中华实验外科杂志
Chinese Journal of Experimental Surgery 중화실험외과잡지
- 主管单位： 中国科学技术协会
- 主办单位： 中华医学会
- 影响因子： 0.75
- 审稿时间： 1-3个月
- 国际刊号： 1001-9030
- 国内刊号： 42-1213/R
- 论文标题 期刊级别 审稿状态
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原发性肝细胞癌分化程度与诱生型一氧化氮合酶表达的关系
我们采用免疫组织化学的方法检测诱生型一氧化氮合酶 (iNOS) 在原发性肝细胞癌(HCC)及癌旁组织(PCHT)中的表达，探讨其与HCC临床病理资料的相关性，观察一氧化氮(NO)在HCC发生、发展中的作用，现将结果报道如下。 一、对象与方法 1.标本：随机取我院1996～1999年手术切除的肝脏标本共50例，HBsAg均为阳性患者，术后病理证实均为HCC，其中30例有PCHT。取肝破裂伤患者肝组织8例为正常对照。将HCC标本按Edmondson's标准分级。iNOS免疫组织化学染色按ABC法操作。同时设置空白对照和阴性对照。 2.结果判定：iNOS免疫组织化学染色以细胞膜/浆内出现棕黄色颗粒为阳性，染色结果综合染色强度及阳性细胞数量两个方面进行半定量分析，分别评分0～3分。染色强度：阴性为0分；浅黄色但明显高于阴性对照为1分；棕黄色为2分；棕褐色为3分。阳性细胞数≤1/ 3为1分；1/3～2/3为2分；≥2/3为3分。根据两项指标相加分数划分为4级：0～1分为“-”；2分为“+”；3～4分为“”；5～6分为“”。 3.统计学处理：HCC和PCHT的iNOS表达程度比较采用两样本比较的秩和检验。HCC各级间采用多个样本比较的秩和检验并在此基础上做多个样本间的两两比较的秩和检验。 二、结果 iNOS广泛存在于正常肝细胞、PCHT细胞、枯否氏细胞及HCC部分细胞中。在正常肝组织和肝硬化组织中iNOS为细颗粒均质性表达于胞浆中，细胞膜上偶见，前者为弱表达，后者为强表达，胞核内及间质细胞内无iNOS表达。在HCC细胞中iNOS的表达差异较大，从弱至强均可见到，部分癌细胞中甚至无表达，iNOS以细或粗颗粒状存在。HCC和PCHT中iNOS的表达差异有非常显著性(P＜0.01)，即前者明显低于后者(表1)。Edmondson's分级中 Ⅰ级HCC中iNOS表达明显高于其他3级，且差异均有非常显著性(P＜0.01)，在Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ 3级iNOS表达差异无显著性(P＞0.05，表2)。 三、讨论 本研究结果显示，在正常肝组织中，iNOS的表达为弱阳性，说明iNOS催化产生的NO与肝脏的正常生理功能有关。HCC中iNOS的表达较PCHT中的表达为低，两者差异有显著性。有研究证明肿瘤组织中NO产生的大量有一个平台期，这时机体对肿瘤的免疫力强，平台期之后，随着NO产生量的下降，机体对肿瘤的免疫能力随之崩溃，肿瘤则发生转移和扩散［1］。以上观点与临床所见的小肝癌多有包膜，而未发生肝内转移前生长较慢，而一旦包膜被浸润，发生肝内转移后生长明显增快的现象相符。而不同分级的肝癌组织中iNOS 表达水平不同也可能和游离的HBsAg有关。 PCHT和Ⅰ级HCC中HBV与宿主DNA整合较少，故游离的HBs Ag浓度高，iNOS的表达强，NO产生多，从而抑制了肿瘤细胞的发生、发展。在Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ级 HCC中，由于游离的乙肝病毒(HBV)较少，而细胞表型和基因型的突变机率高(包括iNOS基因) 。iNOS的表达弱，NO的产生较少，对HCC的抑制减弱，故HCC的恶性程度高，生长较快。已知 NO对细胞的生长具双向的生物效应，即低浓度时能够抵抗氧化损伤，从而保护肿瘤细胞。但当NO浓度提高时能够增强其对细胞的杀伤作用［2,3］，与本研究中Ⅰ级HCC中iNOS表达强、生长慢，其他3级中iNOS表达弱而生长较快相符合。本研究结果提示，NO可能是机体抗肝癌免疫的组成部分，正确诱导iNOS，合理利用其催化产物NO将对肝癌的治疗有一定的帮助。
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风湿性心脏病肺动脉高压患者肺组织肾上腺髓质素受体mRNA的变化
肾上腺髓质素是一种内源性神经肽，它参与了肺动脉高压的形成［1］，其作用机制之一是通过特异性受体发挥扩血管作用。我们采用印迹杂交(Northern blot)法检测风湿性心病肺动脉高压患者肺组织肾上腺髓质素受体(AM-R)mRNA的表达，以期探讨肾上腺髓质素在肺动脉高压中的作用机制。 一、材料和方法 1.标本来源：风湿性心脏病患者右肺组织18例，其中男11例，女7例，平均年龄31.7岁。根据平均肺动脉压分为3组［2］，每组6例：平均肺动脉压＜2.80 kPa(1 kPa=7.5 mm Hg)为肺动脉压正常组；2.80～5.33 kPa为肺动脉高压组；＞5.33 kPa为严重肺动脉高压组。正常对照组为无心肺疾病的患者右肺组织5例。 2.探针：人AM-R cDNA探针 (美国 Montuenga 博士惠赠)。 3.方法：(1)肺组织总RNA提取：采用异硫氰酸胍一步法。(2)RNA甲醛变性：取20 μg RN A，加入1×电泳缓冲液、体积分数为17.5%甲醛和50.0%甲酰胺，65 ℃水浴20 min，冰浴2 min。(3)RNA电泳：在质量分数为1%甲醛凝胶、1×电泳缓冲液中80 V预电泳5 min，65 V恒压电泳2 h左右。(4)转膜：采用真空转印仪，20×标准柠檬酸盐中负压400 MPa持续转印0.5 h。(5)Northern blot分析：将尼龙膜放入杂交炉中，55 ℃，转速12 r/min，预杂交4～6 h。再将用α-32P 3-磷酸核糖腺嘌啉标记好的AM-R cDNA探针，加入杂交管中，相同条件下杂交24～36 h。(6)杂交信号的密度扫描：放射自显影后，X光片经显影、定影、水洗、室温下凉干用计算机图像分析仪扫描分析，将各点杂交信号做面积和灰度测定，然后用同一样品3-磷酸甘油醛脱氢酶的杂交信号值做校正，即：AM-R mRNA(%) = (AM-R杂交信号面积×AM-R杂交信号灰度值)/(3-磷酸甘油醛脱氢酶杂交信号面积×杂交信号灰度值)×100%。 4.统计学方法：数据以均数±标准差(****±s)表示，进行方差分析。 二、结果 严重肺动脉高压组、肺动脉高压组、肺动脉压正常组肺组织AM-R mRNA分别为(76.00±1 1.50)%、(97.26±5.79)%、(105.41±12.24)%，合并肺动脉高压组 AM-R mRNA表达明显低于正常对照组(119.31±16.29)%(P＜0.05)，肺动脉压正常组 AM-R mRNA表达与正常对照组差异无显著性(P＞0.05)，严重肺动脉高压组AM-R mRN A表达明显低于肺动脉压正常组(P＜0.05)。
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外源性胃泌素在胃癌细胞增殖和凋亡中的作用
我们应用MKN45胃癌细胞株通过四唑蓝(MTT)比色分析法及流式细胞仪观察胃泌素在细胞增殖、凋亡中的作用，同时观察丙谷胺对胃泌素的拮抗作用，并与5-氟尿嘧啶(5-Fu)作比较，结果报道如下。 一、材料与方法 1.细胞培养：MKN45胃癌细胞株(上海市消化疾病研究所提供)培养于RPMI 1640培养液中，加入体积分数为10%小牛血清，置37 ℃5%CO2恒温培养箱，隔天换液，3 d传代。 2.试剂配制及实验分组：用5%的小牛血清的1640液将胃泌素(上海丽珠东风生物技术公司)配为25 mg/L浓度，丙谷胺(江苏金坛制药厂)浓度为32 mg/L，5-Fu浓度为10 mg/L。实验共分5组：空白对照组、胃泌素组、丙谷胺组、胃泌素＋丙谷胺组和5-Fu组。 3.MTT比色分析法：取传代后72 h的细胞，用含10%小牛血清的培养液调整细胞浓度为1× 108个/L，接种于96孔培养板，每孔100 μl，待细胞贴壁后弃去培养液，空白对照组加5 %小牛血清培养液100 μl，胃泌素组加胃泌素液100 μl，丙谷胺组加丙谷胺液100 μl ，胃泌素＋丙谷胺组二者各加50 μl。5-Fu组加5-Fu液100 μl，每组设8个复孔，培养72 h，结束培养前6 h加质量分数为5%MTT(Sigma公司)20 μl/孔，继续培养6 h,离心，弃上清，每孔加质量分数为20%十二烷基硫酸钠(SDS)100 μl，震荡5 min，室温30 min后，在酶标仪上测定570 nm波长处的吸光度值(A)。 4.流式细胞术：传代后72 h细胞用含体积分数为10%小牛血清培养液调整细胞浓度为1×10 9个/L，接种于6孔培养板，每孔1.2 ml，细胞贴壁后弃去培养液，空白对照组加5%小牛血清培养液2.0 ml，胃泌素组加胃泌素液2.0 ml，丙谷胺组加丙谷胺液2.0 ml，胃泌素＋丙谷胺组二者各加1.0 ml。培养48 h后，分别收集每孔细胞，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤2次，2 ml 1640液制成细胞悬液，测定前离心弃上清，碘化丙啶(PI)染色，ANNEX IN-V(Boehringer mannheim公司)标记，测定凋亡细胞百分率。 5.统计学方法：两组间吸光度值采用t检验；凋亡百分率采用U检验。 二、结果 1.胃泌素对MKN45胃癌细胞的增殖作用：对照组吸光度A值为0.561±0.056；胃泌素组为0.767±0.065与对照组比较，MKN45增殖作用明显加快；丙谷胺组0.556±0.040与对照组间差异无显著性(P＞0.05)；胃泌素联合应用丙谷胺可抑制细胞的增殖［A值为0. 583±0.032，与胃泌素组比较，P＜0.01，但不如5-Fu (0.453±0.045)强( P＜0.01)］。 2.胃泌素对MKN45胃癌细胞凋亡的影响：胃泌素对MKN45细胞的凋亡有明显的抑制作用，胃泌素组细胞凋亡百分率仅为1.39%，明显低于对照组的9.58%(P＜0.01)，联合应用丙谷胺后凋亡增加(表1)。
