中华实验外科杂志
Chinese Journal of Experimental Surgery 중화실험외과잡지
- 主管单位: 中国科学技术协会
- 主办单位: 中华医学会
- 影响因子: 0.75
- 审稿时间: 1-3个月
- 国际刊号: 1001-9030
- 国内刊号: 42-1213/R
- 论文标题 期刊级别 审稿状态
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全反式维甲酸对肝癌干细胞分化的影响
目的 观察全反式维甲酸(ATRA)对HepG2/CD133+肝癌干细胞的分化效果.方法 ATRA以不同浓度(1×10-9~1 ×10-5 mol/L)加入到干细胞培养基,培养5d后,用流式细胞技术检测肝癌干细胞标志物CD133抗原表达变化,分别用实时荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)法和Western blot法检测肝癌干细胞中胚胎干细胞标志物性别决定区Y框蛋白2(Sox2)、八聚体结合转录因子(Oct4)、永生基因(Nanog) mRNA及蛋白的表达,用噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖能力水平的变化.结果 HepG2/CD133+细胞比例随着全反式维甲酸浓度升高而降低,从(90.81 ±0.48)%分别降低至(90.23±0.37)%、(89.77 ±0.41)%、(88.65±0.29)%、(84.92±0.35)%和(79.6±0.27)%;1×10-6mol/L ATRA浓度Oct4 mRNA水平明显低于空白对照组(P=0.037),Sox2、Nanog组间比较差异无统计学意义(P =0.067、0.229);3种标志物的蛋白表达水平均出现下降,其中Sox2和Nanog出现了显著的降低;细胞增殖活性在1、2、3、5d出现略微的上升,并未出现显著性升高(P =0.562、0.318、0.863、0.444).结论 肝癌干细胞在全反式维甲酸处理后,干细胞特性显著降低.全反式维甲酸在一定浓度范围内的不同浓度下可诱导分化肝癌干细胞,浓度越高,分化作用越强.
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长链非编码RNA HOX转录反义RNA通过影响微小RNA-101的表达影响食管癌细胞的生物学行为
目的 观察长链非编码RNA HOX转录反义RNA(lncRNA HOTAIR)在食管癌中的表达以及对细胞生物学的影响.方法 实时荧光定量核酸扩增检测系统(FQ-PCR)检测lncRNA HOTAIR在食管癌组织和癌旁正常组织中的表达差异,细胞计数检测实验(CCK-8)实验检测lncRNA HOTAIR对食管癌细胞增殖能力的影响,细胞侵袭实验(Transwell)实验检测lncRNA HOTAIR对食管癌细胞侵袭能力的影响;流式细胞术检测lncRNA HOTAIR对食管癌细胞凋亡的影响;体内实验检测lncRNA HOTAIR对食管癌细胞裸鼠成瘤的影响;双荧光素酶报告验证lncRNA HOTAIR与微小RNA(miRNA,miR)-101的相互作用关系.结果 食管癌组织中lncRNA HOTAIR的表达显著高于癌旁正常组织[(1.95±0.12)比(1.25 ±0.13),P=0.031],lncRNA HOTAIR能促进食管癌细胞的增殖能力[(118.4±7.5)比(52.0±6.2),P=0.021]、侵袭能力[(126.4±13.4)比(75.6±8.7),P=0.008],抑制食管癌细胞的凋亡,下调lncRNA HOTAIR能减弱食管癌细胞在裸鼠体内的增殖[体积(0.5 ±0.1) cm3比(2.0±0.3)cm3,P=0.016,质量(0.6±0.2)g比(1.5±0.2)g,P=0.022],miR-101可以直接与lncRNA HOTAIR结合位点结合并影响荧光素酶活性.结论 lncRNA HOTAIR通过调控miR-101的表达促进食管癌细胞的恶性生物学行为的发生.
