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激光扫描共聚焦显微镜研究APOBEC3G蛋白的亚细胞定位
采用RT-PCR技术,从HIV的非允许性H9细胞中获得载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样蛋白3G(APOBEC3G)的全长cDNA.APOBEC3G cDNA全长1 155nt,编码384个氨基酸.将APOBEC3G克隆到真核表达载体pEGFP-C3上,转染CD4+ HeLa细胞,激光扫描共聚焦显微镜下可观察到表达的GFP-APOBEC3G融合蛋白定位于细胞质.
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HIV-1病毒感染因子基因克隆、表达、纯化及其抗体制备的研究
目的 制备HIV-1病毒感染因子(Vif)及其抗体.方法 用PCR技术从HIV-1 NL4.3cDNA质粒中扩增病毒感染因子(vif)基因,vif基因全长为579 nt(核苷酸),翻译成含192个氨基酸的蛋白质.将测序鉴定过的vif基因克隆到原核表达载体pET-32a上,以包涵体的形式在大肠埃希菌BL21(DE3)中高效表达,Vif蛋白C端融合6×His标签便于纯化及鉴定.应用酶切鉴定、SDS-PAGE及Western Blot等方法确保基因片段的正确性及表达蛋白的特异性.间接ELISA法测定兔多克隆抗体滴度.结果 成功地获得了高纯度的Vif融合蛋白,纯度可达80%以上.用其制备多克隆抗体滴度可达1:204 800.结论 获得高纯度的Vif融合蛋白及其高效价的抗体.
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APOBEC3G抗HIV-1的分子机制研究进展
载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样蛋白3G(apolipoprotein B mRNA-editing enzyme catalytic polypeptide 3 protein G, APOBEC3G)属于固有免疫家族成员,具有胞嘧啶脱氨酶活性,在HIV-1复制过程中通过与HIV-1的Gag蛋白相互作用,选择性包装进入病毒毒粒.在HIV-1的逆转录过程中,APOBEC3G通过催化病毒负链cDNA中的dC脱氨为dU,在病毒基因组中引入广泛的超突变,从而发挥抗病毒作用.除了胞嘧啶脱氨机制外,APOBEC3G还能通过某些非脱氨机制抑制HIV-1的活性,但具体机制尚需深入研究.HIV-1编码的Vif蛋白可以通过泛素-蛋白酶体的降解途径来拮抗APOBEC3G的抗病毒活性.APOBEC3G具有广谱的抗病毒活性,可显著抑制多种逆转录病毒,逆转录转座子和乙型肝炎病毒(HBV)等的活性.上调APOBEC3G的表达水平或抑制Vif对APOBEC3G的拮抗可能成为治疗HIV-1感染的新的有效方法.
关键词： APOBEC3G 人类免疫缺陷病毒1型 胞嘧啶脱氨 病毒感染因子 泛素化 -
N-苯基苯甲酰胺衍生物的设计合成及抗HIV-1活性研究
目的 设计合成HIV-1病毒感染因子(Vif)抑制剂RN-18的衍生物并测试其抗HIV-1活性.方法 以RN-18为先导化合物,针对其两个支链及中间苯环设计合成衍生物,以p24含量来检测化合物抑制HIV-1的增殖活性,后通过MTT法评价抗病毒效果较好化合物的细胞毒性.结果 共合成得到28个RN-18衍生物,结构经MS、NMR表征.活性测试表明,7个化合物抗HIV-1活性较RN-18更为显著,其中化合物26的活性提升了11倍以上,EC50值达到了21.8 μmol·L-1.结论 将RN-18的苯环替换为杂环可普遍提高抗HIV-1活性,为该类化合物的进一步优化指明了方向.
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APOBEC3G对HIV-1及其Vif缺失株的抑制作用
目的 研究细胞内在抗病毒因子APOBEC3G对HIV-1及其Vif缺失株的抑制作用.方法 HIV-1野生株病毒(BH10 WT)和Vif缺失株病毒(BH10 ΔVif)分别由转染293T细胞获得,通过感染MT4和H9细胞,分别检测其反转录酶活性.用分子克隆技术构建APOBEC3G与绿色荧光蛋白融合表达的质粒pEGFP-3G.HIV-1野生株和Vif缺失株质粒与不同剂量的pEGFP-3G共转染293T细胞,APOBEC3G-GFP在细胞内融合表达定位通过荧光显微镜观察.所生成的子代病毒粒子的感染力分别由MAGI检测和反转录酶活性检测方法 定量.结果 BH10 WT病毒在H9细胞和MT4细胞中均有所复制,在感染MT4细胞后4 d已经具有较高的反转录酶活性.BH10 ΔVif病毒感染H9细胞产生的子代病毒的反转录酶活性接近细胞对照水平,而其在MT4细胞中产生的子代病毒的反转录酶活性在感染后12 d有所显现,即非允许性H9细胞内APOBEC3G对ΔVif病毒株具有很强的抑制作用.与绿色荧光蛋白融合表达的APOBEC3G蛋白定位于细胞质.BH10 ΔVif转染293T细胞后生成的病毒滴度为2.75×104 U/mL,随着pEGFP-3G共转染量的升高,所产生的子代病毒滴度从1.48×103 U/mL显著降至0.33×103 U/mL.与0.2 μg质粒pEGFP-3G共转染产生的BH10 ΔVif病毒的感染力比不表达APOBEC3G的相同病毒的感染力降低近20倍.结论 APOBEC3G具有抗HIV活性,同时HIV Vif在病毒复制过程中发挥关键作用,两者之间相互作用的量效关系为我们构建抗病毒药物筛选平台奠定了可靠的实验基础.
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人类抗病毒因子APOBEC3H的研究进展
人类22号染色体编码了7个具有抗反转录病毒和抗反转录元件功能的胞嘧啶脱氨酶,可以使病毒反转录过程中产生的负链DNA上的胞嘧啶脱氨基变成尿嘧啶,导致正链DNA上出现G→A的突变,即APOBEC3.APOBEC3都有一个或两个催化域,而每个催化域都有保守基序HX1 EX23-24 CX2-4C.APOBEC3H是唯一一个含有Z3 APOBEC脱氨酶域的蛋白.在外周单核细胞,肝脏、皮肤等不同组织均已检测到APOBE3H的单倍型,包括Hap Ⅰ、HapⅡ、HapⅢ、HapⅣ、HapV、HapⅥ和HapⅦ.不同的APOBEC3H单倍型具有不同的抗病毒功能.APOBEC3H可显著地抑制HIV-1的复制,优化APOBEC3H的体内表达水平,可成为一种治疗HIV-1的新对策.
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机体的天然病毒屏障——APOBEC3G
APOBEC3G(载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样蛋白3G)是宿主体内一种新颖的抗病毒因子,它可以使HIV在逆转录过程中脱氨基化,产生G→A的超突变,从而降低病毒活性,而这种抗病毒功能,又能被Vif蛋白所抵消.APOBEC3G属于APOBEC家族,其家族的其他成员均可起到抗病毒作用,且可作用于HIV以外的其他病毒.因而APOBEC3G等分子抗病毒活性的研究,对未来病毒的实验室研究和临床治疗均有着重要的意义和价值.