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左心作功的大鼠腹部心脏移植模型的建立
由Ono和Lindsey［1］设计的大鼠腹部心脏移植模型及以后的改良术式，供心左心不参与循环。我们通过将右心血液引入左心，建立使左心参与循环，供心更接近生理状态的模型，现报道如下。 一、材料及方法 1.材料: 雄性Lewis大鼠24只，体重250～300 g(北京大学实验动物部提供)，双人双目手术显微镜（GX-SS22-3，上海医用光学仪器厂），显微外科手术器械（上海医疗仪器厂），医用无创伤缝线（上海医用缝合厂）。24只大鼠随机分两组：Ⅰ组，左心不作功组， 12只；Ⅱ组，左心作功组，12只。 2.手术方式：质量分数为1%戊巴比妥钠(40?mg/kg体重)腹腔注射麻醉。肌肉注射青霉素( 2万?U/kg体重)和链霉素(15?mg/kg体重)预防感染。将供体固定，皮肤消毒，开腹，经下腔静脉注射肝素生理盐水6～8 ml(含肝素300～400 IU)，同时横断腹主动脉。经胸廓两侧开胸，在心脏表面放置冰屑使心脏停跳。Ⅰ组：结扎切断下腔静脉、左右上腔静脉及左肺动脉，切断主动脉及右肺动脉，肺静脉集束结扎并切断。把供心放入0 ～4 ℃肝素盐水中保存。受体固定，皮肤消毒，开腹，在肾血管平面下游离腹主动脉及下腔静脉，应用7号线阻断血流，血管钳牵拉阻断线，将供心主动脉、右肺动脉分别与受体的腹主动脉、下腔静脉行端侧吻合。Ⅱ组：结扎切断下腔静脉、左上腔静脉，切断主动脉、右上腔静脉及主肺动脉，肺静脉集束结扎并切断。把供心放入0～4 ℃肝素生理盐水中保存，将供心主肺动脉与左心耳行端侧吻合。受体固定，皮肤消毒，开腹，在肾血管平面下游离腹主动脉及下腔静脉，应用7号线阻断血流，血管钳牵拉阻断线，将供心主动脉、右上腔静脉分别与受体的腹主动脉、下腔静脉行端侧吻合。手术过程中心脏表面放置小纱布，纱布表面放置冰屑以保护心肌。手术过程中应用 9-0无损伤线缝合吻合口，在显微镜下放大6～8倍进行手术。术后每日肌肉注射青霉素(2万 ?U/kg体重)和链霉素(15?mg/kg体重)预防感染共3天。 3.观测指标：(1)开放血流后心脏复跳状况；(2)每日腹部触诊供心跳动情况。 二、结果 1.一般资料：Ⅰ组供心获取时间为(9.7±0.8) min, 全部手术时间(56.0±3.1) min；Ⅱ组供心获取时间为(7.5±0.6) min, 主肺动脉与左心耳吻合需时(14.0±2.1) min, 全部手术时间为(68.2±4.3) min。 2. Ⅰ组开放血流后供心4例自动复跳，2例经温盐水复温后复跳，无心耳饱胀等回流不好表现；Ⅱ组供心3例自动复跳，3例经温盐水复温后复跳，无心耳饱胀等回流不好表现。
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端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸对人肝癌细胞生长抑制的研究
本实验旨在探讨端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸（ASODN-t）抑制端粒酶活性［1］，诱导肝癌细胞凋亡，从而抑制肝癌细胞生长的作用［2］，为肝癌基因治疗提供依据，现将结果报道如下。 一、材料和方法 1. ASODN-t对细胞抑制作用的观察: 取2×107个/L对数生长期肝癌细胞(肝癌细胞株SM MC -7721 引自中国科学院上海细胞生物研究所细胞库)接种于96孔的细胞培养板中，每孔100 μl，设3个复孔。分别加入ASODN-t（上海生工生物工程公司合成，序列为5’-CT CAGTTAGGGTTAGACA-3’,调节其终浓度分别为1、2、3、4、5 μmol/L）、无关寡聚核苷酸（N-ODN，上海生工生物工程公司合成，序列为5’-CATTTCTTGCTCTCCACG- 3’,终浓度为3 μmol/L），培养24、48、72、96 h，于结束前4 h加入质量分数为0. 5%四唑蓝(MTT)20 μl，继续培养4 h，再加入SDS溶液100 μl，终止反应。37 ℃培养箱过夜，用酶联免疫检测仪检测各孔在波长570 nm的吸光度A值。 2.形态学观察: 在培养状态下，倒置显微镜观察细胞生长状况及形态学改变，并将5 μm ol/L的ASODN-t处理3 d的细胞在荧光显微镜下观察凋亡细胞的形态。 3.DNA抽提及电泳: 将1×109个/L肝癌细胞经5 μmol/L ASODN-t处理3 d后按试剂盒方法抽提DNA，取抽提好的DNA 5 μl，在质量分数为2.0%琼脂糖凝胶，80 V电压条件下电泳 3 h，紫外光透射仪下观察电泳条带并拍照。 4.流式细胞仪分析: 将1×109个/L肝癌细胞与5 μmol/L ASODN-t共同孵育3 d，磷酸盐缓冲液(PBS)清洗2次，加无水乙醇固定24 h，随后清洗细胞，与含有质量分数为1.0% RNA 酶的Tris-HCl 缓冲液（pH 7.4）共同孵育10 min，碘化丙啶DNA染色后上机检测。 5.端粒酶活性测定:同上法肝细胞孵育3 d，按试剂盒要求处理细胞，取反应管，各加入45 μl反应混合物、2 μl已处理的标本，混匀，加入30 μl液体石蜡，置25 ℃水浴保温 30 min，在聚合酶链反应(PCR)仪上循环，94 ℃120 s，94 ℃30 s，48 ℃30 s，72 ℃90 s ，72 ℃300 s。循环35次。循环结束后，在微孔板各孔中加入杂交反应液，再加入扩增产物 25 μl混匀，设立阴阳及空白对照，置37 ℃恒温反应60 min。加入显色剂，37 ℃避光显色 10 min，加入终止液，终止反应。在波长450 nm读取A值。 二、结果 1.ASODN-t对细胞生长的影响(图1): 不同浓度ASODN-t与2×107个/L肝癌细胞共同孵育后，细胞生长受到抑制，这一抑制作用随浓度的升高及作用时间的延长而加强。N-ODN（对照组）对肝癌细胞无作用。 2.细胞形态学变化: 倒置显微镜下可见N-ODN作用的细胞及不加药组细胞呈上皮型贴壁生长，细胞轮廓清楚，细胞间结构紧密，细胞生长旺盛；而ASODN-t组细胞有部分变圆浮起，细胞间接触变松，增殖减慢，细胞中颗粒增多，随药物浓度增高，细胞周围碎片增多，并将5?μmol/L?ASODN-t处理3?d的细胞在荧光显微镜下观察，细胞核染色质深染，聚积于核膜下呈新月形，膜突起呈小泡样，小泡脱落形成含核小体片段的凋亡小体。而N-ODN（对照组）作用的细胞及不加药细胞无明显形态学变化。 3.DNA电泳结果: 5?μmol/L?ASODN-t作用3?d后，肝癌细胞DNA电泳呈明显凋亡带，对照组则无凋亡带。 4.流式细胞仪分析结果: 流式细胞仪检测5 μmol/L ASODN-t作用3 d的肝癌细胞在G1 期前出现亚二倍体凋亡峰,对照组未见凋亡峰。 5.端粒酶活性: 5 μmol/L ASODN-t作用3 d后，肝癌细胞端粒酶活性明显受到抑制(A 值：0.06)，不加药的肝癌细胞及N-ODN作用的细胞粒酶活性很高(A值：0.13、0.14) 。
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高强度聚焦超声对W256肝癌荷鼠淋巴细胞活性的影响
我们应用高强度聚焦超声(HIFU)治疗W256肝癌荷鼠，并通过四唑蓝(MTT)比色法观察荷癌鼠外周血淋巴细胞杀癌细胞活性的变化，旨在通过淋巴细胞功能的变化反映高强度聚焦超声对荷癌鼠免疫的影响，为其临床应用提供依据。现将结果报道如下。 一、材料和方法 1.模型的制作：选用Wistar大鼠，雌雄各半，体重150～250 g。质量分数为3%戊巴比妥钠(30～40 mg/kg体重)腹腔注射麻醉。在其肝左叶埋置1 mm3大小的W256癌块。接种7～10 d后可长成直径0.5～1.0 cm大小的实体癌，即可作为W256肝癌荷鼠模型。同时，按相同操作步骤但不在其肝左叶埋置癌块制作正常肝大鼠模型。 2.实验分组：A组：治疗组，W256肝癌荷鼠20只，接种10 d时接受HIFU照射治疗。B组：荷癌肝对照组，W256肝癌荷鼠20只，接种10 d时接受HIFU假照射。C组：正常肝对照组，为 20只正常肝大鼠模型建立10 d后的大鼠，接受HIFU肝照射处理。 3.HIFU治疗系统：由本课题组设计制造。该机包括功率发生源(大输出功率为12 W，可提供连续输出)、治疗探头［利用透镜聚焦原理制作而成。探头直径0.5 cm，工作频率10 MHz，焦点处大声强(ISATA)1 528.7 W/cm2］、循环水降温系统3个部分。 4.治疗方法：将大鼠仰卧位固定，游离出其肝左叶。调整超声探头，使其焦点正好对准肝癌结节。启动HIFU系统，采用连续超声波照射，20 s/次，共2次，间隔3 min。正常肝对照组治疗步骤及治疗参数与上述相同，但照射的是大鼠肝左叶同一部位的正常肝组织。对荷癌肝对照组的癌结节进行假照射。 5.淋巴细胞活性的测定：直接穿刺处理2周后的大鼠心脏取血4 ml。经Ficoll-Hypaque 分离出淋巴细胞并调制成1×106个/L的细胞悬液作为效应细胞，靶细胞为W256肿瘤细胞，效靶比为10∶1。应用MTT比色法测定淋巴细胞活性。期间效靶细胞预培养18 h，MTT与细胞反应的时间为4 h。采用如下公式计算淋巴细胞的活性： 淋巴细胞活性(%)= ［1-(实验孔吸光度值-效应细胞孔吸光度值)/靶细胞孔吸光度值］×100% 6.组织学观察：采血后，立即将大鼠活杀，多点切取病灶和病灶与正常组织交界区的组织。按常规制作切片，进行光、电镜观察。 7.统计学处理：结果以均数±标准差(****±s)表示，行组间t检验。 二、结果 1.组织学观察：光、电镜观察均显示，荷癌肝对照组交界区有较多癌细胞侵袭浸润，炎性细胞少见；正常肝对照组交界区，中性粒细胞等非特异性炎性反应细胞常见；而治疗组的交界区癌细胞偶见，淋巴细胞、浆细胞和单核细胞等活跃。
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腹腔镜中不同膨腹气体抑制肿瘤细胞生长的体外对比研究
