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低氧对骨髓间充质干细胞生物学特性的影响
近年来,大量研究表明骨髓间充质干细胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells,BMMSCs)是一群具有多向分化潜能、低免疫原性的多能干细胞,在一定的诱导条件下能终分化成心肌、骨、软骨、神经等多种组织,易于在体外分离培养,并易于为外源基因转染和表达。这些特性使 BMMSCs成为在细胞治疗、基因治疗中有效发挥疗效的理想工程细胞,展示了其作为一种新的理想干细胞来源在治疗多种缺血缺氧性疾病中的良好应用前景[1-3]。但骨髓中 BMMSCs含量极其稀少,研究显示,BMMSCs在新生儿骨髓单个核细胞中占0.01%,随着年龄增大,数量逐渐降低,到80岁仅占0.00005%[4]。而应用于临床治疗的干细胞每次需要5千万~2亿个,这不可能从一个捐献者体内分离获得[5-7],而是需要进行体外扩增。但是,BMMSCs 体外增殖亦较慢,因此,如何实现少量取样,批量获取是 BMMSCs满足临床试验研究的当务之急。BMMSCs 的自我更新受多种复杂微环境的调控,如细胞间的接触、各种蛋白及生长因子等,而微环境中的氧张力是调控 BMMSCs功能的重要因素[8]。早在1958年,Cooper等[9]发现在低氧条件下培养细胞时,细胞的增殖能力增强。骨髓中氧张力仅为1%~6%[10-13],因此,推测低氧可能更适合骨髓间充质干细胞的培养。另外,当缺血性心脏病、缺血性脑病等发生时,局部损伤器官多处于低氧微环境中,局部氧浓度可低于0.2%[14-15],BMMSCs移植后疗效的发挥与损伤部位的低氧环境密切相关。因此,开展低氧条件对间充质干细胞生物学特性的研究对于 BMMSCs的应用具有非常重要的意义。
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大鼠骨髓间充质干细胞的体外分离培养与多向分化鉴定
目的::建立体外分离、培养及纯化大鼠骨髓间充质干细胞( mesenchymal stem cells, MSCs)的方法,并对细胞进行形态学观察、表面标志物鉴定及分化潜能检测,为大鼠MSCs 进行细胞移植治疗脑损伤的研究奠定基础。方法:用全骨髓贴壁培养法分离、培养、纯化大鼠MSCs,倒置相差显微镜进行形态学观察,流式细胞仪检测细胞表面标记物,定向诱导向成脂、成骨方向分化。结果:72小时首次全量换液7天后观察可见呈放射状排列的细胞集落,以梭形细胞为主,细胞规则、生长旺盛,可连续传代10代以上;取3代MSCs流式细胞仪检测,CD90呈阳性表达,CD34、CD45均呈阴性表达;细胞传代后加入成脂、成骨诱导剂定向诱导分化,油红O染色及茜素红染色均呈阳性。结论:全骨髓贴壁筛选培养法可大量分离、纯化、扩增大鼠MSCs。经诱导鉴定MSCs 具有多项分化潜能。
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重症肝炎患者外周血单个核细胞对内毒素敏感性的体外研究
我们用TNF-a做为检测指标,对重症肝炎患者外周血单个核细胞(PBMC)进行体外分离培养,以观察内毒素对PBMC释放TNF-a能力的影响.
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大鼠肠巨噬细胞TNFα表达及复方大承气汤的影响
目的:探讨体外培养的肠巨噬细胞分泌TNFα的规律及地塞米松、TNFα单克隆抗体及复方大承气汤对LPS诱导的肠巨噬细胞TNFα产生的影响.方法:体外分离培养大鼠肠巨噬细胞.设对照组、脂多糖组、地塞米松处理组、TNFα单抗处理组和复方大承气汤处理组.每组分别在3 h,6 h,12 h和24 h取上清液,用放免法检测TNFα浓度.并分别收集肠巨噬细胞,提取RNA,采用RT-PCR法相对定量TNFαmRNA.结果:肠巨噬细胞经脂多糖(LPS)诱导后,各时相TNFα分泌及TNFmRNA表达均明显增加;地塞米松、TNFα单克隆抗体及复方大承气汤处理后,各时相TNFα分泌都较脂多糖(LPS)诱导组显著下降,各处理组TNFα mRNA表达在3h时与脂多糖(LPS)诱导组比较无明显差异,6h、12h、24 h,地塞米松、复方大承气汤处理组显著降低,而TNFα单克隆抗体处理组无明显差异.结论:LPS是肠巨噬细胞分泌TNFα的有效激活剂,地塞米松、复方大承气汤能从蛋白质及核酸水平抑制TNFα的产生,而TNFα单克隆抗体只能从蛋白质水平抑制TNFα的产生.
