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Exendin-4体外通过抑制NF-κB-iNOS-NO信号减轻氧化应激诱导的小鼠MIN6胰岛β细胞凋亡
探讨胰高血糖素样肽-1受体激动剂Exendin-4(Ex-4)在氧化损伤诱导胰岛β细胞凋亡中的保护作用.培养的MIN6胰岛β细胞,通过AO-EB染色观察细胞凋亡形态,Annexin-V-PI染色流式技术测定凋亡率,Griess法检测细胞内一氧化氮水平,Western blotting检测胞浆iNOS蛋白、胞浆及胞核核因子-κBp65(NF-κBp65)蛋白表达水平.Ex-4可抑制叔丁基过氧化氢(t-BHP)诱导的β细胞凋亡,Ex-4(100nmol·L-1)预处理较单独t-BHP处理,其凋亡率减少约67%(P<0.001).Ex-4同时减少NO水平的增高,并抑制t-BHP诱导的β细胞NF-κBp65活化及iNOS蛋白表达水平.Ex-4可能通过抑制细胞内NF-κB活化、胞浆iNOS表达来抑制NO水平,终减轻氧化损伤诱导的β细胞凋亡.
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叔丁基过氧化氢诱导小梁网细胞氧化应激模型的建立
目的 体外建立叔丁基过氧化氢小梁网细胞氧化应激模型.方法 应用tBHP刺激体外培养的小梁网细胞(iHTM)后,观察小梁网细胞形态学的改变,分别用MTT法检测氧化损伤后小梁细胞的活性,流式细胞术检测活性氧水平,Suc-LLVY-荧光底物检测糜蛋白酶样蛋白酶体的活性,流式细胞术和激光共聚焦显微镜检测小梁细胞的凋亡.结果 正常培养的小梁细胞呈梭形,折光性好,贴壁较牢;应用tBHP刺激后,部分细胞变圆、脱落、皱缩,小梁细胞的细胞活性明显下降,活性氧水平升高,糜蛋白酶样蛋白酶体活性降低,细胞凋亡水平明显增加.随着刺激时间的延长,上述改变更为明显.结论 tBHP刺激后,小梁网细胞出现典型的氧化应激改变,tBHP刺激小梁网模型的建立可应用于青光眼氧化应激的研究.
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叔丁基过氧化氢体外诱导鼠系膜细胞衰老及普罗布考对其影响的研究
目的 探讨叔丁基过氧化氢体外诱导鼠肾小球系膜细胞衰老及普罗布考延缓衰老的作用.方法 应用不同浓度叔丁基过氧化氢刺激鼠系膜细胞,每天刺激1 h,连续作用4 d.刺激结束后48 h检测细胞存活率、β-半乳糖苷酶染色阳性细胞率、细胞周期情况鉴定衰老细胞,并透射电镜观察衰老细胞超微结构,并观察普罗布考对上述指标的影响.结果 30μmol/L叔丁基过氧化氢诱导组细胞存活率为对照组的(80.12±3.25)%(P<0.05),约81%的细胞呈现β-半乳糖苷酶染色阳性,流式细胞仪检测86%细胞阻滞于G0、G1期,透射电镜可见叔丁基过氧化氢诱导组细胞核膜内陷,染色质凝聚.应用普罗布考后细胞存活率为对照组的(92.68±5.03)%,β-半乳糖苷酶染色阳性率降至45.2%,细胞周期各期比例接近正常,细胞形态及超微结构改变减轻.结论 叔丁基过氧化氢可诱导体外培养的鼠肾小球系膜细胞发生衰老,应用普罗布考可以延缓衰老.