本实验旨在研究CO2、He、N2O等不同膨腹气体在模拟气腹条件下，对肿瘤组织体外生长的影响，结果报道如下。 一、材料与方法 肿瘤细胞为人类肝癌细胞株SMMC7721(购于中国科学院细胞研究所)，体外培养于RPMI 164 0完全培养液(含体积分数为10%小牛血清及10万U/L青链霉素)中。传2～3代(至少1周以上)后，以台盼蓝染色后在荧光显微镜下记数，制成5×102个/L的单细胞悬液。悬液分别注入4个( 4组)无菌医用引流袋(带防漏阀)中，用自动气腹仪(Laproflator electronic 3509，WE STGmbH，Germany)自引流袋入口管分别注入CO2、He及N2O，对照组不附加任何气体。 3个实验组气体压力达15 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)，于37 ℃孵育箱中维持模拟气腹状态45 min，对照组为大气压力，37 ℃孵育箱中孵育45 min。取出后的细胞悬液用台酚蓝染色后在荧光显微镜下记数4个组存活细胞的比值，同时4个组细胞悬液分别加入96 孔板内。每孔细胞数为5×104个，每组做12复孔，于模拟气腹后24、48、72 h分别用四唑蓝(MTT，美国Sigma公司，微量酶反应于分光光度计在波长为570 nm测定比色值以检测细胞抑制率。 统计学方法：各组间比色值用Student t检验。 二、结果 “气腹’后4个组细胞存活百分比差异无显著性(P＞0.05)，其中CO2组为(92.3±1.2)%，He组为(89.6±2.5)%， N2O组为(90.5±±3.1)%，对照组为(90.7±3. 1)%。在观察的72 h中，肿瘤细胞均生长。气腹后测定各组pH值结果: CO2组为6.6, He组为9.8, N2O为8.2, 对照组为7.3。以MTT法对细胞进行抑制率测定(图1), CO 2组在“气腹”后第24小时与He组、N2O组和对照组相比， MTT值(对照孔-用药孔 /对照孔×100)上升，差异有非常显著性(P＜0.01)； He组较 N2O组和空白组明显下降(P＜0.05)， N2O和对照组之间MTT值差异无显著性(P＞0.05)。第48小时CO2组与其他3个组相比，MTT值亦上升，其中较 H e组差异有非常显著性(P＜0.01)，较N2O和对照组差异有显著性(P＜0.05)，He组较N2O和对照组下降，差异有显著性(P＜0.05)，N2O和对照组之间差异无显著性(P＞0.05)。第72小时，各组MTT值差异均无显著性(P＞0.05)。
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感觉和运动神经源性雪旺细胞与神经元共培养神经生长因子mRNA的表达
临床上修复神经缺损使用自体神经移植体时，神经感觉功能恢复较运动功能好，这可能与移植神经取自感觉神经有关，这种神经特异性再生的机制目前认为有多种机制参与［1］，而神经损伤后初雪旺细胞是远段神经的唯一成分，而且雪旺细胞被证实可以分泌包括神经生长因子(NGF)在内的多种神经营养因子［2］，因此我们以感觉和运动神经来源的雪旺细胞为研究对象，以NGF为指标，研究两种雪旺细胞与神经元共培养后NGF mRNA的表达是否有差异，探讨这种差异对神经特异性再生的作用。 一、材料和方法 1.雪旺细胞和神经元的体外培养：感觉性和运动性雪旺细胞、感觉和运动神经元的体外共培养参考文献［3，4］的方法。简要步骤如下：无菌条件下，分别取5 d龄SD乳鼠的背根神经(感觉性雪旺细胞)和股神经肌支(运动性雪旺细胞)，14 d龄SD胚鼠背根神经节(感觉神经元)和脊髓前角(运动神经元)，剪碎成糊状；分别置入离心管中，加入0.125%胰蛋白酶+0.03%Ⅳ型胶原酶(Sigma公司)，消化30～40 min；1 500 r/min离心5 min；用DMEM/F12(Gibco公司)培养基将沉淀混悬成悬液，接种到培养皿中；37 ℃，体积分数为5%CO2细胞培养箱中孵育；雪旺细胞在48 h添加阿糖胞苷(5×10 -8 μg/L)，抑制成纤维细胞，第4天按1×109个/L的密度传代接种到6孔培养板盖玻片上，2 d后接种原代培养神经元细胞，这样就获得感觉性雪旺细胞和感觉神经元、运动性雪旺细胞和运动神经元的共培养。 2.共培养细胞NGF mRNA的表达：NGF mRNA表达的检测采用武汉博士德公司原位杂交检测试剂盒(MK1032型)提供的方法进行。简要步骤如下(以下溶液中均含有0.1%焦炭酸二乙酯)： 4%多聚甲醛固定液30 min；磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗涤3次；甲醇(含体积分数为0.03%过氧化氢)30 min；PBS洗涤3次；灭菌水洗涤3次；蛋白酶K，37 ℃，10 min；灭菌水洗涤3次；地高辛标记的cDNA探针和无关序列在杂交液内首先经过100 ℃，8 min的变性处理，然后置于碎冰中3 min，滴加到盖玻片上，上面覆以专用盖片(Sigma公司)；37 ℃孵育20 h；2 5 ℃的2×SSC(氯化钠17.4 g，柠檬酸钠8.8 g溶于1 000 ml水中)洗涤2次；37 ℃的0.1 ×SSC洗涤1次；加入封闭液，不洗；加入抗地高辛抗体，34 ℃孵育30 min；TBS(氯化钠30 g，三羟甲基氨基甲烷1.2 g，纯乙酸0.5 ml溶于1 000 ml水中)洗涤；加入酶标二抗， 34 ℃孵育20 min；TBS洗涤；加入显色液，34 ℃显色30 min；灭菌水洗涤，中止反应。显微镜下观察、比较。 二、结果 感觉和运动雪旺细胞与相应神经元混合培养后，第3天分别进行NGF mRNA原位杂交，图1为运动性雪旺细胞NGF mRNA表达染色，图2为感觉性雪旺细胞的表达，图3为空白对照，图中黑褐色染色颗粒的多寡即代表NGF mRNA表达量的多少。由图中可见，感觉性雪旺细胞NG F mRNA的表达颗粒明显较运动性雪旺细胞密集，而运动性雪旺细胞的表达接近于空白对照。
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应用传感针观察脊髓损伤后脊髓氧分压的变化
急性脊髓损伤后的缺血、缺氧是脊髓继发损害的重要原因之一。我们应用中医传感针测定急性脊髓损伤后脊髓组织氧分压的动态变化，并探讨其与病理变化及神经功能损害的关系，现将结果报道如下。 一、材料与方法 1.脊髓损伤模型制作：SD大鼠56只，雌雄不限，重(220±20) g ，随机分为对照组及伤后30 min、1、3、6、24、72、168 h共8组。体积分数为1.0%戊巴比妥钠30 mg/kg体重腹腔注射麻醉，切除T10椎板，暴露脊髓；按改良的Allen打击法［1］，以10×10 gcm能量致伤脊髓。对照组除不致伤外，余处理均相同。 2.脊髓氧分压的测定：应用中医传感针测定脊髓组织氧分压，该设备由华中科技大学同济医学院生物医学工程实验室研制［2］。先将氧分压测试仪接电源预热，将232型饱和甘汞电极、传感针末端分别与之连接，调零后将测试仪置于测试状态，将待测大鼠的尾巴置于生理盐水烧杯中(甘汞电极一端先已置入其中)。在显微镜监视下，将氧分压传感针尖端(直径0.1 mm)沿脊髓背侧中线旁开0.5 mm处插入固定，深度0.5 mm。待显示屏上数值稳定后记录读数，此即脊髓组织氧分压值(kPa，1 kPa=7.5 mm Hg)。 3.脊髓组织学检查：每组动物各取1只处死，快速取出损伤中心段脊髓标本，常规方法固定、包埋、切片，层厚10 μm，行苏木素-伊红(HE)染色，光镜下观察；每组再另取1只处死，立即取伤段脊髓置于4 ℃体积分数为0.025%戊二醛液中固定、磷酸液冲洗，0.1%锇酸固定，制作电镜包埋胶囊，超薄切片，透射电镜观察。 4.运动功能评定：按Rivlin斜板法［3］，于麻醉苏醒后开始检查。在一长方形有纹橡胶垫覆盖的斜板上，将大鼠头朝前、身体纵轴与斜板纵轴垂直放置，测试角度从0开始渐增大，至其刚好可以维持5 s时，记录此临界角度。 5.统计学方法：采用t检验。 二、结果 1.脊髓损伤后脊髓组织氧分压的变化：对照组大鼠脊髓组织氧分压值(kPa)为4.80±0.5 2，伤后30 min、1、3、6、24、72、168 h分别为4.80±0.52、2.49±0.22(与对照组比较，下同，P＜0.01)、1.16±0.10(P＜0.01)、0.97±0.08(P＜0.01)、0.77 ±0.06(P＜0.01)、0.93±0.08(P＜0.01)、1.28±0.12(P＜0.01)、2.87±0.24(P＜0.01)。 2.脊髓组织病理学改变：(1)HE染色：伤后30 min开始出现病理改变，至1 h脊髓灰质灶性出血，神经细胞变性；6 h神经细胞固缩、坏死，白质出血、水肿，轴索肿胀；24 h 神经细胞大部消失，白质部分溶解，脊髓大部分坏死，残留轴索肿胀，髓鞘破裂。(2)透射电镜观察：伤后30 min神经细胞内线粒体肿胀，至1 h较为明显，6 h神经细胞膜破裂，核膜不完整，线粒体嵴断裂或消失，髓鞘板层结构松散、断裂，24 h上述变化更为明显，至1周时仍未恢复。 3.运动功能评分：对照组大鼠斜板试验结果为(71.4±10.7)度；损伤组伤后6 h降至(24 .3±3.2)度，以后逐渐回升，24?h为(26.1±3.8)度,1周时为(31.9±4.5)度, 至伤后4周达(35.0±5.6)度，仍显著低于对照组水平(P＜0.01)。
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成人肝细胞分离及低温保存的研究