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臂丛神经损伤后脊髓神经元脑衰反应调节蛋白2表达上调以加快轴突生长
目的 观察臂丛神经损伤后大鼠脊髓中脑衰反应调节蛋白2(CRMP2)的表达及其作用.方法 构建臂丛撕脱伤大鼠模型,收集损伤后1、3、7、10d大鼠脊髓标本,使用实时定量反转录聚合酶链反应(RT-qPCR)及Western blot方法检测CRMP2的表达变化及磷酸化水平.使用免疫荧光法检测CRMP2在脊髓中的空间表达.在体外培养的神经元中观察调控CRMP2表达对神经元突起生长的影响.结果 在臂丛撕脱伤后第1、3、7、10天,RT-qPCR及Western blot法检测均显示脊髓中CRMP2表达明显增加.Western blot法检测显示术后第3、7天实验组磷酸化CRMP2的表达量为0.154±0.113、0.124±0.200,Sham组磷酸化CRMP2表达量为0.342±0.200、0.434±0.165.实验组较Sham组磷酸化水平明显降低.CRMP2表达于脊髓神经元中,在小胶质细胞及星型胶质细胞中未观察到其表达.在体外培养的神经元中调控CRMP2表达,测得神经元的轴突长度及突起数目在上调组为7.066±1.762、24.500±8.816,下调组为1.044±0.556、8.000±3.295.上调组较下调组明显增加.结论 臂丛神经损伤后,脊髓神经元CRMP2表达增加能够加快神经轴突生长,对神经功能恢复有利.
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十二指肠空肠旁路术对糖尿病大鼠肠道激素及肝脏内质网应激的影响
目的 建立糖尿病大鼠模型,并实施十二指肠空肠旁路术(DJB),观察DJB对糖尿病大鼠肠道激素及肝脏内质网应激的影响.方法 选购清洁级SD成年雄性大鼠58只,以高脂饮食喂养联合腹腔注射小剂量链脲佐菌素建立糖尿病大鼠模型,对建模成功的大鼠实施DJB(DJB组)及假手术(假手术组),以普通大鼠作为空白对照(空白对照组).分别检测3组大鼠肠道激素、胰岛素.两组术后大鼠肝脏内质网应激指标[p-双链RNA依赖性蛋白激酶样内质网蛋白激酶(p-PERK)、肌醇需求激酶-1(IRE-1)、p-IRE-1]、肝脏组织中[总c-Jun氨基末端激酶(JNK)蛋白、p-JNK蛋白]、肝脏组织中胰岛素受体底物-1(IRS-1)蛋白以及p-IRS-1 ser307蛋白的表达变化.结果 灌胃前,3组大鼠胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、抑胃肽(GIP)、胰岛素(INS)水平比较,差异无统计学意义(F=0.04、2.708、0.002,P=0.996、0.079、0.998);灌胃30 min后,DJB组及对照组GLP-1、GIP、INS水平均高于假手术组,差异有统计学意义(F=33.692、18.657、16.393,P=0.000).术后16周DJB组小鼠p-PERK、p-IRE-1、p-JNK、p-IRS-1 ser307与术前比较,差异有统计学意义(t=10.507、12.606、9.163、14.603,P=0.000);IRE-1、JNK、IRS-1与术前比较,差异无统计学意义(t=1.295、1.863、1.675,P=0.205、0.072、0.104);相对于假手术组来说,DJB组改善良好.结论 DJB能够有效改善高脂饮食喂养联合腹腔注射小剂量链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠肠道激素及胰岛素水平,缓解内质网应激.