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降脂酮对胰岛素抵抗大鼠肝损伤的保护作用
目的 观察降脂酮对胰岛素抵抗大鼠肝病理损伤的保护作用. 方法 将15只大鼠随机分成2组,即正常对照组5只、双高加tBHP(HF+ tBHP)组10只.正常对照组,正常饲料喂养,5-6周隔天腹腔注射生理盐水.HF+ tBHP组,高脂高果糖饲料喂养,5-6周隔天腹腔注射tBHP.第6周末,将HF+ tBHP组随机分成两组:模型组5只,降脂酮组5只.模型组,双高饮食+tBHP,生理盐水灌胃;降脂酮组,双高饮食*BHP,降脂酮200 mg/kg灌胃.6周末,测定空腹血糖、血清胰岛素含量、胰岛素敏感指数.12周末,处死大鼠,腹主动脉取血,分离血清,测定大鼠ALT和AST.取肝脏作HE染色石蜡切片和制作电镜切片. 结果 与对照组比较,模型组空腹血糖升高(P＜0.05),血清胰岛素含量降低(P＜0.05),胰岛素敏感指数降低(P＜0.05).降脂酮治疗后,光镜下观察肝细胞排列整齐,肿胀减轻;电镜下观察肝脏线粒体肿胀减轻,内质网扩张不明显.大鼠血清中ALT和AST的活性显著降低(P＜0.05). 结论 降脂酮能够保护高脂高果糖饮食加腹腔注射tBHP诱导的胰岛素抵抗大鼠的肝损伤.
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五味子水提取液延缓叔丁基过氧化氢导致的SH-SYSY细胞衰老研究
目的:探讨五味子水提取液(SWE)对叔丁基过氧化氢(t-BHP)诱导的人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞衰老的保护作用并探讨其机制.方法:将SH-SY5Y细胞分为正常组、模型组(叔丁基过氧化氢100μmol·L-1孵育12h)和给药组(衰老处理后加不同浓度SWE);MTT法检测各组神经细胞的活力,检测乳酸脱氢酶释放量,RT-PCR法检测各组SH-SY5Y细胞中p53和p21 mRNA的表达结果:与正常组比较,用不同浓度的t-BHP处理的SH-SY5Y细胞存活能力显著降低,并得到t-BHP诱导SH-SY5Y细胞衰老的适条件为100 μmol/L孵育12h与模型组比较,给予不同浓度的SWE能显著提高t-BHP损伤细胞的存活率,改善受损SH-SY5Y细胞的形态,降低LDH的释放量.给药组SH-SY5Y细胞的活力较模型组显著增强(P＜0.01);LDH释放量显著降低(P＜0.01);p53和p21 mRNA的表达明显降低(P＜0.01),以500μg/mL效果好结论:SWE对t-BHP诱导的SH-SY5Y细胞衰老有明显的神经保护作用,这可能与抑制了p53-p21通路有关.
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五味子水提取液对叔丁基过氧化氢诱导神经元衰老保护作用
目的:探讨五味子水提取液(SWE)对叔丁基过氧化氢诱导的神经元衰老的保护作用并探讨其机制.方法:将原代培养的小鼠皮层神经元培养14d后,分为正常组、模型组(叔丁基过氧化氢100μmol·L-1孵育6h)和给药组(衰老处理前加不同浓度SWE);MTT法检测各组神经细胞的活力;硫代巴比妥酸检测丙二醛含量;黄嘌呤氧化酶法检测超氧化物歧化酶活性;RT-PCR法检测各组皮层神经元中p53和p21 mRNA的表达.结果:给药组小鼠皮层神经元的活力和SOD活性较模型组显著增强(P＜0.01);MDA含量显著降低(P＜0.01);p53和p21 mRNA的表达明显升高(P＜0.01),以750μg/mL效果好.结论:SWE对叔丁基过氧化氢诱导的小鼠皮层神经元衰老有明显的神经保护作用,这可能与抑制了p53-p21通路有关.