我们采用改进的胶原酶灌注技术,获取分离的成人肝细胞,并研究威斯康星(UW)保存液对细胞活力和ATP贮存的影响，现将结果报道如下。 一、材料与方法 1.主要试剂：Ⅱ型胶原酶、透明质酸酶、DNA酶I、4-2-羟乙基-1哌嗪乙磺(HEPES)均购自 Sigma公司,离解酶(Dispase)Ⅱ型购自Boehringer公司,小牛血清为Gibco产品。 2.分离方法：成人肝脏取自脑死亡供体，采用腹部多器官联合快速切取技术获取, UW液低温灌洗。切取灌洗较好的肝叶组织60～80 g(1个切面,保留3～4支血管行插管),UW液0～4 ℃保存,冷缺血时间3～8 h。肝脏获取后,以1 000 ml 初灌注液20 ml/min灌注,然后以500 ml再灌注液循环灌注至肝脏彻底消化。用镊子撕掉格林森鞘后取出肝细胞放入含体积分数为10%的小牛血清,质量分数为0.01%的DNA酶Ⅰ和Ⅱ型离解酶及0.8 mmol/L Mg2+的1640培养基中混均，尼龙网过滤。然后4 ℃,50 g离心5 min,以含钙的Hanks液漂洗3次。取细胞悬液台盼兰染色判断细胞存活率(灌注液成分见表1) 。 3.UW液保存：肝细胞悬液50 g离心后去上清,均匀悬于UW液中(含胰岛素 4 IU/L, 地塞米松 16 mg/L,血清及青霉素),4 ℃保存,一定时间后测细胞存活率, HPLC法测细胞内 ATP,生化法测乳酸脱氢酶(LDH)漏出率。在相应时段取细胞37 ℃水浴中孵育60 min,然后测细胞内ATP。 4.统计学方法：数据以均数±标准差(****±s)表示,采用t检验。 二、结果 肝细胞活力及ATP含量见表2。 三、讨论 我们应用改进的胶原酶循环灌注方法获得了纯度及存活率均较高的成人肝细胞。在切取肝叶前以UW液低温灌洗肝脏,灌注前全身肝素化, 大大减少了肝组织中红细胞的数量,初灌注时应用含乙二醇四乙酸的无钙Hanks液,提高了肝细胞的产量。灌注时用透明质酸酶,使得肝脏基质消化得更彻底, 再灌注时应用DNA酶Ⅰ及离解酶Ⅱ,可以消化坏死的肝细胞释放的DNA，使消化后的肝细胞不能凝结成块。再灌注液中含有Mg2+和Ca2+,可以稳定DNA酶，以发挥更大效果。肝脏灌注过程中产生的一些酸性产物可使灌注液的pH值下降到6.0左右,灌注液中的多数酶发挥作用的佳pH值为7.4,我们在本研究中采用15 mmol/L的H EPES作为缓冲系,可使灌注液的pH值恒定在7.4～7.5之间,而且对肝细胞的毒性很小［1］，以使各种酶类发挥佳消化效果。肝细胞消化完全后格林森鞘很容易撕去,如过度消化则可崩解成碎片。经过以上处理, 可以得到纯度及存活率均较高的肝细胞用于各种研究。
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应用RNA保护分析法观察原发性肝内胆管结石患者肝细胞内葡萄糖醛酸转移酶基因的表达
本实验旨在观察肝细胞内影响胆红素代谢的酶--葡萄糖醛酸转移酶(UDP-GT1)活性和基因表达的变化在原发性肝内胆管结石(PIS)中的作用，现将结果报道如下。 一、对象与方法 1.病例选择和标本收集：以术中肝内胆管有褐色易碎结石定为PIS，收集我院1995年1月～1997年12月此类病人36例为患者组，其中男20例，女16例。术中取病变肝叶肝组织液氮保存。收集其他手术患者肝活检标本7例作为正常对照组，其中胆囊息肉患者4例，胃癌3例，肝功能化验均正常，术中取肝活检组织液氮保存，胆汁送细菌培养。 2.肝组织UDP-GT1活性测定：按照Burchell法［1］测定UDP-GT1活性。取正常组病人UDP-GT1均数的1/2值定为UDP-GT1活性异常降低界限。两组病人UDP-GT1 活性降低的人数以百分比表示，进行t检验。参照物的设定：测定肝组织匀浆内葡萄糖-6-磷酸酶活性，以排除因取样或样品保存等因素造成UDP-GT1活性的非特异性改变。 3.UDP-GT1 mRNA表达量的检测：(1)RNA保护分析法：以β-G lobin基因为内参照测定UDP-GT1 mRNA表达量。合成两个寡核苷酸探针，用32P标记：①UDP -GT1探针，5’-CCTGGGCACGTAGGAGAATG-3’(antisense,590～620 bp，针对UDP-GT 1特有的第5个外显子)；②β-Globin探针，5’-ACCACCAACTTCATCC-ACGTTCACC-3’(antisense,64 440～62 266 bp)。杂交方法：异硫氰酸胍提取肝细胞总RN A，取10 μg RNA，同一管中加入同位素标记的UDP-GT1和β-Globin两种探针，液相杂交后加RnaseS1消化掉未杂交上的RNA，聚丙酰胺变性胶电泳，放射自显影，切下放射性条带用2C-201型放射测量仪，测定放射线计数。UDP-GT1 mRNA丰度的判定以β-Globin为内对照，所测UDP-GT1放射线计数与β-Globin放射线计数之比为该基因的相对丰度。(2) 斑点杂交：探针制备：UDP-GT1质粒(荷兰Bosma教授惠赠)扩增后利用EcorR1酶切，切下的一段700 bp片段，用地高辛标记及杂交试剂盒(Boehringer Mannheim公司)进行标记和杂交。斑点杂交：分别取每个样品总RNA 5、10、15 μg点于硝酸纤维素膜，进行斑点杂交。U DP-GT1 mRNA表达量的判定以薄层扫描仪对显色的蓝色斑点进行扫描(580 nm波长)，计算出每个样品3个斑点的平均波峰面积，以样本总RNA量为单位，比较各组平均波峰面积。 二、结果 1.肝组织保存质量：正常组肝组织葡萄糖-6-磷酸酶的活性正常，患者组有8例降低，该8例病人不纳入实验结果统计，以排除因取样或样本保存不当所造成的实验误差。患者组实际纳入统计的病人只有28例。
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端粒酶活性及其结构基因在人脑胶质瘤中的表达
目的 研究分析端粒酶活性及相关结构基因在不同级别脑胶质瘤中的表达，探讨端粒酶与脑胶质瘤的相关性及其临床意义。方法 采集40例脑胶质瘤手术切除标本、4 例正常脑组织，通过半定量端粒重复序列扩增(TRAP)-银染方法检测端粒酶活性水平；通过半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测端粒酶相关结构基因hTR、TP1、hTRT的mRNA表达水平。结果 在40例胶质瘤标本的33例(82.5%)中检测出端粒酶活性，而在正常脑组织中无端粒酶活性的表达，不同级别脑胶质瘤之间端粒酶活性水平差异有显著性，脑胶质瘤端粒酶活性水平与hTRT基因的表达呈显著正相关，而与TP1、hTR的表达无显著相关。结论 端粒酶活性可以作为脑胶质瘤的恶性标记之一， hTRT 基因是一个端粒酶的正调控结构基因，hTRT的表达与细胞永生化和恶性肿瘤形成过程中的端粒酶的激活机制有关，hTR基因是端粒酶活性必须的组分，但不影响端粒酶活性的高低。
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高强度聚焦超声体外治疗人恶性实体肿瘤的病理学变化
目的 研究高强度聚焦超声（HIFU）体外治疗人恶性实体肿瘤的病理学变化。方法HIFU治疗164例恶性实体肿瘤病人，其中30例治疗后常规外科手术，观察治疗区组织的病理学变化。结果 HIFU治疗区与非治疗区边界清楚，治疗区内组织出现凝固性坏死。组织学检查显示治疗区内全部肿瘤细胞出现不可逆性损伤征象，其边缘有新生肉芽组织形成和淋巴细胞浸润。结论 HIFU体外治疗恶性实体肿瘤是安全、有效和可行的，该技术将为临床无创性治疗肿瘤提供一种全新的治疗手段。
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肝脏低温保存-再灌注期间肝细胞凋亡及其与Bax基因蛋白相关性的研究
目的 研究临床肝移植过程中供肝低温保存-再灌注期间肝细胞凋亡及其相关机制。方法 应用细胞凋亡原位末端标记法并结合电镜观察,检测低温保存时间分别为0(A 组)、3(B组)、6(C组)、9(D组)h的4组兔肝脏在低温保存-再灌注过程中肝细胞凋亡情况。同时,对各组肝脏再灌注前后肝细胞内Bax基因蛋白表达进行测定。结果 [ HT5”SS〗A、B、C、D各组肝脏于低温保存后的再灌注60 min时,组织内可见明显的肝实质细胞凋亡；其凋亡细胞数量(1×10-2个/μm2)分别为：1.21±0.84、4.38±1.14 、7.24±2.39、11.39±3.36；且4组间差异均有显著性(P＜0.05或P＜0.01 )。此外, 4组肝脏组织内均有程度不等的Bax蛋白表达，阳性物质主要分布于肝实质细胞浆内；定量结果显示，4组Bax阳性细胞数及阳性物质积分吸光度值依次为：1.18±0.84、737.04 ±45.57，3.21±1.30、1 006.58±70.10，6.56±1.14、1 401.16±106.93，11.18±1.92 、1 797.23±130.73；各组间差异均有显著性(P＜0.05或P＜0.01)。结论 肝实质细胞凋亡明显参与了肝脏低温保存-再灌注损伤过程,这种肝实质细胞凋亡可能受Bax基因蛋白的调节。
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缺血-再灌注肺损伤动物模型的建立方法
缺血-再灌注肺损伤是指肺组织或其他组织器官遭受一定时间缺血后恢复血液灌流(再灌注)，肺组织损伤程度迅速增剧的病理现象。根据缺血组织器官的不同，再灌注肺损伤可分为两大类病因，一类是肺血管缺血后再灌注产生的肺组织损伤，如肺栓塞溶栓治疗、肺血栓内膜切除术、心肺移植术等；另一类为肺外组织器官缺血后再灌注导致肺组织损伤，如肢体手术、腹主动脉瘤手术等。由于血运重建后，反而引起肺组织损伤加重，有悖于治疗目的，因此开展缺血-再灌注肺损伤的研究和防治已愈来愈受到人们的重视，而建立良好的动物模型又是研究缺血-再灌注肺损伤发病机制和评价药物防治的基础。现结合有关文献，就实验动物的选择和动物模型的制作方法作一介绍。 一、实验动物的选择 目前用于制作缺血-再灌注肺损伤动物模型的实验动物主要是大鼠和犬，其次是家兔和猪。大鼠价格低，易于饲养管理，但体积小，手术过程中易损伤其他组织器官，操作困难，国外使用显微外科器械制作大鼠模型。家兔亦较价廉，较大鼠容易手术操作，但较脆弱，术中易猝死，不能耐受慢性模型的制作过程。犬和猪等大动物易于实验外科手术操作，有利于血流动力学监测和多次采血、多项指标测定，可用于制作急慢性模型，美中不足的是所需费用较高。 二、动物模型的制作方法 1.肢体缺血-再灌注肺损伤动物模型：此类模型主要是为研究和防治肢体手术及腹主动脉瘤手术后再灌注肺损伤而建立的。具体方法为用无创血管夹夹住实验动物股动静脉，并在其下方用橡皮止血带环扎肢体，经数小时后撤去血管夹和止血带，恢复下肢血流［1］，或用无创血管夹夹住实验动物肾动脉以下的腹主动脉使下肢缺血后再恢复血流［2］，这两种方法均可制成肢体缺血-再灌注肺损伤动物模型。由于缺血时间长会造成肢体坏死，故制作的动物模型缺血时间不超过4 h，均属急性模型。 2.肺血管缺血-再灌注肺损伤动物模型：肺血管缺血多见于肺动脉血栓栓塞。既往有人用血栓注入法制作急性肺栓塞模型［3］、用口服凝血酸法制作慢性栓塞性肺动脉高压模型［4］。这两种模型虽然在病理上接近临床肺栓塞，但形成的肺内栓子弥散、栓塞部位不固定，取栓即血运重建困难。因此这两种方法不适于制作缺血-再灌注肺损伤模型。国外常采用结扎或钳夹肺动脉、气囊堵塞肺动脉以及经导管用异物封堵肺动脉的方法制作肺血管缺血-再灌注肺损伤动物模型。现将各种方法分述如下。
