APOBEC3G抗HIV-1的分子机制研究进展

载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样蛋白3G(apolipoprotein B mRNA-editing enzyme catalytic polypeptide 3 protein G, APOBEC3G)属于固有免疫家族成员,具有胞嘧啶脱氨酶活性,在HIV-1复制过程中通过与HIV-1的Gag蛋白相互作用,选择性包装进入病毒毒粒.在HIV-1的逆转录过程中,APOBEC3G通过催化病毒负链cDNA中的dC脱氨为dU,在病毒基因组中引入广泛的超突变,从而发挥抗病毒作用.除了胞嘧啶脱氨机制外,APOBEC3G还能通过某些非脱氨机制抑制HIV-1的活性,但具体机制尚需深入研究.HIV-1编码的Vif蛋白可以通过泛素-蛋白酶体的降解途径来拮抗APOBEC3G的抗病毒活性.APOBEC3G具有广谱的抗病毒活性,可显著抑制多种逆转录病毒,逆转录转座子和乙型肝炎病毒(HBV)等的活性.上调APOBEC3G的表达水平或抑制Vif对APOBEC3G的拮抗可能成为治疗HIV-1感染的新的有效方法.

代谢组学技术的整合运用及其在中药现代化中的应用展望

代谢组学已经成为当今生物与医药领域的研究热点,作为系统生物学的核心组学,与其他组学进行的系统性研究为中药作用机制研究提供了思路和方法.质谱、核磁共振等现代分析技术作为代谢组学研究的技术平台,它们的整合运用加速了代谢组学的研究进程.本文就代谢组学技术的整合运用及研究现状作了简要的概述,并对代谢组学在中药现代化过程中的研究前景进行了展望.

作用于Bcl-2家族抗凋亡亚族蛋白的小分子抑制剂的研究进展

细胞的凋亡是维持机体平衡的重要因素.细胞凋亡由一系列细胞因子调控.Bcl-2蛋白家族是细胞凋亡的关键性调节因子.Bcl-2家族分为抗凋亡和促凋亡两个亚族,他们的相互作用对细胞凋亡信号传导起调控作用.很多肿瘤细胞高表达Bcl-2抗凋亡亚族成员Bcl-2/Bcl-xL.近年来,随着Bcl-2家族各成员的晶体结构相继阐明,人们开始寻找作用于Bcl-2家族抗凋亡亚族蛋白的小分子抑制剂.本文从药物设计角度对该方面的进展作一综述.

Exendin-4体外通过抑制NF-κB-iNOS-NO信号减轻氧化应激诱导的小鼠MIN6胰岛β细胞凋亡

探讨胰高血糖素样肽-1受体激动剂Exendin-4(Ex-4)在氧化损伤诱导胰岛β细胞凋亡中的保护作用.培养的MIN6胰岛β细胞,通过AO-EB染色观察细胞凋亡形态,Annexin-V-PI染色流式技术测定凋亡率,Griess法检测细胞内一氧化氮水平,Western blotting检测胞浆iNOS蛋白、胞浆及胞核核因子-κBp65(NF-κBp65)蛋白表达水平.Ex-4可抑制叔丁基过氧化氢(t-BHP)诱导的β细胞凋亡,Ex-4(100nmol·L-1)预处理较单独t-BHP处理,其凋亡率减少约67%(P<0.001).Ex-4同时减少NO水平的增高,并抑制t-BHP诱导的β细胞NF-κBp65活化及iNOS蛋白表达水平.Ex-4可能通过抑制细胞内NF-κB活化、胞浆iNOS表达来抑制NO水平,终减轻氧化损伤诱导的β细胞凋亡.

