疫磁珠是一种直径数微米、大小均匀的球形结构,由三部构成. 其核心是金属小颗粒铁;核心周围均匀地包裹着一层高分子材料,可防止金属微粒漏出;外层为功能团,可结合特异性单克隆抗体.2.该技术的功能原理是:其表面被覆的特异性单克隆抗体或第二抗体可分别与特异性靶细胞结合,形成磁珠-抗体-抗原复合物;再用磁铁吸引复合物,使之与其他物质相分离.当磁珠-抗体-抗原复合物离开磁场,靶细胞得以收集.3.该分离方法可分为直接法和间接法;两种方法又均可存在阳性选择或阴性选择两种方式.二、IMBM在人外周血树突状细胞分离中的应用:DC具有呈递抗原,参与机体肿瘤免疫的重要作用,但其在外周血液中的含量仅占1%.用常规分离方法获取DC十分繁琐,耗时长、收获少、纯度低,且对细胞的损伤也较大.我室将IMBM应用于人外周血DC的分离 ,获得较好效果,现简介如下:首先用Ficoll密度梯度离心技术从人外周血中获得单个核细胞,再通过二步来分离DC.第一步:用标记的CD3、CD11b、CD16的混合性抗体与单个核细胞共孵育;清洗,然后再与磁珠标记的抗半抗原抗体共孵育.孵育后的细胞悬液在通过磁场时,磁珠标记的CD3+、CD11b+、CD16+的细胞则被吸附在阴性选择柱中,而未与磁珠标记的抗体相结合的细胞从磁场中流出被收集,即为富含DC的细胞悬液.第二步:将富含DC的细胞悬液与磁珠标记的CD4单克隆抗体共孵育 .则CD4+ DC在通过磁场时被吸附,从而使之被收集到阳性选择柱中.将分离柱移离磁场,冲出柱内细胞,清洗后,从而使被收集到阳性选择柱中.将分离柱移离磁场,冲出柱内细胞,清洗后,荧光抗体检验DC纯度为95%.三、讨论:在细胞分离时,应尽量使用人新鲜抗凝血,整个操作过程动作要轻柔.与磁珠标记的抗体孵育时间和温度可根据细胞数量的多少适当调整;孵育过程中,要不断地轻轻地摇动,以使细胞与抗体充分结合;冲洗细胞时,离心的速度和时间不宜过快和过长.细胞过柱前要用300目的尼龙网过滤,以免分离柱被成团细胞阻塞,影响分离效果.