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缝隙连接蛋白在钙离子介导的乳腺癌细胞转移和侵袭中的作用
目的 探讨缝隙接蛋白(Cx)在钙离子介导的乳腺癌细胞转移和侵袭中的作用. 方法 选用不影响细胞生长的缝隙连接蛋白阻断剂,辛醇100μmol/L处理高转移MDA-MB-231细胞和低转移MCF-7细胞.倒置相差显微镜下观察细胞形态,激光扫描共焦显微镜下观察Cx43的位置、微丝纤维的排列和细胞内钙离子浓度变化,划痕和侵袭实验观察细胞的转移情况. 结果 辛醇处理细胞后,细胞的生长状态由大面积片状生长转变为单个或少数几个团状的独立生长;Cx43蛋白的形成和表达位置虽无改变,但相邻细胞间微丝纤维排列的平行同向性显著性降低;MDA-MB-231细胞穿过基底膜成胶和Transwell小室基底面的细胞数显著低于对照组;此外,细胞内钙离子浓度强度显著性降低,钙离子螯合剂(EGTA)处理显著性加剧辛醇对细胞转移和侵袭能力的抑制.但是,上述现象在低转移MCF-7细胞中效果不明显.结论 缝隙连接蛋白阻断剂在干扰乳腺癌细胞Cx功能活性,而不影响Cx形成的情况下,能够显著性抑制高转移乳腺癌的恶性进展和侵袭转移,此机制与细胞内钙离子浓度降低有关.
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大鼠骨髓间充质干细胞的体外分离培养与多向分化鉴定
目的::建立体外分离、培养及纯化大鼠骨髓间充质干细胞( mesenchymal stem cells, MSCs)的方法,并对细胞进行形态学观察、表面标志物鉴定及分化潜能检测,为大鼠MSCs 进行细胞移植治疗脑损伤的研究奠定基础。方法:用全骨髓贴壁培养法分离、培养、纯化大鼠MSCs,倒置相差显微镜进行形态学观察,流式细胞仪检测细胞表面标记物,定向诱导向成脂、成骨方向分化。结果:72小时首次全量换液7天后观察可见呈放射状排列的细胞集落,以梭形细胞为主,细胞规则、生长旺盛,可连续传代10代以上;取3代MSCs流式细胞仪检测,CD90呈阳性表达,CD34、CD45均呈阴性表达;细胞传代后加入成脂、成骨诱导剂定向诱导分化,油红O染色及茜素红染色均呈阳性。结论:全骨髓贴壁筛选培养法可大量分离、纯化、扩增大鼠MSCs。经诱导鉴定MSCs 具有多项分化潜能。
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2-(3-羧基-1-丙酰氨基)-2-脱氧-D-葡萄糖诱导肝癌细胞凋亡的形态学变化
目的:探讨2-(3-羧基-1-丙酰氨基)-2-脱氧-D-葡萄糖诱导肝癌细胞株HepG2凋亡的可能性.方法:选用不同浓度的2-(3-羧基-l-丙酰氨基)-2-脱氧-D-葡萄糖与肝癌细胞株共同孵育不同时间后,应用倒置相差显微镜、荧光显微镜、透射电子显微镜对细胞生长状况及药物作用后细胞的形态进行观察.结果:经2-(3-羧基-1-丙酰氨基)-2-脱氧-D-葡萄糖作用24-72 h后,HepG2肝癌细胞株出现体积缩小,荧光染色增强,胞核或胞质中可见致密浓染的块状或颗粒状黄绿色荧光染色.染色质固缩,并凝结成块,聚集在核膜周边呈新月状或肾状,胞质浓缩,内质网疏松并与胞膜融合形成-个个空泡.且凋亡细胞含量呈一定的浓度、时间相关性.结论:2-(3-羧基-1-丙酰氨基)-2-脱氧-D-葡萄糖具有诱导HepG2细胞凋亡的作用.
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羟基磷灰石纳米粒子诱导人肝癌细胞凋亡模型的构建
目的:建立羟基磷灰石纳米粒子体外诱导人肝癌细胞凋亡的模型,为进一步研究纳米粒子诱导肝癌细胞凋亡的分子机制奠定基础.方法:用羟基磷灰石纳米粒子以不同终浓度、不同时间作用于人肝癌BEL-7402细胞,用细胞毒性实验(MTT比色法)观察其细胞毒性,倒置相差显微镜、荧光显微镜、透射电镜、DNA琼脂糖凝胶电泳等方法观察凋亡在形态学和生化方面的变化.流式细胞仪分析以进一步了解凋亡发生的时间和程度.结果:羟基磷灰石纳米粒子以剂量依赖和时间依赖的方式抑制BEL-7402细胞的生长.50-200mg/L的纳米粒子处理48h后,形态学上,肝癌细胞表现为细胞皱缩、核质浓缩、核碎裂、细胞起泡以及凋亡小体形成等凋亡特征.琼脂糖凝胶电泳观察到DNA"梯带".流式细胞仪定量分析,0,50、75、100、150、200mg/L浓度下凋亡率分别为2.2%,20.3%,25.3%,29.8%,45.1%和53.1%.50 mg/L作用12h后肝癌细胞出现凋亡,48h达高峰,12,24,36,48h细胞凋亡率分别为2.7%,3.5%,6.3%和21.4%.结论:羟基磷灰石纳米粒子既能抑制人肝癌BEL-7402细胞增生,又能诱导其凋亡,该凋亡模型的成功建立将有助于进一步探讨纳米粒子诱导肝癌细胞凋亡的分子机制.