他克莫司在中国肾移植患者中的群体药物动力学研究

本研究旨在考察口服他克莫司(tacrolimus)在中国肾移植患者中的群体药物动力学特征并探讨群体药物动力学参数和相关因素间的关系.研究中回顾性搜集了58例肾移植患者的802份他克莫司稳态全血样本资料.患者随机分为模型建立组(41例)和模型验证组(17例).用非线性混合效应模型(NONMEM)程序中的一级评估法(first-order estimation, FO)对模型建立组的数据进行分析.计算清除率(CL/F)、表观分布容积(V/F)的群体典型值,定量评价人口统计学指标、生化指标和合并用药等固定效应因素对药物动力学参数的影响.单室一级吸收和消除模型能够较好地拟合数据.终模型包含了移植术后时间(POD)、红细胞压积(HCT)、谷草转氨酶(AST)、合并使用佩尔地平(NICA)和地尔硫草(DIL)等对CL/F的影响.用模型验证组数据进行验证的结果表明观测值和模型预测值之间没有明显的偏倚,模型的稳定性和准确度较好.CL/F和V/F的群体典型值分别为21.7L·h-1和241L;相应的个体间变异分别为41.6%和49.7%.观测值与预测值之间的残差SD为2.19μg·L-1.本文建立的模型可以为临床他克莫司剂量选择提供一定参考.

牛膝多糖硫酸酯体外和体内抗艾滋病病毒作用

牛膝多糖硫酸酯(Achyranthes bidentata polysaceharide sulfate, ABPS)为牛膝多糖经硫酸酯化修饰后获得的产物,其结构清楚,理化性质稳定及分子质量小,具有抗单纯疱疹病毒、柯萨奇病毒和乙型肝炎病毒等作用.本文研究其在体外和体内的抗艾滋病病毒1型(human immunodeficieney virus type 1,HIV-1)活性.体外采用3H掺入法和酶联免疫吸附法测定ABPS对HIV-1逆转录酶和整合酶的活性,其半数抑制浓度(50% inhibiting concentrations, IC50)分别为(2.948±0.556)μmol·L-1和(0.155±0.030)μmol-L-1,但25μmol·L-1ABPS对HIV-1蛋白酶无效.ABPS在MT-4细胞培养内对HIV-1实验病毒株ⅢB和在人外周血单核细胞培养内对AZT耐药病毒株的急性感染有较强的抑制作用,但在HIV-1 ⅢB慢性感染的H9细胞培养中则无效.血清药理学研究表明,单次腹腔注射大鼠ABPS 125mg·kg-1或连续腹腔注射小鼠ABPS 3mg·kg-1(qd×20)后鼠血清在MT-4细胞培养内对HIV-1 P24抗原都有抑制作用,但口服ABPS生物利用度低,灌胃大鼠ABPS 2g·kg-1或灌胃小鼠ABPS 300mg·kg-1无效.实验结果提示ABPS有抗HIV-1作用,有可能用于防治HIV-1感染,值得进一步研究.

甘草萜醇类共轭烯衍生物的合成及抗氧化活性

为优化甘草次酸(Ib)的抗氧化活性,对其化学结构进行修饰,通过还原和脱水反应制备了2个甘草萜醇类共轭烯衍生物.各化合物的抗氧化活性由肝微粒体中的细胞色素P450/NADPH氧化系统做体外抗氧化实验模型进行测定.微粒体中的自由基诱发情况由探针DCFH-DA的氧化程度进行检测,维生素E作为阳性对照物.初步的活性测定结果显示,甘草萜醇类两种同环和异环双烯衍生物--18β·olean-11,13(18)-diene-3β,30-diol(IV)和18β-olean-9(11).12-diene-3β,30-diol(v)显示出较强的抗氧化活性,以1.0mg·mL-1的浓度,分别抑制自由基活性为45%和41%.相同条件下,先导物Ib和维生素E分别抑制31%和32%的自由基活性.此结果显示,对先导物Ib的C11位羰基的脱去和C30位羧基进行还原修饰,可显著提高其抗氧化活性.