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骨质疏松症分子遗传学的研究进展
骨质疏松症是以低骨量、骨微观结构退化和骨强度下降、骨折风险度增加为特征的常见代谢性骨病，骨质疏松症引起的继发性骨折是影响老年人群生活质量的重要因素之一。研究已证实遗传因素在骨质疏松症及其继发骨折的发病中起重要作用［1,2］，现对近年来骨质疏松症的分子遗传学研究作一综述。 一、骨质疏松症的遗传流行病学 Cummings等［3］的研究表明，有母亲髋部骨折史的妇女发生髋部骨折的机率比没有母亲髋部骨折史的的妇女发生髋部骨折的机率高2倍，Jouanny等［4］的研究表明，如果单亲是低骨密度，那么其子女出现低骨密度的风险比正常组高出4倍，如果双亲都是低骨密度，那么其子女出现低骨密度的风险比正常组高出9倍。其他研究表明，与骨折风险有关的其他因素也和遗传有关，例如骨微观结构、骨转换率、和年龄相关性骨丢失。目前，虽然离散性分析已确认骨质疏松症是一种多基因病，但还没有研究能阐明骨密度(BMD)和骨代谢的具体遗传模式，而对参与骨代谢的蛋白质、激素和细胞因子等诸多候选基因的多态性分析正力图深入了解该领域，以期在分子学水平上对骨质疏松症的防治奠定基础。 二、骨质疏松症候选基因 1.维生素D受体(VDR)基因：VDR是一种核受体，其编码基因位干12 q上，大小为12 kb，其与骨代谢有关的基因多态性位点(BsmI、ApaI、TaqI酶切位点)，依次位于其基因第8内含子至第9外显子之间。通常用小写b、a、t表示有该酶切位点，大写B、A、T则表示没有该位点。目前VDR基因多态性与骨密度的相关性分析已在不同地区和不同人群中展开，但其结果却存在较大差异。在美国、欧洲和澳大利亚的白人中BB基因型出现频率为17%，在美国黑人中占13%，在亚洲人中少，如日本人为4%，中国台湾人为0.4%［5］。Morrison等［6］在1994和1997年两次对 311 例澳洲健康妇女的研究证明BMD和VDR基因多态性具有相关性。Keen等［7］认为VDR基因多态性主要决定峰值骨量，而骨丢失主要由其他基因的多态性调控。也有许多研究表明VD R基因多态性与BMD无关。对BsmI多态性的功能意义至今还不明确，因为它即不位于内含子和外显子的交接区域，又不能在翻译表达的过程中产生剪切错误。1998年Gross等［8］从BB和bb基因型的个体取其皮肤进行成纤维细胞培养，发现两种成纤维细胞的VDR表达水平接近，而且细胞对VD的反应也基本相似，我们认为，VDR基因多态性和VDR位点的其他功能性变异或邻近基因的连锁不平衡有关。VDR作为调节1,25(OH)2D3功能的核受体，通过调控不同组织和细胞的基因表达，而在骨代谢和钙稳定中发挥关键作用，它对基因调控信号有强大的放大作用，所以反式作用因子表达的轻微改变可以在终表达产物上反应出大的差异性。而VDR研究结果的不一致，还有待于进一步考虑环境与种族对遗传的影响。
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原发性肝细胞性肝癌分子机理研究的几个热点问题
肝细胞性肝癌(HCC)是常见的一种肝癌，我国每年新发病例约占全球45%。且近年来，我国肝癌发病率上升，严重危害劳动人民的健康与生命安全。经过半个世纪的努力，我国医学工作者在肝癌的外科治疗上已取得了突破性的成绩，但传统的外科手术加化疗或放疗等方法仍有其局限性，肝癌的生物治疗也很不成熟，肝癌根治性切除后的复发率很高，复发的危险因素主要与肝癌的侵袭转移性有关。要使肝癌患者的生存率提高到一个新的水平，应加强肝癌分子病理机制的研究，寻找肝癌复发转移的靶基因，探讨肝癌生物治疗的新途径。现提出肝癌分子生物学现阶段研究的几个热点问题。 一、HCC病因 HCC的发病是多因素、多步骤的复杂过程，受环境和遗传双重因素影响。流行病学及实验研究资料已表明HBV和HCV感染、黄曲霉毒素B1、酒精、肝硬化及性激素等与HCC发病相关。其中，HBV与HCV感染是重要的因素。 在HBV感染诱发HCC的过程中多种机制共同发挥作用。虽然HBV的基因组 DNA在细胞染色体上整合的直接作用可能在肝细胞癌变中起一定作用，但有研究结果表明HBV的X蛋白与其它HBV编码蛋白如前S蛋白似乎起更为重要的作用。X蛋白是HBV基因组编码的一种多功能蛋白，目前已报道的X蛋白的功能包括酪氨酸磷酸激酶活性、p53蛋白结合活性、转录激活作用、Src激酶活化作用、DNA切除修复系统抑制作用等。其中有些功能活性仍有待进一步证实，它们在HBV诱发HCC过程中的相对重要性也需要深入研究。HBV感染与p53突变及其它肿瘤相关基因改变之间的关系仍然是复杂难解的重要问题之一。 HCV感染也是一种重要的HCC诱因，其基因组可编码多种蛋白，其中核心蛋白是一个多功能蛋白，如同HBV的X蛋白，它可与p53结合，调节其活性。因此，HCV核心蛋白在HCV诱发HCC 过程中可能有重要作用。 其他化学致癌剂和毒素特别是黄曲霉毒素也是HCC的重要诱发因子。黄曲霉毒素主要导致肝细胞中p53的特征性突变，即p53Ser249Arg突变。这种突变使p53 失去促凋亡活性而部分获得促进细胞周期G0～G1期转变的功能。 在多种HCC诱发因子间可能存在相互协同，如HBV与HCV的混合感染，以及HBV感染与黄曲霉毒素之间都可能有协同作用。这些环境因素在HCC的诱发过程无疑起重要作用，但肿瘤的发展和进一步恶性化必需肿瘤细胞自身生物学性状的改变，而阐明这种变化就是HCC研究的重要内容。 细胞的增殖失控是肿瘤细胞的一个主要特征，常表现为细胞周期进程对生长因子和细胞粘附的不依赖性。肿瘤细胞可因细胞周期相关因子自身的变化或各种调节其功能的信号转导途径的异常而发生增殖失控。
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双荧光素染色检测5-氟尿嘧啶及羟基喜树碱诱导的肝癌SMMC-7721细胞凋亡的研究
我们用5-氟尿嘧啶(5-Fu)、羟基喜树碱(HCPT)在体外诱导人肝癌细胞SMMC-7721 产生凋亡，并用双荧光染料吖啶橙／溴乙锭(AO／EB)染色结合DNA电泳法进行观察，结果报道如下。 一、材料与方法 将1×108/L SSC-7721细胞(中国科学院上海细胞学研究所)接种于含体积分数为10%小牛血清的RPMI 1640培养液中，于37 ℃，体积分数5%CO2培养24 h，细胞铺满瓶底，呈对数生长时加入5-Fu、HCPT使二者终浓度分别为75 mg/L、1 mg/L，再继续孵育，分别于6、1 2、24、48 h观察结果。 细胞孵育至特定时间，以质量分数为0.125%胰酶消化细胞3～5 min，细胞脱壁后加入原培养液洗刷细胞，2 000 r/min离心5 min，弃上清，加入500 μl培养液，配成细胞悬液，再加入实验用AO/EB溶液20 μl，混匀，置1滴于载玻片上，荧光显微镜下观察200个细胞，分别计数早期凋亡细胞(VA)、晚期凋亡(NVA)、活细胞(VN)及非凋亡的死亡细胞(NVN)，计算凋亡率。 凋亡率＝(VA+NVA)/(VA+NVA+VN+NVN)×100% 收集细胞，磷酸盐缓冲液洗涤2遍，低速离心5 min后弃上清。加入抽提缓冲液(10 mmol/L Tris-HCl ph 8.0、20 mg/L胰RNA酶、0.5%SDS)，37?℃ 1?h。加入蛋白酶K至终浓度100 mg/L，55?℃ 3?h，每隔20～30 min摇动1次至室温，按酚／氯仿法抽提DNA。1%琼脂糖凝胶电泳，紫外投射仪上观察并摄片。 二、结果 5-Fu、HCPT均能诱导SMMC-7721细胞产生凋亡，且随时间延长，其凋亡率在增加，在加药后6、12、24、48 h用AO／EB染色法检测，细胞凋亡率5-Fu组分别为19.6%、 23.8%、35.4%、38.7%，HCPT组分别为21.2%、26.5%、37.1%、42.6% ，而对照组分别为2.0%、2.8%、3.2%、3.5%。两种药物在相同时间诱导SMMC-7721凋亡的百分率差异无显著性(P＞ 0.05 )，而两者诱导细胞凋亡的百分率与对照组比较，差异均有显著性(P＜0.01。DNA电泳显示两种药物诱导6 h后均可见DNA裂解成180～250 bp整数倍的小片段，呈典型的梯形条带，以4 h为明显，而对照组无此表现。 三、讨论 本研究结果显示，SMMC-7721细胞经小剂量5-Fu、HCPT作用后，DNA电泳显示出典型的梯形条带。在琼脂糖凝胶电泳中DNA片段呈梯形表现，是DNA链被裂解成核小体间长度片段的特异性表现。从而提示小剂量的5-Fu、HCPT具有诱导SMMC-7721细胞产生凋亡的作用，可作为细胞凋亡诱导剂用于肝癌治疗。
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胰腺缺血-再灌注损伤细胞凋亡及其相关因素的研究
我们对胰腺缺血-再灌注损伤细胞凋亡及其相关因素如肿瘤坏死因子(TNF)-α、组织Ca 2+等在其过程中的作用进行研究，现将结果报道如下。 一、材料与方法 成年Wistar大鼠60只，体重(200±25) g，雌雄不拘。随机分为对照组(A组，10只)、缺血-再灌注损伤组(B组，30只)、异搏定保护组(C组，10只)和TNF-α拮抗组(D组，10只)。戊巴比妥钠45 mg/kg体重腹腔注射麻醉，A组直接取胰腺组织标本，心脏穿刺取血2 ml；B组分别以血管夹阻断腹腔干和肠系膜上动脉15、30、60 min(各10只)后再灌注6 h，取标本；C组阻断血管(同B组)15 min，于再灌注前5 min尾静脉注射异搏定溶液0.1 mg/100 g体重，取标本；D组于术前5 min尾静脉注射抗TNF-α单克隆抗体20 μg/100 g体重后阻断血管(同B 组)15 min，再灌注6 h，取标本。 胰腺标本常规固定，苏木素-伊红染色，以各组10个病理切片中出血坏死性胰腺炎所占比例来衡量胰腺组织损伤的严重程度。 采用末端标记法(TUNLE)标记胰腺凋亡细胞核中的DNA 3’-OH末端，按TUNLE试剂盒要求操作。3，3’-2氨基联苯胺显色，苏木素复染。光镜下计算凋亡细胞百分比，3次记数平均值，作为胰腺细胞凋亡指数(AI)。按TNF-α放射免疫试剂盒(北京东亚免疫研究所)说明测定TNF-α。以原子吸收光法测定组织Ca2+ 。所有数据以(****±s)表示，方差分析及相关性检验。 二、结果 缺血15、30、60 min细胞凋亡百分比分别为(28.3±3.2)%、(19.6±3.0)%、(11 .2±2.9)%，不同缺血时间的细胞凋亡百分比之间差异均有显著性意义(P＜0.05)。各组胰腺细胞AI、TNF-α、组织Ca2+检测结果见表1。缺血-再灌注损伤组血TNF-α、组织Ca2+与细胞凋亡指数之间均具有显著相关性(r=0.692 7，P＜0.05 ；r=0.848 5，P＜0.05)。