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透射电镜及激光共聚焦技术观察体外丙型肝炎病毒感染的人胎盘滋养层细胞
目的:探讨体外分离培养的人体胎盘滋养层细胞感染丙型肝炎病毒(HCV)的可能性,以及滋养层细胞感染HCV后的超微结构改变.方法:采用胰蛋白酶消化法及Percoll密度梯度分离法分离培养人胎盘组织中滋养层细胞后,以HCV RNA阳性血清对滋养层细胞进行体外感染试验,应用RT-PCR法定性及定量检测感染后细胞培养上清中HCV RNA,透射电镜观察HCV感染后滋养层细胞的超微结构改变,并用激光共聚焦技术观察免疫荧光染色后HCV NS5在滋养层细胞中的定位.结果:HCV感染后的细胞培养上清中可间断检测到HCVRNA,而对照组始终未检出;激光共聚焦观察显示HCV NS5主要定位于细胞核周;HCV感染后滋养层细胞超微结构发生了明显改变,主要表现为溶酶体大量增生,粗面内质网增生,脂滴减少,出现空泡状结构,并可观察到病毒样颗粒.结论:HCV可以感染滋养层细胞,并导致滋养层细胞的超微结构发生类似黄病毒科病毒感染后的改变.
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雌二醇对人成骨细胞增殖及基质金属蛋白酶活性的影响
本文报道了雌二醇对体外分离培养的人成骨细胞增殖的影响,SDS-Gel-PAGE电泳及固体胶原-羟脯氨酸测定法测定成骨细胞基质金属蛋白酶(MMPs)活性.结果表明:低浓度雌二醇对人成骨细胞有刺激增殖的作用,1.3×10-7M时刺激作用强,浓度过高则抑制细胞增殖,成骨细胞的分化则随着雌二醇浓度的增加而分化越好,随雌激素浓度增加成骨细胞MMP活性也相应增大与分化程度一致.
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大鼠骨髓间充质干细胞的体外分离、培养及鉴定
目的 探讨研究大鼠骨髓间充质干细胞的体外分离、培养及鉴定.方法 利用流式细胞检测技术,检测了分离培养的贴壁细胞CD29、CD90和CD45表面抗原的表达.结果 本实验通过流式细胞检测,发现CD29阳性率为91.9%;CD45阳性率为6.9%;CD90阳性率51.3%;CD29/CD45阳性率为7.4%; CD90/CD45阳性率为3.6%.结论 本研究通过贴壁筛迭法和全骨髓培养法得到的细胞是骨髓中不同于造血系细胞的另一种细胞成分,应为间充质干细胞,不是造血系细胞.
关键词: 大鼠骨髓间充质干细胞 体外分离培养 鉴定 -
人胎盘贴壁细胞的分离培养及造血相关因子表达
目的探讨人胎盘贴壁细胞(hPDAC)的分离培养及造血相关因子的表达.方法酶消化法分离培养人胎盘组织中贴壁细胞,并鉴定其生物学特性,用RT-PCR方法检测造血相关因子表达.结果成功分离培养出hPDAC,并证实其具有间充质干细胞特性,表达多种造血相关因子,包括SCF、FL、G-CSF、GM-CSF、M-CSF和IL-6.结论 hPDAC可为脐血CD34+细胞体外扩增提供潜在滋养层.
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生殖器疱疹
1病原学单纯疱疹病毒(HSV)是早发现的人类疱疹病毒.但直到20世纪初能够从体外分离培养单纯疱疹病毒后,HSV及其引起的疾病才逐渐被认识清楚.