黄丝郁金中的生物碱和倍半萜类成分

姜科植物姜黄(Curcuma longa)的块根称为黄丝郁金,是常用中药郁金的来源之一.为了研究黄丝郁金的利胆活性成分,采用柱色谱法对姜黄干燥块根的化学成分进行了研究.本文主要报道从中分离得到的1个喹啉类生物碱2-(2'-methyl-1'-propenyl)-4, 6-dimethyl-7-hydroxyquinoline(1),7个没药烷型倍半萜2, 5-dihydroxybisabola-3, 10-diene(2), 4, 5-dihydroxybisabola-2, 10-diene(3), turmeronol A(4), bisacurone(5), bisacurone A(6), bisacurone B(7)和bisacurone C(8),以及dehydrozingerone(9)和zingerone(10)的分离和鉴定.化合物1为一个新的生物碱类化合物,化合物6～8为首次从姜黄中分得,化合物9～10为首次从姜黄属植物中分离得到.

消旋11-去甲胡桐素A的合成方法改进及其药理学评价

本文发展一个实用改进方法以合成具有抗人免疫缺陷病毒(HIV-1)的天然产物的类似物11-去甲胡桐素A[(±)-1],方法改进包括以间苯三酚为起始原料与正丁酰乙酸乙酯在饱和氯化氢甲醇存在下,经过Pechmann反应生成5,7-双羟基-4-正丙基香豆素(3),再与巴豆酸用多聚磷酸作溶剂及催化剂进行酰化,同时分子内环合得到收率为70%关键中间体苯并二氢吡喃酮(4),并与缩醛1,1-二乙氧基-3-甲基-2-丁烯用微波辅助催化得到苯并吡喃(6),后用Luche还原以CeCl3·7H2O作催化剂,在低温下经NaBH4选择性还原化合物(6)得到目标产物即消旋11-去甲胡桐素A(±)-1.上述4步反应总收率32%,比原方法提高1倍.体外研究表明(±)-1对HIV-1(野株)及耐药株均有明显抑制逆转录酶和P24抗原的活性,(±)-1在细胞培养内分别与作用机制不同的3种治疗艾滋病药物(AZT、T-20、Indinavir)都有明显的协同作用.小鼠急性毒性,(±)-1的LD50灌胃给药为735.65mg·kg-1,腹腔给药为525.10mg·kg-1.小鼠灌胃给与(±)-1血浆峰浓度(Cmax)与药时曲线面积AUC0-∞分别为0.54μg·mL-1及1.08(μg·mL-1)·h.为了初步观察(±)-1的体内药效,采用血清药理学方法,小鼠腹腔注射1次(±)-1或临床有效对照药奈韦拉平,30min和60min后血清有相似的抑制HIV-1逆转录酶活性.实验结果提示去甲11-胡桐素A值得进一步研究.

新型眼用阳离子微乳-原位凝胶的制备及其体外角膜滞留特性的研究

设计了新型眼用阳离子微乳-原位凝胶(cationic microemulsion-in situ gel, CM-ISG)系统,以维生素A棕榈酸酯(vitamin A palmitate, VAP)为模型药物研究了该释药系统的角膜滞留特性,并评价了角膜刺激性.采用外界供能法制备了VAP/CM,考察了维生素A棕榈酸酯阳离子微乳-原位凝胶(vitamin A cationic microemulsion-in situ gel, VAP/CM-ISG)胶凝前后的流变学性质,以及VAP/CM-ISG和市售品诺沛凝胶(Oculotect Gel)中VAP的体外释放和凝胶溶蚀情况;采用束缚泡法研究了VAP/CM-ISG和Oculotect Gel在离体角膜表面的滞留情况,Draize评分法评价了VAP/CM-ISG对兔角膜刺激性.透射电镜表明VAP/CM粒径分布均匀,加入poloxamer 407凝胶材料前后粒径无明显变化;加入VAP/CM后poloxamer 407溶液的胶凝温度下降了1.5℃,胶凝后系统的弹性模量增加了15.7倍;VAP/CM-ISG和Oculotect Gel中药物释放和凝胶溶蚀均呈现良好的零级释放特征.解吸附动力学研究发现,VAP/CM-ISG与Oculotect Gel相比,体外角膜滞留时间延长,且角膜接触角减小,具有良好的角膜铺展和滞留效果;兔角膜刺激性评价试验表明,制得的VAP/CM-ISG眼部生理相容性良好.VAP/CM-ISG能综合阳离子微乳和原位凝胶两种剂型的优点,改善药物在角膜表面的铺展性,提高角膜滞留,是一种具有良好应用前景的新型眼用释药系统.