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沉默p21活化激酶1对肝癌细胞的影响及其机制
目的 观察小干扰RNA (siRNA)沉默P-21活化激酶1(PAK1)基因对肝癌细胞的增殖、凋亡及迁移和侵袭能力的影响及其分子机制.方法 设计合成针对PAK1的特异性siRNA(siPAK1)和通用无义siRNA序列,转染肝癌细胞,分为siPAK1组和NC组,通过实时定量聚合酶链反应(Real-time PCR)技术和Western blot法检测肝癌细胞中PAK1的表达;利用细胞计数试剂盒(CCK-8)、流式细胞仪、细胞划痕实验和Transwell侵袭实验,分别检测其对肝癌细胞生物学特性的影响;利用Western blot检测肝癌细胞中磷酸化的细胞蛋白调节激酶1/2 (p-ERK1/2)、B细胞淋巴瘤/白血病-2(bcl-2)和细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)分子的蛋白表达量.结果 转染siPAK1能明显抑制肝癌细胞中PAK1的表达;沉默PAK1基因能明显减少肝癌细胞的增殖[NC组:Hep3B(100.00±0.00)%,SMMC-7721(100.00±0.00)%;siPAK1组:Hep3B(30.35±3.44)%,SMMC-7721(41.76±5.91)%(PHep3B=0.018,PSMMC-7721 =0.022)]、促进肝癌细胞凋亡(PHep3B=0.004,PSMMC-7721 =0.006)并且抑制其迁移(PHep3B=0.028,PSMMC-7721 =0.018)和侵袭(PHep3B=0.012,PSMMC-7721 =0.006)的能力;沉默PAK1基因可抑制肝癌细胞中p-ERK1/2、bcl-2和Cyclin D1分子的蛋白表达量.结论 沉默PAK1基因可通过PAK1/ERK通路促进肝癌细胞凋亡,并抑制肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力.
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阿帕替尼通过抑制上皮-间充质转化阻遏肝癌细胞侵袭和转移的研究
目的 观察抗血管生成靶向药物阿帕替尼对肝癌细胞侵袭转移的影响,探讨其机制.方法 将肝细胞癌细胞株SMMC-7721分为对照组和阿帕替尼处理组,观察细胞形态学变化;通过细胞计数试剂盒(CCK-8)试验观察阿帕替尼对SMMC-7721细胞增殖的影响;划痕实验观察阿帕替尼对SMMC-7721细胞侵袭能力的影响;Transwell试验观察阿帕替尼对SMMC-7721细胞转移能力的影响;实时定量聚合酶链反应(Real-time PCR)和Western blot检测上皮-间充质转化(EMT)相关基因CDH1、CDH2、TJP1、VIM、E盒结合锌指蛋白1(ZEB1)、CLDN1、SNAI2、SNAI1、CTNNB1的表达变化.结果 阿帕替尼处理后SMMC-7721细胞发生上皮表型的改变,增殖、侵袭和转移能力均降低.Real-time PCR和Western blot结果显示经阿帕替尼处理后,SMMC-7721细胞中E-钙黏蛋白(E-cadherin)和ZO-1蛋白表达升高,N-cadherin、波形蛋白(Vimentin)、ZEB1、Slug表达降低,差异有统计学意义(CDH1,P=0.000;TJP1,P=0.002;CDH2,P=0.017;VIM,P=0.006;ZEB1,P=0.045;SNAI2,P=0.000).结论 阿帕替尼可抑制SMMC-7721细胞由上皮表型向间质表型转化(EMT),进而抑制肝癌细胞的侵袭和转移能力.