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绿色荧光蛋白基因标记骨髓间充质干细胞的研究进展
骨髓间充质干细胞(mesenehymal stem cells,MSCs)是具有自我复制、多向分化潜能的成体干细胞.其体外分离培养易取,细胞免疫原性低,易于被外源基因转染且表达稳定,已成为组织工程、基因治疗和再生医学研究中理想的种子细胞.且近年研究发现MSCs具有免疫调节和组织修复作用,故其在风湿病领域的研究渐受到重视.然而,干细胞移植后在体内的迁移、定植、分布、分化等有赖于对干细胞的示踪和定量技术.因此,寻找一种稳定、高效、持续的标记分子成为MSCs的研究热点.
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组织工程化关节软骨的研究进展
20世纪80年代以来, 组织工程学的出现及发展为解决关节软骨缺损、重建关节功能提供了新思路, 使软骨组织缺损的完全再生成为可能.软骨组织工程是当前组织工程研究的热点之一,它的基本方法是将体外分离培养的正常组织细胞接种到具有一定空间结构和良好的生物相容性的三维支架上, 然后将细胞-支架复合物在体外继续培养或植入体内, 同时辅以特殊的生长因子, 支架材料逐渐降解, 为细胞分泌的基质所代替,形成组织或器官的结构, 并行使功能,现将其研究进展综述如下.
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不同部位来源的神经干细胞的研究进展
神经干细胞体外分离培养的成功,为神经系统疾病的细胞移植治疗提供了广阔的细胞来源.目前,从脑、脊髓、骨髓、脐血、脂肪组织和脐带等均可分离得到神经干细胞,并可诱导分化为其他细胞.但是,神经干细胞来源部位不同,其分离培养的方法及其特性均不同.本文就近年来不同部位来源的神经干细胞的研究进展作一综述.
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肿瘤浸润淋巴细胞
肿瘤浸润淋巴细胞作为一种新型免疫活性细胞,在过继免疫治疗进展期肿瘤中取得了令人鼓舞的结果.本文着重介绍肿瘤浸润淋巴细胞的研究发展过程、体外分离培养、实验研究及在临床疗效观察等方面的研究进展.
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间充质干细胞诱导分化为血管内皮细胞的研究进展
间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)是一种起源于中胚层的成体干细胞,可以向所有中胚层来源的细胞及部分外胚层来源的细胞分化,且MSCs具有来源广泛、易于体外分离培养、免疫原性低,移植后无免疫排斥反应和易于基因转染等特点.血管内皮细胞属于中胚层细胞,MSCs可定向诱导分化为血管内皮细胞,在体外构建成理想的血管移植物,用于心脏组织工程瓣、血管组织工程以及再生医学领域.本文就间充质干细胞的生物学特性及诱导分化为内皮细胞的相关研究以及研究中存在的问题作一综述.
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MSCs对大鼠脊髓损伤修复的实验研究
目前治疗SCI的策略有两种:一是在损伤急性期通过减轻或消除继发性病理反应,保护残存的轴突和神经元不再遭受二次损伤,包括给予甲基强的松龙、钙通道拮抗剂、纳洛酮等药物,或予局部低温保护、人工高压灌流等;二是在损伤慢性期促进神经组织的再生和修复,包括手术治疗、移植雪旺细胞、基因治疗、高压氧治疗等.近来的研究显示,多种细胞移植方法可用于促进损伤脊髓再生修复,如:雪旺细胞、胚胎脊髓移植、嗅神经胶质细胞移植、胎胚干细胞、神经干细胞移植、活化巨噬细胞移植等,都显示出脊髓损伤部分缺失功能的修复.而MSCs特有的易于获取、体外分离培养可操作性强、免疫原性弱可用于异体移植等优点,在脊髓损伤的治疗及研究中占有重要地位.
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人视网膜色素上皮(RPE)细胞的体外纯化培养
视网膜色素上皮(RPE)和脉络膜毛细血管位于Brush's膜两侧,RPE细胞的紧密连接构成血-视网膜外屏障,且对排除废物和供给视网膜营养是必要的.RPE细胞的任何必要生理紊乱都对视网膜不利.RPE的功能之一就是通过产生神经营养的GF而营养支持视网膜,这些GF有神经生长因子(NGF)、脑源性生长因子(BDNF)和色素上皮源性生长因子(PEDF)等[1].已证实RPE功能的破坏会对视力造成威胁,如AMD、糖尿病视网膜病变和PVR[2].为进一步研究RPE在眼病发病中的作用以及探讨与其相关疾病的有效治疗方法,体外分离培养完整的RPE细胞避免其他细胞污染至关重要,本文对此进行研究探讨.