氟尿苷二丁酸酯固体脂质纳米粒的制备和肝靶向性研究

采用薄膜-超声分散法制备氟尿苷二丁酸酯(FUDRB)固体脂质纳米粒(FUDRB-SLN)和半乳糖苷(G2)修饰的FUDRB-SLN(FUDRB-G2SLN).透射电镜研究其形态及粒径分布;凝胶色谱法测定载药量、包封率.结果表明,FUDRB-SLN和FUDRB-G2SLN的粒径分别为(137.5±11.1)nm和(95.0±10.7)nm,载药量分别为9.64%和8.56%,包封率分别为99.81%和96.23%.为比较其肝靶向作用,小鼠尾静脉给药后,HPLC法测定氟尿苷(FUDR)在血清及肝、肾、肺匀浆中的浓度,计算出FUDR-sol、FUDRB-SLN和FUDRB-G2SLN的肝靶向效率分别为2.56、5.90和8.28.FUDRB-G2SLN组480min时在肝脏中仍可检测到FUDR.这些结果说明FUDRB-SLN和FUDRB-G2SLN在小鼠体内具有良好的肝靶向性,G2修饰的SLN是一种良好的药物载体,可使药物选择性地导向肝细胞,且具有缓释作用.

多柔比星壳聚糖聚合物胶束的制备及其在小鼠体内的组织分布

本文制备了多柔比星壳聚糖聚合物胶束(doxorubicin-loaded N-octyl-N'-succinyl chitosan, DOX-OSC),研究其在小鼠体内的组织分布并进行靶向性评价.采用透析法制备DOX-OSC,以多柔比星注射液(doxorubicin for injection, DOX-INJ)为对照,小鼠分别尾静脉注射5mg·kg-1的DOX-OSC和DOX-INJ, HPLC法测定各组织中不同时间的药物量,以各组织药代动力学参数(AUC、MRT)和靶向参数(Re、Ce、Te)为靶向评价指标.DOX-OSC载药量为(35.8±0.4)%,包封产率为(75.3±1.1)%,粒径为(174±12)nm, zeta电位为(-37.1±3.0)mV,形态为球形结构.小鼠尾静脉注射DOX-OSC和DOX-INJ后,DOX-OSC表现出较好的长循环及缓释特性.与对照组比较,DOX-OSC具有肝和脾靶向特性及滞留特性,AUC分别提高20.0和47.4倍,MRT分别延长11.2和37.2倍;在心脏和肾脏中药物分布显著降低,AUC分别为对照组的17.0%和11.4%.结果表明DOX-OSC具有优良的载药性能,有利于肝和脾靶向,并能显著降低心脏和肾脏毒性,对于DOX的临床应用具有重要意义.