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两种培养法对人肝癌细胞株SMMC-7721细胞的影响
目的 观察对比贴壁培养法与悬浮培养法培养后的人肝癌细胞株SMMC-7721细胞相关特性的变化.方法 (1)收集采用普通培养基贴壁培养与无血清培养基悬浮培养的人肝癌细胞株SMMC-7721细胞.(2)观察两种方法培养后肿瘤细胞的形态学特征.(3)流式细胞仪检测两种方法培养后的肿瘤细胞中肿瘤干细胞表面标志CD90、CD133、CD24的各自表达量.(4)采用实时定量聚合酶链反应(Real-time PCR)检测两种方法培养后的肿瘤细胞中肿瘤干细胞表面标志CD90、CD133、CD24对应的mRNA相对表达量.(5)将两种方法培养后的肿瘤细胞各自注射到不同的裸鼠皮下,观察并记录种植瘤的体积变化,依此比较两种方法培养后肿瘤细胞的成瘤能力及增殖能力.结果 倒置显微镜下观察到贴壁培养的SMMC-7721肿瘤细胞呈铺路石样生长,排列规整.而悬浮培养后肿瘤细胞逐渐由单细胞聚集、增殖成球状或类球状.流式细胞检测悬浮培养组中CD90、CD24的表达量(571.77±8.70、233.56±10.85)明显高于贴壁培养组(19.15±0.54、17.37±0.15)(CD90:P =0.000:CD24:P =0.000),但CD133在悬浮培养组与贴壁培养组中的表达量(1.42±0.61、1.48±1.09)比较差异无统计学意义.Real-time PCR结果同样显示,若贴壁培养组mRNA的表达量设定为1,悬浮培养后细胞肿瘤表面标志物CD90、CD24的mRNA相对表达量(1.72±0.19、1.72±0.19)明显高于贴壁培养组(CD90:P =0.020,CD24:P =0.000),而CD133的mRNA相对表达量两组间比较差异无统计学意义(1.05±0.03,P=0.080).测量裸鼠皮下种植瘤体积大小变化显示随着时间的延长,悬浮培养组所致的皮下肿瘤体积变化趋势呈从开始注射到注射后6d为减小,6d后大幅增高;贴壁培养组所致的皮下肿瘤体积变化趋势则呈缓慢减小后趋于稳定,提示悬浮培养后的肿瘤细胞成瘤及增殖能力更强.结论 对人肝癌细胞株SMMC-7721而言悬浮培养法可获得更多的肝癌干细胞样细胞.
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长链非编码RNA牛磺酸上调基因1对人神经母细胞瘤侵袭和转移能力的影响
目的 观察长链非编码RNA (lncRNA)牛磺酸上调基因1(TUG1)对人神经母细胞瘤侵袭和转移能力的影响.方法 神经母细胞瘤SK-N-SH细胞分为3组:TUG1小干扰RNA(si-TUG1)组、乱序对照小于扰RNA(si-NC)组和空白对照组.将TUGI-siRNA在阳离子脂质体Lipofectamine 2000的介导下,瞬时转染入神经母细胞瘤细胞株SK-N-SH,实时定量聚合酶链反应(Real-time PCR)检测3组细胞中TUG1表达水平;划痕实验和Transwell小室实验检测瘤细胞迁移和侵袭能力.结果 TUG1-siRNA转染神经母细胞瘤后,TUG1 mRNA表达下调.与对照组比较,si-TUG1组细胞迁移能力下降,细胞侵袭能力下降50.4.%(P=0.001).结论 TUG1在神经母细胞瘤细胞中高表达,且能促进瘤细胞的侵袭和转移能力.
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下调微小RNA-21表达在人甲状腺乳头状癌细胞增殖与凋亡的作用
目的 探讨下调微小RNA(miRNA,miR)-21表达在人甲状腺乳头状癌(PTC)细胞增殖与凋亡中的作用.方法 miR-21抑制试剂(抗miR-21)瞬时转染PTC-1细胞(转染组),同时设立阴性对照组.采用实时定量反转录聚合酶链反应(RT-qPCR)检测PTC-1细胞中miR-21表达,噻唑蓝(MTT)比色法分析PTC-1细胞增殖的变化,流式细胞术分析转染后PTC-1细胞凋亡的变化,Western blot分析测细胞凋亡增殖相关的B淋巴细胞瘤-2(bcl-2)、bcl-2相关蛋白X(bax)的表达.结果 转染组PTC-1细胞miR-21表达明显低于对照组(P=0.013);下调miR-21表达后,PTC-1细胞增殖明显下降(P=0.001),且转染组PTC-1细胞凋亡率明显高于对照组(P=0.030);转染组PTC-1细胞bcl-2蛋白表达较对照组显著降低(P =0.036),而bax蛋白表达较对照组显著升高(P=0.001).结论 下调miR-21表达,能够明显降低PTC-1细胞增殖能力并促进细胞凋亡.