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乳猪肝细胞分离方法的建立
生物性人工肝作为暴发性肝衰竭的一种治疗手段正在不断的发展，理想的具有完整代谢活性的肝细胞是其关键的组成部分。我们在以往研究的基础上 ［1,2］，建立起一种乳猪肝细胞的分离方法，现报道如下。 一、材料和方法 1.液体的配制：(1)细胞分离液配制：A液：含NaCl 120 mmol/L、NaHCO3 25 mmol/L 、KCl 4.8 mmol/L、MgSO4 1.2 mmol/L、KH2PO4 1.2 mmol/L。B液：含CaCl2 1.33 mmol/L、体积分数为1.6%牛血清白蛋白的A液。C液：含葡萄糖5.6 mmol/L、乙二胺四乙酸二钠0.5 mmol/L的A液。D液：含CaCl2 1.25 mmol/L、2.4%牛血清白蛋白、Ⅳ型胶原酶(Si gma公司)0.05%的C液。(2)细胞培养液配制：Williams'E培养液含：胰岛素200 U/L、表皮生长因子10 μg/L、胰高血糖素50 μg/L、氟美松2.5 mg/L、青霉素15万U/L、链霉素100 mg/L。 2.乳猪肝细胞的分离：新生雄性乳猪，腹正中切口，暴露分离腹主动脉，插管固定，以一定的压力向腹主动脉内推注含肝素(100 U/kg体重)的4 ℃ C液，同时迅速切开胸腔，夹闭胸主动脉剪开心脏，即快速推注C液300 ml，推注同时切开门静脉，插管固定，快速推注4 ℃ C液100 ml。在肾静脉以上水平剪开下腔静脉，插管固定，夹闭肝上下腔静脉，将门静脉插管连接驱动泵输出端，形成门静脉-肝脏-腔静脉循环，循环D液30 min(37 ℃，95%O2，5%CO2)，流速50 ml/min，取下肝脏， B液中轻轻剥离肝包膜，以肝上下腔静脉为中心用小木梳轻轻快速梳下肝细胞，经4层纱布滤过即得较稠厚肝细胞悬液。将肝细胞悬液在4 ℃、50 g条件离心2.5 min，弃上清， 4 ℃ B液洗2次，Willianms'E 培养液洗1次，分别以50 g条件离心2.0、1.5、1.0 min，即得较理想肝细胞悬液。 3.肝细胞存活率测定：少量肝细胞悬液与等量0.4% 台盼蓝液混合，静置1 min，显微镜下计数200个细胞，细胞核着色者为死细胞，不着色者为活细胞。 二、结果 平均肝细胞产量为(12.94±1.29) ml (含肝细胞7×1010个/L)，肝细胞存活率为90.90%。 光镜下观察，肝细胞形态完整，以单个游离肝细胞存在。 三、讨论 和大鼠相比，利用乳猪作为肝细胞来源能提供更多的肝细胞，更适合于实验研究的应用，而且和成熟肝细胞比较，乳猪肝细胞富含肝细胞再生刺激因子（包括肝细胞生长因子、肝源性肝细胞刺激物质及肝细胞生成素），这些因子能在肝细胞培养过程中修复分离时部分受损的肝细胞，从而提高了肝细胞的活性率。更有利于维持肝细胞的活性［3］，这对肝细胞的培养以及应用于生物人工肝比较有利。 利用含乙二胺四乙酸二钠平衡盐溶液较以往应用生理盐水灌洗，减轻了血细胞的聚集，更有利于祛除血管里的血细胞，使灌洗更充分、彻底，经腹主动脉进入的灌洗液一部分直接入肝，一部分经胃肠道系统循环后入门静脉达肝脏，符合肝脏的生理条件，对肝细胞起保护作用，经腹主动脉、门静脉双重灌洗，较单一血管灌流更均匀、彻底。 在肝细胞制备过程中维持37 ℃恒温及95%O2、5%CO2混合通气减少了细胞的代谢损伤，这对维持肝细胞的活性非常必要，充分洗涤可以除去残的胶原酶和细胞碎片，减少胶原酶对肝细胞的影响，特别是应用Willianms'E 培养液洗涤，提高肝细胞的存活率。 本研究结果表明，我们建立的原位胶原酶经腹主动脉、门静脉双重灌洗分离乳猪肝细胞能提供高产量、高活性的肝细胞。
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胰腺癌新生血管密度和血管内皮生长因子表达的研究
我们采用免疫组织化学染色及形态半定量方法对胰腺癌标本中的微血管密度（MVD）标记后定量计数和血管内皮生长因子（VEGF）表达强度进行研究，结果报道如下。 一、材料与方法 我院1980～1997年术前未经抗肿瘤治疗的胰腺癌切除标本31例，常规石蜡包埋，4 μm切片，苏木素-伊红染色，按分化程度病理分型，TNM分期。胰腺癌旁组织15例，正常胰腺组织7例作为对照。 免疫组织化学染色采用链菌素亲生物素-过氧化物酶标免疫组织化学染色技术(S -P)法。标记血管内皮细胞兔抗人第Ⅷ因子相关抗原(F8 -RA)及免疫IgG多抗血管内皮生长因子购自北京中山公司，在200倍视野下计算5个血管高密度区的MVD。以400倍视野下以着色细胞占视野细胞总数的比例及切片中癌组织着色细胞染色强弱判断VEGF的表达情况。以磷酸盐缓冲液代替第一抗体作为阴性对照。t检验，方差分析，秩和检验和相关分析。 二、结果 胰腺癌组织中MVD计数、VEGF表达率分别为11.05±4.62、83.3%，明显高于癌旁组织(5.40 ±1.71、20.0%)和正常胰腺组(6.19±1.56、14.2%)；淋巴结转移组MVD计数、VEGF表达分别为13.00±4.45、2.00±0.95，明显高于无转移组(9.46±4.15、1.05±0.17，P＜0.01) 和正常胰腺组(P＜0.01)；MVD计数、VEGF的表达与淋巴结转移组、肿瘤分化、T NM分期的关系差异无显著性(表1)；胰腺癌组织标本MVD计数和VEGF的表达呈正相关(r=0.418，P＜0.05)，其淋巴结转移组MVD计数与VEGF两者也呈显著相关性(r=0.657，P＜ 0.05)。 三、讨论 本实验结果显示，胰腺癌组织中MVD计数及VEGF表达明显高于癌旁组织及正常胰腺组织，淋巴结转移组中两者明显高于非转移组及正常对照组，但其与肿瘤分化程度、TNM分期差异无显著性（P＞0.05）。在胰腺癌中存在VEGF过度表达，而表达水平比表达本身更有意义。 本实验结果表明，胰腺癌标本MVD计数与VEGF的表达呈正相关，淋巴结转移组中，两者相关性更显著。因此，我们认为肿瘤细胞分泌VEGF，VEGF是主要血管新生诱导剂，是癌转移的重要血管形成因子，其表达增强与MVD计数密切相关，说明VEGF表达与血管新生部位一致，VEGF可能是在胰腺癌转移中起促进作用。因此，提示测定MVD计数与VEGF有助于判断胰腺癌的预后。VEGF及其受体可能成为抑制胰腺癌生长和防治胰腺癌淋巴结转移的生物靶点。
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药物干预对局灶性脑缺血-再灌注损伤影响的实验研究
我们采用大鼠局灶性脑缺血-再灌注模型，观察脑缺血-再灌注后免疫抑制剂甲基泼尼松龙 (MP)和非选择性腺苷受体激动剂2-CAdo对炎症反应的影响，现将结果报道如下。 一、材料与方法 健康成年SD大鼠81只，体重200～250 g，雌雄不限，随机分为假手术组(A组，18只)，生理盐水对照组(B组，21只)，MP治疗组(C组，21只)及2-CAdo治疗组(D组，21只)。采用改良线栓法制备大鼠局灶性脑缺血-再灌注模型。 C组缺血1 h再灌注即刻经舌下静脉注入MP(30 mg/kg体重)，D组缺血后即刻注入2-Cado( 12 ml/kg体重)。缺血1 h再灌注23 h后断头取脑。放射免疫法测定双侧皮质肿瘤坏死因子(T NF)-ɑ含量。硫代巴比妥显色法测定双侧皮质丙二醛(MDA)含量。视交叉平面后冠状切片，厚约2 mm，常规制备5 μm组织切片，选取第20张切片，在光镜下观察缺血侧皮质的典型微血管断面10个，计数每个微血管断面的附壁和浸润的嗜中性粒细胞，并计算其均数即为每只动物的附壁和浸润的中性粒细胞数。 不同组间比较采用方差分析，两样本比较采用t检验。 二、结果 1.脑皮质TNF-α含量变化见表1。 2.脑皮质MDA含量变化见表2。 3.脑缺血1 h再灌注23 h，微血管内嗜中性粒细胞聚集浸润［中性粒细胞数(个/ 视野)为25.40±2.31］，经MP及2-CAdo干预后,嗜中性粒细胞聚集浸润明显减少(C组为12.6 0±2.30，D组为11.30±1.24，P＜0.01)。 三、讨论 本实验结果表明，大鼠局灶性脑缺血1 h再灌注23 h，双侧皮质TNF-α及MDA含量明显增高，缺血侧含量更高。在微血管内出现嗜中性粒细胞的聚集浸润。 本研究结果还显示，MP及2-CAdo均能使局灶性脑缺血1 h再灌注23 h后皮质TNF-α表达降低,中性粒细胞的聚集浸润减少,炎症反应减轻。MP具有直接抗氧化作用，能阻止脂质过氧化反应，稳定细胞膜，减少血管活性物质的产生，减轻脑损伤。2-Cado可通过不同途径抑制TNF-α的表达，抑制过氧化物的产生，清除氧自由基，影响膜的通透性，发挥神经保护作用。
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细胞周期及生长调控因子在肝癌及正常肝组织中的表达
目的 了解肝癌中细胞周期及生长调控因子的表达概况，探寻其在肝癌与正常肝组织中的表达差异。[ HT5”H〗方法 以24例肝癌及癌旁正常肝组织的总RNA反转录合成含有α- 32 P dATP的cDNA 为探针，与Atlas微阵列表达分析膜进行差异杂交，并应用半定量逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)及印迹法(Northern)杂交验证。结果 在所分析的5 88种已知基因中，与细胞周期及生长调控相关的基因共有79个，其中TFDP-2、E2F-3、ERK 等 7个在肝癌组织中表达上调，MAPKK和CDK3表达下调。RT-PCR结果和Northern杂交的结果均证实了Atlas微阵列差异杂交的准确性。结论 通过Atlas微阵列较全面系统地研究肝癌的基因表达改变，这些基因的表达改变组成了一个肝癌特异的基因表达谱。一些与细胞周期及生长调控有关的差异表达基因为研究肝癌的发病机制及肝癌的发生、发展提供了有益的线索。