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白花蛇舌草含药血清对人肺巨细胞癌细胞株PG细胞增殖的抑制作用
1 实验材料 白花蛇舌草(Herba Hedyotis Diffusae):购自济南市建联中药店,并由山东中医药大学药学院生药系石俊英教授鉴定.顺铂(DDP):齐鲁制药有限公司.人肺巨细胞癌细胞株PG细胞:由山东省医学科学院基础所提供.Wistar大鼠,雄性,体重200~240g,由山东中医药大学实验动物中心提供.全自动酶联免疫检测仪:深圳雷杜电子公司.倒置相差显微镜:美国AO.CO2培养箱,超低温冰箱.RPMI1640培养基:Gibco公司产品.小牛血清:杭州四季青生物材料研究所.二甲基亚砜(DMSO):Sigma公司产品.噻唑蓝(MTT):Sigma公司产品.
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地塞米松对成人成骨细胞增殖和分化影响的实验研究
[杨林,陶天遵,刘枫晨,等.中华骨科杂志,2001,21(8):493]目的研究地塞米松对体外培养的成人成骨细胞增殖和分化的影响 .方法取成人的髂骨松质骨,采用胶原-胰蛋白酶消化法,获得松质骨中的成骨细胞,进行纯化和培养.在此基础上,添加1×10-8mol/L的地塞米松, 连续加药3d,置入CO2孵箱中培养,同时作不加药的空白对照.通过倒置相差显微镜和电镜观察增殖和分化情况,检测上清液中的碱性磷酸酶和骨钙素含量,并且对成骨细胞的凋亡情况进行测定.结果胶原-胰蛋白酶消化法得到的成人成骨细胞,生长情况良好 ,生化指标稳定可靠,细胞纯化效果佳,可以满足相关研究的需要.进一步研究结果显示, 在地塞米松浓度为1×10-8mol/L,成骨细胞密度为10 000/ml的条件下,上清液中碱性磷酸酶和骨钙素含量明显增高,骨结节形成加速,与未加药的对照组比较差异均有非常显著性意义,同时成骨细胞的凋亡情况无明显变化.结论地塞米松对体外培养的成人成骨细胞的增殖和分化有明显的促进作用,可以作为促进骨形成的阳性对照应用于抗骨质疏松和筛选研究.
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人脐静脉内皮细胞原代培养方法的改进
目的 改进人脐静脉内皮细胞(HUVECs)原代培养方法,以获得足够数量的高纯度可传代内皮细胞.方法 胶原酶消化法分离培养内皮细胞,并加以改进.2.5×104 IU/L重组牛碱性成纤维细胞生长因子(rb-bFGF)加入完全培养液中.用形态学、免疫细胞化学染色法进行内皮细胞鉴定.观察含rb-bFGF的培养液对内皮细胞生长和形态结构的影响.观察原代细胞长满瓶底60%、70%和80%时传代后第1代细胞的生长情况.结果 HUVECs融合时呈单层铺路石样外观,95%以上细胞Ⅷ因子检测呈阳性.含2.5×104 IU/L rb-bFGF的完全培养液可将HUVECs传7代以上.第7代细胞长满瓶底80%所需时间延长,并出现异常细胞形态.原代细胞长满瓶底60%、70%和80%后传代,第1代细胞长满瓶底80%所需时间均为3d左右.结论 rb-bFGF可取代内皮细胞生长添加剂、内皮细胞生长因子等添加于培养液中,获得足够数量高纯度可传代的内皮细胞;原代细胞的传代时间可适当提前至长满瓶底60%~70%时.
关键词: 人脐静脉内皮细胞 细胞培养 碱性成纤维细胞生长因子 倒置相差显微镜 -
人脐静脉内皮细胞的体外改良分离、培养及鉴定
目的 建立一种改良的血管内皮细胞培养方案,为体外培养血管内皮细胞提供稳定而有效的实验方法.方法 在无菌条件下,应用输液延长管置入脐带并注入2/3容积的0.1%Ⅱ型胶原酶消化、分离人脐静脉内皮细胞.用倒置相差显微镜观察细胞生长,免疫细胞化学法鉴定培养细胞.结果 原代培养的细胞30min开始贴壁生长,24-48h生长快,3~5d呈铺路石样排列.免疫细胞化学可见培养细胞胞浆中人Ⅷ因子相关抗原呈阳性反应,证实培养的细胞为血管内皮细胞,且纯度达97.5%.结论 用本实验中的方法消化、分离血管内皮细胞可获得高纯度的内皮细胞,细胞数量多、污染少且成活率高.
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α1(Ⅰ)型前胶原基因反义寡聚脱氧核苷酸对瘢痕成纤维细胞的作用
1 对象与方法1.1 主要试剂及仪器α1(Ⅰ)型前胶原基因反义寡聚脱氧核苷酸(AODN,上海生工生物工程有限公司);阳离子脂质体LipofectAMINETM试剂(美国Gibco公司);即用型免疫组织化学试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司);倒置相差显微镜(上海宙山精密光学仪器有限公司);IBA 2.5型全自动图像分析系统(德国Kontron公司).