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低浓度叔丁基过氧化氢对小鼠胚肺成纤维细胞L929增殖作用的影响
目的 通过不同浓度的叔丁基过氧化氢(Tert-Butyl bydroperoxide,TBHP)作用于培养的小鼠胚肺成纤维细胞系L929细胞,观察低浓度的TBHP对细胞生长、增殖的影响.方法 按TBHP的终浓度从低到高分别为:空白组(0μmol/L)、低浓度组(1 μmol/L)、中浓度组(10 μmol/L)和高浓度组(40μmol/L)分成四组.通过破壁灵芝孢子粉水提液(2.0 g/L)作用L929细胞系24 h,使细胞同步化,分别加入相应浓度的TBHP溶液.用MTT比色法检测细胞活力,并以溴脱氧尿嘧啶核苷(bromodeoxyuridine,BrdU)的免疫荧光染色法观察各组细胞的增殖变化,同时在相差显微镜下观察细胞的形态学变化.结果 镜下观察发现,TBHP 1μmol/L组细胞密度高于空白组和中、高浓度组.且BrdU阳性细胞数目多,细胞生长旺盛;MTT结果 显示TBHP1μmol/L组OD值高,其次为空白组和中浓度组,高浓度组低(P＜0.01),BrdU阳性荧光显色主要在刚刚分裂完成的细胞,呈现"镜像性"改变.结论 低浓度TBHP对体外培养L929细胞的增殖、生长具有一定促进作用,BrdU阳性荧光显色细胞的"镜像性"改变是反映细胞增殖活性的有效判定指标.
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木犀草素减轻氧化应激引起的血管内皮损伤
目的:探讨木犀草素对叔丁基过氧化氢致血管内皮损伤的保护作用及相关机制.方法:首先通过制备大鼠胸主动脉环,观察木犀草素对叔丁基过氧化氢所致血管张力变化的影响;再采用叔丁基过氧化氢诱导血管内皮细胞氧化损伤模型,观察木犀草素对其细胞形态学变化及细胞活力的影响,并用RT-PCR检测eNOS和COX-1 mRNA的含量变化.结果:木犀草素能够浓度依赖性地对抗叔丁基过氧化氢导致的血管舒张功能损伤及细胞损伤作用,且浓度依赖性地减弱叔丁基过氧化氢对内皮细胞eNOS mRN A表达抑制的影响.结论:木犀草素是一种有效的舒血管物质,它可以起到抗氧化的作用,减轻氧化应激反应,并可能通过维持eNOS活性等血管内皮途径舒张血管.
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虎奶菇多糖纳米硒对叔丁基过氧化氢诱导的HepG2细胞氧化损伤的保护作用
目的 观察虎奶菇多糖纳米硒(PTR-SeNPs)对叔丁基过氧化氢(t-BHP)诱导的HepG2细胞氧化损伤的保护作用. 方法 不同给药浓度的PTR-SeNPs作用24 h,5μmol/L的t-BHP作用HepG2细胞1h,建立细胞氧化应激损伤模型,用MTT法检测细胞活力. 结果 10-1～10-4 μmol/L的PTR-SeNPs能显著改善t-BHP对HepG2细胞细胞增殖的抑制作用. 结论 PTR-SeNPs对HepG2细胞氧化损伤具有明显的保护作用.
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苦菊提取物的肝保护作用研究
目的 研究苦菊提取物在体内外的肝保护作用.方法 苦菊经95％乙醇加热回流、石油醚脱脂、乙酸乙酯提取、大孔树脂20％乙醇洗脱获得提取物.通过检测其对HepG2细胞的氧化损伤模型及氧化剂叔丁基过氧化氢(tert-buty1hydroperoxide,t-BHP)诱导的体内小鼠肝损伤模型的影响,评价其对肝脏的保护作用.结果 苦菊提取物能够有效抑制细胞氧化损伤导致的死亡,对细胞产生的炎症因子也有很好的抑制作用.体内试验结果表明,该提取物也对t-BHP诱导的小鼠肝损伤有一定的保护作用.结论 体外和体内试验均表明,苦菊提取物具有很好的肝保护作用,可作为食品和药品进行开发利用.