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某院389例女性生殖道炎症患者真菌感染的病原学特点和耐药情况分析
正常女性生殖道内的常驻菌群中真菌占很大比例,它们具有维持女性生殖道菌群平衡和生殖道自净的作用。当机体的抵抗力下降或正常菌群平衡遭到破坏时,真菌会在女性生殖道内大量生长繁殖,引起生殖道真菌感染,从而引发机体出现一系列炎性反应[1]。为了解本地区女性生殖道真菌感染的病原学特征和耐药情况,为临床用药提供依据,我们对389例生殖道炎症患者的阴道分泌物进行了真菌体外分离培养和药敏试验,现将结果报告如下。
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肠杆菌基因间重复共有序列与炎症性肠病患者肠道菌群的研究
18世纪初,van Leeuwenhoek用自制显微镜观察人类粪便,发现了大量肠道细菌,从此开始了肠道细菌的研究.1885年Pasteur提出了"高级动物如果肠道内没有细菌则无法生存"的学说.迄今为止,肠道细菌学仍是一个值得进行广泛、深入研究的领域.健康成人空腹时,小肠上部细菌数量较少,越接近远端小肠,细菌种类(如乳酸杆菌、葡萄球菌、双歧杆菌等)和数量越多.据微生物学家估计,肠道细菌种类约2700种,而目前能分离培养的仅约500种,也就是说肠道菌群的组成远比目前所知的复杂[1].微生物在炎症性肠病(IBD)发病中的作用一直受到重视,虽然至今尚未找到某一特异微生物病原与IBD恒定相关,但IBD患者粪便菌群的组成确与健康个体明显不同.由于多数肠道细菌不能分离培养,且体外分离培养细菌时,低速生长的细菌不能与较高速生长的细菌竞争,因此很难根据体外培养结果全面分析IBD与肠道微生物的关系.目前,IBD的研究集中于患者的免疫和遗传方面,有关患者肠道菌群结构变化的研究则未见报道.因此,有必要对IBD患者肠道菌群的变化进行探索性研究.
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不同来源血清体外培养骨髓间充质干细胞的研究
目的 适当的血清浓度可维持骨髓问充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)的体外培养,而不同来源的血清对BMSCs的培养效果是否小同.本研究探讨自体血清、脐带血清、AB血清、胎牛血清在体外培养人BMSCs的可行性.方法 Ficoll密度梯度离心法结合贴壁法分离纯化人BMSCs,在培养过程中分别加入白体血清、脐带血清、AB血清、胎牛血清,观察比较细胞形态、表面抗原、生长曲线及各组在诱导剂作用下表面抗原和诱导分化的相关性.结果 从BMSCs的形态学、生长曲线、表面抗原、诱导分化上看各组无明显差异,生长状况良好.结论 自体血清、脐带血清、AB血清、胎牛血清均可维持BMSCs的体外培养,而自体血清解决异种和异体血清带来的一些潜在的风险,更为安全.
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人胚中脑神经干细胞的体外分离培养及分化的研究
本文对人胚中脑神经干细胞体外分离培养及分化进行了初步研究,以期为神经干细胞临床应用提供实验依据.材料和方法一、原代中脑神经干细胞的分离培养:取胚龄10~13周水囊引产的新鲜人胚胎,在显微镜下无菌分离出胚胎中脑组织,剥除脑膜及表面血管,在PBS液中漂洗三次,用细吸管反复吹打组织碎块至完全散开,离心洗涤后吹打制成细胞悬液,经100目不锈钢滤网过滤,制成单细胞悬液,加入含B27(1∶50)(GibcoBRL)和EGF(Serotec.)20 ng/ml、bFGF(Chemicon)20 ng/ml的DMEM/F12(1∶1)(GibcoBRL)无血清培养基,台盼蓝染色计数活细胞,调整活细胞浓度为1×105/ml,将原代细胞种植于25平方厘米培养瓶(8 ml细胞悬液/瓶),37℃,5%CO2条件下静置培养.