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FasL逆转录病毒转移体系的建立及其在肝癌细胞中的表达
目的 研究Fas/FasL系统的生物学功能，探讨转FasL基因治疗肿瘤的可行性。方法[ HT5”SS〗将大鼠FasL全长cDNA亚克隆到逆转录病毒载体pLXSN中，获得FasL正向单拷贝插入子pLXSN/FasL+,经PA317包装细胞包装，获得G418抗性克隆，命名为PA317/pLXSN-FasL +细胞。结果 聚合酶链反应扩增证实PA317/pLXSN-FasL + 细胞有外源性FasL基因整合；检测病毒滴度为4.7×107/L；病毒上清转染肝癌细胞株 HepG-2、SMMC-7721 、CBRH-7919 和 RH-35后，流式细胞仪检测肝癌细胞表面FasL分子表达的阳性率分别为97 .3%、99.1%、99.4%和72.3%，并证实Fas高表达细胞株HepG-2及CBRH-7919对FasL诱导的凋亡十分敏感。结论 将FasL基因导入逆转录病毒载体是一种行之有效的基因转移途径，可用来诱导Fas高表达细胞凋亡，为转FasL基因治疗肿瘤提供了依据。
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核糖体蛋白L26基因的克隆及其在肝癌中的表达
目的 克隆和分析与肝细胞癌发生发展相关的基因。方法 应用差异显示技术获得 24例肝癌及其癌旁组织表达差异的目标基因片段，对其进行克隆、测序，并在基因数据库中检索进行同源性比较，应用印迹法(Northern)杂交技术研究其正常组织分布和肝癌中表达的变化。结果 肝癌组织中获得一目标基因片段经测序证明其来源于一已知基因核糖体蛋白L26(RPL26)，Northern杂交分析表明该基因在各种组织中广泛表达，83.3%原发性肝癌患者癌组织中RPL26表达显著高于癌旁组织。结论 RLP26可能是肝癌进展的有用的生物学标志。
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nm23-H1基因和增殖细胞核抗原在肝癌组织中的表达及其与癌细胞DNA含量的关系
目的 探讨转移抑制基因nm23-H1在肝癌组织中的表达和癌细胞增殖及DNA含量间的关系。方法 应用免疫组织化学染色法检测56例肝癌组织标本中nm23-H1基因和增殖细胞核抗原(PCNA)的表达，应用图像分析系统测定癌细胞DNA含量，分析与肝癌病理生物学行为之间的关系。结果 nm23-H1表达阳性率无包膜组肝癌(29.6%)比包膜完整(64.3%)和包膜突破组肝癌(66.7%)明显减低(P＜0.05)。DNA指数(DI)与肝癌包膜情况、组织类型、组织分级也有显著相关性(P＜0.05)。nm23-H1表达阴性的肝癌P CNA标记指数（LI）高于nm23-H1阳性者（P＜0.05)；PCNA标记指数高增殖组肝癌D I值（2.30±0.90）较低增殖组肝癌DI值（1.86±0.7）明显增高（P＜0.05）。结论 nm23-H1表达与肝癌包膜形成具有一定关系，并与肝癌增殖活性相关。DNA含量测定结合PCNA免疫组织化学染色可较为准确的反映肝癌浸润侵袭特征和增殖活性。
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乙型肝炎病毒x基因上调肝癌细胞胰岛素样生长因子-Ⅱ胚胎启动子活性的研究
目的 研究乙型肝炎病毒x基因（HBx）对肝癌细胞胰岛素样生长因子-Ⅱ(IGF-Ⅱ)启动子活性的影响，探讨HBx基因影响肝癌恶性表型的分子机制。方法 应用定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测QGY7701肝癌细胞株和转HBx基因肝癌细胞株QGY/HBx的IG F-Ⅱ成年启动子P1与胚胎启动子P3、P4的活性。结果 与QGY7701 细胞相比，QGY/HBx细胞IGF-Ⅱ基因P1启动子活性无明显改变(分别为3.12±1.18与3.7 4±1.87，P＞0.05)，而P3与P4活性显著升高(2.27±0.68、3.97±1.66与1.20±0.39、 1.45±0.43比较，P＜0.05)。结论 HBx基因可上调肝癌细胞 IGF-Ⅱ基因胚胎启动子P3、P4活性，这可能HBx基因增强肝癌恶性表型的一个重要机制。
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裸鼠人肝癌原位移植多药耐药模型的建立及其耐药机制的探讨
目的 在体内建立人肝癌裸小鼠原位移植多药耐药模型，并研究其耐药机理。方法采用人肝癌（BEL-7402）裸小鼠（4～6周龄）原位移植，给予阿霉素(1.5 mg/kg体重，每周1次)腹腔注射诱导耐药（共8周），经四唑蓝(MTT)快速比色法检测原代培养的耐药细胞对抗癌药的敏感性，以流式细胞仪检测癌细胞表面mdr1基因产物P-糖蛋白（P-gp）的表达，并用罗丹明试验观察该蛋白功能。结果 移植瘤组织形态及生物学方面符合人肝癌特征，实验组肝癌细胞表面P-gp表达为(75.45±5.67)%，而对照组表达仅(4.25±1.28)%，差异有非常显著性（P＜0.01），对阿霉素的耐药倍数提高了16.67倍，对羟基喜树碱具有交叉耐受性（13.67倍）。耐药细胞表面P-gp有较强的药物外排功能。结论 阿霉素较易诱导原位移植于裸小鼠的人肝癌多药耐药性的产生，其耐药倍数与临床肝细胞癌相似。该模型的建立对研究肝癌多药耐药的产生机制以及逆转其多药耐药性具有重要价值。
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变性凝胶电泳和自动DNA序列分析检测结直肠肝转移癌p53基因突变的研究
目的 了解变性梯度凝胶电泳(DGGE)和自动DNA序列分析方法检测肿瘤基因变异及p53基因、p53蛋白在大肠癌发生、转移过程中的动态变化。方法 以DGGE及自动DNA序列分析法检测41例大肠癌原发病灶和肝转移灶p53外显子5～11的基因突变。以免疫组织化学方法检测p53蛋白表达。结果 41例中24例有p53基因突变(62%), 其中6例仅在肝转移灶发现p53基因突变，其余均为原发灶、转移灶有一致性的突变。另有3例原发灶即有p53基因突变的病人，在转移灶除保留原有突变外，还出现新增加的突变。在原发、转移灶同时有突变的16例中，14例呈现突变的p53碱基峰和正常峰之比在肝转移灶明显高于大肠癌原发灶(P＜0.001)。p53免疫组织化学染色结果和DGGE、DNA序列分析结果高度一致。但在基因分析呈无义突变的癌灶，免疫组织化学显示p53蛋白的过度表达。结论 在大肠癌肝转移过程中，p53基因突变主要开始于肠癌原发灶，并被保持于转移至肝脏的癌细胞内，在转移灶其含量或含突变型p53癌细胞量明显增加。p53基因突变与p53蛋白过度表达呈正相关关系。DGGE和自动序列分析法只有在于免疫组织化学方法结合使用时，才能对基因改变作出全面的判断。
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GPC3 mRNA在甲胎蛋白阴性肝癌中的表达及其意义
目的 探讨GPC3 基因在甲胎蛋白阴性肝癌中的变化及其临床意义。方法 应用印迹法(Northern)杂交检测48例肝癌组织及其相应的癌旁肝组织内GPC3 mRNA表达的变化，其中肝细胞癌41例、肝内胆管细胞癌4例、大肠癌肝转移2例和肝局灶性结节增生1例,并结合各组织标本的病理学特点进行分析。结果 41例甲胎蛋白阴性肝细胞癌中，有30例肝癌组织可测出GPC3 mRNA的表达（73.17%），而癌旁组织中均不表达。直径＞5 cm的大肝癌GPC3 的表达率显著高于直径≤5 cm的小肝癌，低分化肝癌GPC3 的表达率显著高于高分化的肝癌。GPC3 的表达与患者的年龄、性别、包膜完整性、癌栓形成、肝内转移及乙肝病毒感染状况均无明显相关性。GPC3mRNA在非肝细胞肝癌组织内均不表达。 结论 GPC3 mRNA在AFP阴性肝癌中特异性表达，可作为原发性肝癌的一个新的基因标志。GPC3mRNA在肝癌的发生发展中有重要作用。
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中华实验外科杂志2001年第18卷重点内容安排
本刊2001年第18卷各期重点内容如下： 第1期 泌尿外科 大肠外科 第4期 胰腺外科 胃外科第2期 肝癌外科 骨科第5期 胸心外科 男科学第3期 胆道外科 血管外科第6期 神经外科 外科基础
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我国实验外科应加强外科临床试验研究