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短链酰基辅酶 A 脱氢酶在心肌细胞凋亡中的作用
目的：研究短链酰基辅酶A脱氢酶（ short－chain acyl－CoA dehydrogenase ， SCAD）在心肌细胞凋亡中的变化，探讨其与心肌细胞凋亡之间的关系。方法：以叔丁基过氧化氢（ tert－butyl hydroperoxide ， tBHP）刺激心肌细胞建立凋亡模型。检测细胞存活率、SCAD mRNA和蛋白表达、SCAD活性以及游离脂肪酸含量变化；并采用SCAD的优干扰序列siRNA－1186进行干扰，观察其对心肌细胞凋亡的影响。结果：与对照组相比，在tBHP诱导的心肌细胞凋亡模型中，SCAD的mRNA和蛋白表达均显著下调。与阴性对照序列组相比，siRNA－1186干扰后心肌细胞的SCAD表达和活性明显下降，心肌细胞游离脂肪酸含量明显增加，同时，心肌细胞出现了明显凋亡，与tBHP诱导的心肌细胞凋亡趋势一致。结论：SCAD表达失调可能参与心肌细胞凋亡的过程，上调SCAD可能成为干预心肌细胞凋亡的重要环节之一。
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柯里拉京对叔丁基过氧化氢损伤N9细胞的保护作用
目的:研究柯里拉京对活性氧诱导小鼠小胶质细胞N9氧化损伤的保护作用.方法:以叔丁基过氧化氢(tert-butyl hydmperoxide,t-BHP,0.6 mM)孵育24 h损伤N9细胞建立活性氧氧化应激模型;以柯里拉京(0.5～4 μM)预孵育24 h进行干预,通过光镜观察细胞形态差异,MTT法检测细胞活力,罗丹明123染色法检测细胞线粒体膜电位(mitochonrial membrane potentials,MMP),硫代巴比妥酸法测定丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量等观察柯里拉京预处理的保护作用.结果:与氧化损伤模型组比较,柯里拉京预处理能明显提高t-BHP诱导损伤的N9细胞活力,改善损伤的N9细胞形态,显著抑制t-BHP引起的MMP降低和MDA升高.结论:柯里拉京能够抑制活性氧对N9细胞的氧化损伤,其保护作用可能与其抑制氧化应激引起线粒体功能损伤有关.
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叔丁基过氧化氢诱导人正常肝细胞系L02自噬模型的建立及其线粒体应激机制
目的:建立叔丁基过氧化氧(t-BHP)诱导的人正常肝细胞系L02自噬模型并探讨其中的线粒体应激机制.方法:体外培养L02细胞,用不同浓度(100、200、400、800、1000μmol/L)t-BHP及线粒体靶向抗氧化剂MitoQ或p38/MAPK特异性抑制剂SB203580进行处理,采用免疫荧光和Western blot检测自噬标志蛋白LC3-Ⅱ和p62蛋白水平,以及p38/MAPK信号通路的激活情况;Mito-SOXRed染色流式法检测细胞线粒体活性氧(ROS)水平.结果:免疫荧光结果显示t-BHP剂量≥800 μmol/L时可明显诱导L02细胞内LC3-Ⅱ发生聚集.Western blot结果显示,与对照组比较,800和1 000 μmol/L t-BHP处理可显著增加LC3-Ⅱ蛋白水平,并降低p62蛋白水平(P均＜0.05).同时线粒体ROS水平在≥400 μmol/L t-BHP处理后明显升高,在1000μmol/L t-BHP处理后p38蛋白磷酸化水平显著增加(P均＜0.05).给予线粒体靶向抗氧化剂MitoQ或p38/MAPK特异性抑制剂SB203580预处理后可有效拮抗t-BHP(1000μmol/L)处理引起的LC3-Ⅱ和p62蛋白水平改变.结论:我们成功建立了t-BHP诱导体外培养人正常肝细胞系L02的自噬模型,证明线粒体ROS介导了此过程的发生,同时p38/MAPK通路在此过程中发挥了重要作用.