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脐带间充质干细胞靶向介入治疗兔腹主动脉损伤对管腔狭窄程度及中膜表达α-平滑肌肌动蛋白的影响
目的 观察脐带间充质干细胞移植对兔腹主动脉损伤后血管内膜、中膜及管腔狭窄程度的影响.方法 将20只新西兰雄性大白兔分为对照组和试验组2组,每组10只,两组均采用球囊扩张损伤腹主动脉法制作兔腹主动脉损伤模型.实验组兔将1×107个/kg脐带间充质干细胞从球囊导管交换导丝侧孔注入兔腹主动脉血管损伤处.对照组采用同样方法注射等量生理盐水.4周后处死兔,取兔腹主动脉血管组织行石蜡切片,测量血管内膜厚度(IT)、内膜面积(IA)、血管中膜厚度(MT)及面积(MA)及狭窄程度,比较两组兔血管中膜α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达水平的差异.结果 对照组IT[(1.63±0.29) mm比(0.68 ±0.11) mm,t=9.680,P=0.000]、IA[(4.11 ±1.23) mm2比(1.42±0.56) mm2,t =6.290,P =0.000]、MT[(2.31±0.47) mm比(1.88±0.31) mm,t=2.420,P=0.026]及MA[(6.32±1.66) mm2比(4.02±1.06) mm2,t=3.690,P=0.002]显著高于实验组;对照组狭窄程度(72.2±8.4)%显著高于实验组(35.0±8.6)%,差异有统计学意义(t=9.790,P=0.000);光镜下α-SMA蛋白程棕褐色颗粒,对照组阳性率为0.12±0.04显著低于实验组0.48±0.05,且差异有统计学意义(t=17.780,P=0.000).结论 人脐带间充质干细胞移植能显著降低兔腹主动脉损伤后管腔狭窄程度,并促进血管中膜α-SMA表达.
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应激诱导磷酸化蛋白1调控分化抑制因子3表达在胃癌细胞上皮-间充质转化及侵袭迁移过程中的作用及其机制
目的 观察应激诱导磷酸化蛋白1(STIP1)通过调控分化抑制因子3(ID3)的表达在胃癌细胞上皮-间充质转化及侵袭迁移过程中的作用并探讨其机制.方法 Western blot和实时定量反转录聚合酶链反应(RT-qPCR)法检测胃癌细胞(BGC803)和正常胃黏膜细胞(GES-1)2株细胞中STIP1、ID3的mRNA及蛋白的表达.转染STIP1过表达载体和小干扰RNA (siRNA)感染序列至胃癌细胞,检测STIP1和ID3的表达.细胞计数试剂盒(CCK-8)法检测细胞增殖活力,Transwell检测细胞迁移及侵袭,Western blot检测上皮型钙黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)的表达,并与阴性转染细胞比较.结果 STIPl mRNA和蛋白在BGC803的相对表达量分别为1.851±0.058,2.033±0.107,明显高于GES-1中的1.000±0.034,1.000±0.031(t=21.924,P=0.000;t=16.061,P=0.004).ID3 mRNA和蛋白在BGC803的相对表达量分别为1.629±0.063,2.374±0.096,明显高于GES-1中的1.000±0.025,1.000±0.029(t=16.074,P=0.004;t=23.731,P=0.002).转染STIP1过表达载体后ID3 mRNA的相对表达量为2.018±0.124,较对照组1.331±0.036(t =9.216,P=0.012)明显升高;转染48 h和72 h后细胞增殖水平明显高于对照组(t=10.594,P=0.002;t=8.269,P=0.004);侵袭细胞数、迁移细胞数较对照组明显增加(t=5.669,P=0.011;t =5.265,P=0.013);Vimentin的表达明显升高(t=7.410,P=0.005),E-cadherin明显降低(t=-5.821,P=0.010).转染STIP1 siRNA感染序列后ID3 mRNA的相对表达量为0.732±0.037,较对照组的1.252±0.051明显降低(t=-14.295,P=0.001);转染48 h、72 h后细胞增殖水平明显低于对照组(t=-19.851,P=0.000;t=-19.222,P=0.008);侵袭细胞数、迁移细胞数较对照组明显减少(t=-5.822,P=0.010;t=-4.859,P=0.017);Vimentin的表达明显降低(t=-6.244,P=0.008),E-cadherin明显升高(t=7.697,P=0.005).结论 STIP1调控ID3表达促进胃癌细胞增殖、侵袭、迁移和上皮-间充质转化.