根据流行病学的概念，临床试验（clinical trials）是用来评价药物、疗法和预防性干预措施效果的一种医学研究方法，属于实验性研究的范畴。正如我国现代外科开拓者之一曾宪九教授指出：临床试验“是在临床医疗工作中进行的，研究内容与临床医疗工作有直接关系，涉及如何通过研究去解决或改进临床工作中存在的实际问题，是与临床医疗工作密切结合进行的”。应用流行病学方法开展临床试验，对提高外科疾病的诊断、治疗、病因和预后研究的水平具有重要意义。因此，临床试验是临床医学进步的重要前提。 循证医学（EBM）尤其重视临床试验，其中心思想是负责、明确、明智地利用已有的好证据来指导临床实践。要求任何临床医疗决策的制定，都应基于客观的科学研究依据，这些依据必须能够证明某种诊疗手段的有效性及在成本-效益比上的合理性。 近20年来，我国实验外科取得了长足的进步，成绩有目共睹，但也存在一些问题应引起重视。问题之一就是临床试验研究相对滞后，其高质量的成果不多，许多领域甚至还是空白。在中华实验外科杂志发表的论文中，强调临床的人体试验较少，多数为动物实验、体外实验、实验室研究。尽管有些论文已达到分子或基因水平，但多属于发病机制的探讨或动物实验的推论。诚然，许多试验不能直接在人体上进行，开展适宜的动物实验是理所当然的。但动物实验有许多局限性，其中主要的问题是动物与人体相差较大，不能将其所得结论直接推广至人体，因此必须要进行临床试验研究。大力提倡和开展临床试验，将促进我国实验外科和整体医学的发展，并直接造福于广大患者。 一、如何选择临床试验的课题 确定研究课题是开展临床试验的关键，任何临床试验必须要有明确的研究目的，即首先要正确地发现和提出问题。设立课题和提出假设是难度很大的工作。首先，课题或立题要有临床价值和临床意义，故应将国家的需要放在首位，重点研究危害我国人民健康的常见病、多发病，以及对国计民生有重大影响的课题。1993年国际上出现“全球疾病负担”的概念，其测量单位就是伤残调整生命年（disability-adjusted life years, DALYs）。DALY是由疾病死亡和疾病伤残而损失的健康生命年的综合测量，可作为选题的参考资料。 课题要密切联系临床实际，有实用价值，这就要求研究人员应具有丰富的临床经验和大量的感性认识，同时要有好奇心和想象力，才能产生灵感和直觉，并抓住机遇和闪念。裘法祖教授提倡“在临床实践中发现问题，提出问题，再通过思考，采取正确的方法和不同的手段去研究问题、解决问题”。也就是说通过临床试验，实现实践、认识、再实践、再认识和提高认识的目的。 选题和立题还要求掌握足够的医学基本知识和基础理论，从而有利于发现问题和寻找解决问题的途径。同时要有丰富的信息资料，掌握国内外相关研究的新动态，从中得到启发和借鉴。现代医学不仅分工更细，同时也相互渗透和交叉，其基本理论和技术往往是通用的。如高血压病和门静脉高压症是完全不同的两个病，但都属于血管性疾病，应用分子血管生物学的方法可发现两者均有血管平滑肌细胞的表型改变、内膜增生、血管壁的构形改建等。课题应具有一定的创新，要选择医疗工作中尚未解决或没有完全解决的问题，避免在低水平简单重复别人的研究。要坚持自己的特点，明确研究方向以后，应由浅至深、持之以恒地进行系列性研究，频繁地更换课题是不可取的。 课题应具有科学性，所提出的临床问题和假设应符合客观规律，不仅要有现代医学理论支持，还应有正确的世界观和方法论，决不可掺杂非科学和伪科学的成分。在学术上应允许存在不同意见，要发扬百花齐放、百家争鸣的方针，敢于坚持真理，乐于纠正错误。 课题应具有可行性，这包括经济和技术两方面的可行性，必须考虑到完成课题的条件，是否具有必要的人力、财力和物力等。
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阻断第二信号诱导骨移植后对淋巴细胞亚群的抑制作用
目的 研究细胞毒性T淋巴细胞相关抗原(CTLA4Ig)对新鲜同种异体骨移植后血淋巴细胞亚群的影响。 方法 在组织相容性抗原完全不同的两组小鼠间进行异位骨移植，于移植后第0、1天，腹腔注射CTLA4Ig 100 μg，分别于术后2、4、6周取受体外周血，利用流式细胞仪技术测定血淋巴细胞亚群CD4和CD8。结果 术后第2周，骨移植对照组CD4亚群(64.26±5.69) 和CD4/CD8比值(4.98±0.59)较同系对照组(49.50±2.32，6.96±0.57)明显升高(P＜0.01，P＜0.05)，术后第4周,骨移植对照组CD4亚群(62.48±3.78) 较同系对照组(54.51±3.44)仍明显升高(P＜0.05),术后第6周时，各组间淋巴细胞亚群差异已无显著性(P＞0.05)；同种异体骨移植后注射CTLA4Ig组(第2周53.37±4.17, 第4周55.37 ±3.06)与注射对照剂组(第2周64.26±5.69，第4周62.48±3.78)比较，CTLA4Ig明显抑制了 CD4亚群的增殖(P＜0.05)，与同系骨移植组相似。结论 利用CTLA4Ig阻断第二信号，显著抑制了新鲜同种异体骨移植产生的细胞免疫反应。
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股骨髁间窝的应用解剖及其临床研究
目的 探讨如何完善髌韧带中1/3重建前交叉韧带术式，防止重建韧带撞击现象的发生。方法 测量42侧和73侧正常干、湿性股骨髁间窝标本的横径、纵径及其相关值；通过对湿性膝关节标本股骨髁间窝与前交叉韧带和重建韧带解剖关系的观测，确定膝关节伸展时髁间窝与韧带发生撞击的部位。在髌韧带中1/3重建前交叉韧带的模拟和临床手术中，切除股骨髁间窝前外侧壁及顶部部分骨质，加宽加深髁间窝，保持重建韧带与其有5 mm间距。结果 临床应用19例中随访1年以上者11例，无1例出现重建韧带撞击现象，膝关节稳定性恢复良好。结论 股骨髁间窝扩大成形能有效地防止髁间窝对髌韧带的撞击，保证其顺利地替代前交叉韧带的功能。
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膝关节周围动脉为蒂骨膜(骨)瓣的应用解剖及临床意义
目的 为带蒂骨膜(骨)瓣移位治疗膝关节周围骨不连、骨缺损提供解剖学依据。方法 在30侧经动脉灌注的成人下肢标本上，观察并测量膝关节周围动脉网有关血管的起始、走行、口径、分布及其吻合情况。结果 膝关节周围存在着丰富的血供，其主要由月 国动脉、股动脉、胫前动脉、胫后动脉的终末支及相互间的交通支和吻合网恒定构成。结论 以膝关节周围动脉为蒂的骨膜(骨)瓣，是进行局部转位和吻合血管游离移植的重要供区之一。
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人体骨盆生物力学三维光弹性的实验研究
目的 研究人体正常骨盆和髋臼发育不良骨盆的生物力学特征。方法 依据光弹性力学原理，应用光敏材料E-51环氧树脂制作人体骨盆三维光弹模型共4套，模型加载，应力冻结，测量分析骨盆的应力分布及形态改变。结果 人体双腿站立时，正常及髋臼发育不良骨盆环的应力集中在I7、I8、S4、A1、A2等处；髋臼发育不良时髋臼内壁应力异常集中于髋臼上缘，A1∶A4 =6∶1。负重后正常骨盆髋臼外口呈“椭圆形”改变。结论 人体骨盆应力分布复杂；人体双腿站立负重时髋臼可发生形态改变；髋臼发育不良时髋臼应力分布不均导致髋关节骨关节炎的发生。
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人骨形态发生蛋白4成熟肽在大肠杆菌中的表达及其活性测定
目的 利用基因工程技术表达人骨形态发生蛋白4(hBMP4),为深入研究其结构、诱骨机理及临床应用将起积极作用。方法 应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术,扩增出hBMP4成熟区基因,将其克隆于表达载体pBV220的 PRPL启动子下游。分别经随机挑选、限制性内切酶酶切鉴定及十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）筛选证实得到5株重组质粒pBV/BMP4的转化菌株,以非融合蛋白形式表达了hBMP4。结果 SDS-PAGE显示,此蛋白相对分子量为14,表达量占菌体蛋白的15.6%；细胞培养碱性磷酸酶(ALP)活性测定证明,细胞分泌ALP的活性与rhBMP4浓度呈剂量依赖关系。[ HT5”H〗结论 hBMP4在大肠杆菌中的表达产物复性后具有生物学活性,确证为h BMP4蛋白。
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神经端侧吻合术与侧侧吻合术对神经干损伤后功能恢复作用的比较
目的 比较神经端侧吻合与神经侧侧吻合后功能恢复作用的差异。方法 将Wist ar 大鼠18只分成A、B两组，每组9只。端侧吻合组：左侧腓总神经切断并在胫神经干上外膜开窗后，与胫神经主干作端侧吻合；侧侧吻合组：左侧腓总神经切断后与胫神经作侧侧吻合。术后3个月，行形态学检查、电生理检查、肌湿重检查及图像分析，评价神经再生及肌肉功能恢复的情况。结果 神经端侧吻合组和神经侧侧吻合组神经纤维的数目分别为732.8±53.4、712.5±58.4 ，其截面积分别为（712.5±58.4）μm2、（182.3±39.7）μm2，神经的传导速度分别为（25.6±8.3） m/s、（18.5±9.8） m/s，胫前肌肉的湿重两组分别为（205.6±20. 7） mg、（201.8±21.3） mg，肌纤维的面积分别为(1 320.6±103.9) μm2、(1 40 3.7±138.4) μm2，再生的运动终板面积分别为（1 537.5±527.8）μm2、（1 774.2 ±458.7）μm2，吸光度值为0.42±0.15、0.55±0.17，所有测量值差异无显著性(P＜0.05）。结论 神经端侧吻合术与神经侧侧吻合术的功能恢复差异无显著性。
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β-葡萄糖醛酸酶前药对βG基因转染人胆管癌细胞的作用
目的 探讨βG基因/β-葡萄糖醛酸苷酶(β-G)前体药系统对人胆管癌细胞株QBC939的抑制作用。方法 构建真核表达的逆转录病毒载体pDOR-βG，利用阳离子脂质体将其转入人胆管癌细胞株QBC939，检测其表达及β-G前体药对转基因细胞的增殖阻断作用。结果 经G418筛选后的阳性细胞克隆，为高表达βG的胆管癌模型。免疫组织化学、免疫荧光、原位杂交等证实了pDOR-βG在转基因细胞中的表达；四唑蓝（MTT）比色试验测定β-G前体药对QBC939-pDOR-βG细胞有显著的抑制增殖作用，β-G前体药浓度为0.292 g/L时，其抑制率为67.6%。QBC939-βG组与对照组比较差异有非常显著性（P＜0.01）。结论 βG基因/β-G前体药系统是一种新的自杀基因系统，可作为胆道肿瘤基因治疗的一种新方法。
| 年 | 期数 |
| 2019 | 01 02 |
| 2018 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2017 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
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| 2000 | 01 02 03 04 05 06 |
| 1999 | 01 02 03 04 05 06 |
| 1998 | 01 02 |