丹参柯巴基焦磷酸合酶基因的优化表达、纯化及抗体制备

用含丹参柯巴基焦磷酸合酶(Salvia miltiorrhiza copalyl diphosphate synthase, SmCPS)基因的重组质粒pET32CPS转化大肠杆菌BL21trxB(DE3)进行诱导表达,SDS-PAGE结果表明SmCPS基因在大肠杆菌中获得了表达;对影响可溶性表达的4个因素,即诱导温度、IPTG诱导浓度、诱导时宿主菌的密度(A600)和诱导时间进行了优化.结果发现在宿主菌A600达到1.0时加入0.4mmol·L-1 IPTG,在20℃诱导培养8h表达的可溶性蛋白量高,约占细胞总蛋白的35.6%.用Ni2+亲和色谱法纯化表达产物,纯化蛋白产率达到12.3mg·L-1.将纯化蛋白免疫制备兔源SmCPS抗血清,ELISA测定效价为1:24300,且经Western blotting鉴定该抗体可特异性识别SmCPS抗原,获得了效价高、免疫反应性好的SmCPS多克隆抗体,为进一步从蛋白水平研究SmCPS表达与丹参酮类有效成分生物合成相关性提供了物质基础.

液相色谱-串联质谱法研究重组水蛭素12肽与瑞替普酶融合蛋白(HV12p-rPA)的一级结构

利用液质联用研究重组水蛭素12肽与瑞替普酶融合蛋白(HV12p-rPA)的一级结构.采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)测定水蛭素12肽与瑞替普酶融合蛋白(HV12p-rPA)的相对分子质量;采用液质联用分别分析HV12p-rPA的胰蛋白酶(trypsin)和胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin)酶解产物.MALDI-TOF-MS测得HV12p-rPA的相对分子质量为41472Da,与理论值相符;HV12p-rPA的胰蛋白酶(trypsin)酶解产物进行液质联用分析结果表明该融合蛋白中含有瑞替普酶序列;HV12p-rPA的胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin)酶解产物进行液质联用分析,结果表明融合蛋白中含有水蛭素12肽,并检测出融合蛋白中的链接肽(DEGGGSY),融合蛋白的N末端MASDF和C末端LDWIRDNMRP;采用液质联用进行肽图分析,识别出的多肽匹配度Xcorr均超过1.5,部分多肽的Xcorr超过3.0,表明本实验测定过程中多肽识别结果准确可靠;目标蛋白的氨基酸序列覆盖率超过85%.结果确定了HV12p-rPA融合蛋白的序列与理论值相符.

当归的化学成分指纹图谱

比较不同产地的当归样品与市售药材之间的化学成分差异,为当归的质量控制提供参考.采用高效液相色谱法测定了16个不同产地的19份全归样品及28份市售药材(除6份全归,1份归头外,其余21份均为饮片)的指纹图谱,以阿魏酸为参照,鉴定12个共有峰.结果显示,当归饮片指纹图谱共有峰数目普遍较全归样品少,共有峰吸收值除峰11、12外,其余均较全归样品的共有峰吸收值低.结合系统聚类分析、相似度计算等方法对产地收集的当归样品和商品药材的指纹图谱进行评价比较,结果发现当归全归与饮片基本可以聚成两大类.全归(y-17、s-3、s-5及s-6除外)的相似度在0.973以上,饮片的相似度则在0.969以下,表明当归全归与饮片化学成分存在较大差异.本实验结果提示为保持药材成分的稳定,当归好以全归的形式流通,同时应该注意当归的贮藏方式及年限.

柱前衍生-高效液相色谱荧光法测定大鼠血浆中硫普罗宁

建立了测定大鼠血浆中硫普罗宁含量的柱前衍生-高效液相色谱荧光法.血浆样品经二硫苏糖醇(DTT)还原后,再经N-(1-芘)马来酰亚胺(NPM)衍生化后进样测定.以0.2%乙酸(含0.015mol·L-1磷酸二氢钾)-乙腈(56:44)为流动相,采用Kromasil C18色谱柱分离,在λex=340nm,λem=375nm下荧光检测.硫普罗宁线性范围0.1～10.0μg·mL-1,定量下限为0.1 mg·L-1,日内、日间精密度(RSD)分别为5.3%～10.8%和7.0%～10.8%,提取回收率在73.7%～79.7%.大鼠单剂量给予硫普罗宁后,药代动力学行为符合二室模型.该法准确可靠,专属性强,适用于硫普罗宁的药代动力学研究.

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