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混合型生物人工肝的体外功能
目的 设计一种新型混合型生物人工肝(HBAL)并通过对模拟肝衰竭血清的净化作用评价其疗效,探讨其临床应用的可行性.方法 选用中国人肝细胞株-1(CL-1)作为肝细胞供体,在微重力环境下,肝细胞微载体共培养方法培养至第5天,细胞总量约4.0×109个,细胞密度约为4.0×1010/L,在无菌环境下灌人自制生物反应器中,制成生物部分,非生物部分采用血液灌流+胆红素吸附,生物部分和非生物部分通过两套聚乙烯胶管构成一个封闭的环路,监测模拟肝衰竭血清中未结合胆红素、鹅去氧胆酸,胆酸、血氨经过HBAL循环后浓度的变化以及生物反应器中肝细胞功能、形态及肝细胞活性的变化.结果 整个治疗过程中循环前24h内,模拟肝衰竭血清中未结合胆红素(UBD)、鹅去氧胆酸(CDCD),胆酸(CA)和血氨(AA)的浓度分别从(335.3±6.0)、(395.0±5.6)、(155.7±4.5)、(39.0±2.6)μmol/L下降至(106.0±10.9)、(131.8±28.7)、(42.2±7.3)、(3.5±1.0)μmol/L,与0h比较差异有统计学意义(P=0.041),24h后浓度下降趋于平稳;循环48h后,CL-1细胞功能发生变化,生物反应器中模拟肝衰竭血清中的谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、乳酸脱氢酶(LDH)分别从(25.9±4.2)IU/L、(22.0±3.6) IU/L、(0.28±0.09) μmol/L升高至(31.0±2.6) IU/L、(31.6±8.0)IU/L、(0.41 ±0.12) μ.mol/L,与0h比较差异有统计学意义(P=0.027);并且整个反应器中肝细胞的数量和活力在循环48 h后也呈现显著性下降(P=0.044).结论 (1)构建了一种新型灌流型生物反应器,该生物反应器中的CL-1细胞能够保持较高的活性和良好的功能.(2)新型混合生物型人肝可以显著降低模拟肝衰竭血清中的未结合胆红素、鹅去氧胆酸,胆酸、血氨的浓度,具有清除这些毒性物质的功能,提示其具有明显的肝功能支持作用.
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消退素D1对荷结肠癌裸鼠体重、血液炎症细胞因子水平的影响及其对肿瘤的作用
目的 探讨消退素D1(RvD1)对荷结肠癌裸鼠体重、血液主要炎性因子水平的影响及其对肿瘤的作用.方法 将6~8周龄体重18 ~20 g的裸小鼠分为RvD1+肿瘤接种组、生理盐水+肿瘤接种组、空白对照组(n=6).SW480结肠癌细胞接种后1周进行RvD1及生理盐水尾静脉注射,1w后采血并切取全部肿瘤组织,检测血液内的炎症细胞因子水平,检测肿瘤的大小、总重量及肿瘤内凋亡、坏死和活性细胞的比率.每2d记录大鼠的体重.结果 实验周期内动物的体重分别为:空白对照组(26.9±4.2)g,生理盐水组(22.7±2.6)g,RvD1干预组(22.7±2.1)g.与空白对照组比较,接种肿瘤的两组在皮下种植肿瘤后6~7d小鼠体重开始下降,至实验终点时明显.与生理盐水组比较,RvD1干预后的小鼠体重下降趋势得到改善,在9-14d期间为明显.与空白对照组比较,生理盐水组炎症细胞因子水平明显升高,而RvD1干预1w后,炎症细胞因子水平明显下降,除白细胞介素(IL)-10外差异均有统计学意义.接种肿瘤的裸鼠均在皮下形成实体瘤,肿瘤大小(14.3±1.2) mm,平均肿瘤重量(0.24 ±0.03)g;使用RvD1干预后,肿瘤体积缩小为(9.4±0.9) mm,重量明显减轻为(0.17±0.02)g,两者差异有统计学意义(P=0.001).生理盐水组和RvD1干预组的肿瘤组织内凋亡细胞的比例分别为(18.9±3.4)%比(45.3±4.9%),坏死细胞的比例分别为(29.7±7.5)%比(17.1±1.4%),活性细胞比例为(51.4±8.2)%比(37.6±5.3%).比较生理盐水组,RvD1干预后肿瘤组织内,凋亡细胞的比例明显上升(P=0.001),坏死细胞比例明显下降(P =0.002),活性细胞比例明显下降(P =0.006).结论 与生理盐水比较,RvD1能通过抑制荷结肠癌裸鼠体内的炎症细胞因子水平,提高肿瘤组织内凋亡细胞,降低坏死细胞比例,使活性肿瘤细胞比例下降,减小平均肿瘤体积和重量,并使动物的体重下降趋势得到改善.
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新生大鼠胰腺来源干细胞的分离培养与鉴定
目的 从新生大鼠胰腺分离出一种胰腺干细胞,并对其进行初步鉴定.方法 采集大鼠胰腺,5.5 mg/mlⅣ型胶原酶消化,用含10%胎牛血清(FBS)的RPMI1640培养基培养,首次传代时利用差速贴壁分离上皮样细胞和成纤维样细胞.多次纯化上皮细胞,细胞密度为80%进行传代.对第4代的细胞进行免疫荧光染色,诱导向β胰岛细胞分化并利用高糖刺激胰岛素释放.结果 新生大鼠胰腺中的胰腺干细胞具有较强的增殖能力,可连续传代.第4代细胞经免疫荧光染色,显示胰十二指肠同源框因子l(PDX-1)、巢蛋白(Nestin)、神经元素3(NGN3)、波形蛋白(Vimentin)、胰岛素(Insulin)和C肽(C-peptide)阳性;经诱导分化后,经双硫腙(DTZ)染色为阳性,同时免疫组织化学显示PDX-1和C-peptide阳性;在糖刺激实验中,当无糖刺激时,细胞组胰岛素释放量为(5.3±1.5) pIU/ml,而诱导后的细胞组胰岛素释放量为(30.0±11.5) pIU/ml,两者比较差异有统计学意义(P =0.035).结论 分离的胰腺细胞是胰腺干细胞.
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特异性T细胞免疫治疗脑胶质瘤模型的研究
目的 探讨特异性T细胞过继治疗脑胶质瘤的可行性及有效性.方法 将C57BL/6小鼠树突状细胞(DC)与GL261细胞抗原共育,再与T细胞共培养,检测T细胞体外杀伤作用.建立GL261-C57 BL/6小鼠脑胶质瘤模型,随机分两组,治疗组用上述T细胞进行免疫治疗,对照组注射磷酸盐缓冲液(PBS),检测小鼠外周血T细胞亚群,磁共振检测小鼠成瘤情况,观察生存期并解剖死亡小鼠观察成瘤情况.结果 体外实验效靶比为60∶1时,成熟DC组T细胞杀伤率为(62.67±2.52)%,未成熟DC组为(26.33±2.08)% (P =0.000).T细胞治疗后小鼠外周血CD8a/CD4比值为1.18±0.31,对照组为0.28±0.05(P=0.047),治疗组磁共振未见肿瘤生长,对照组生存期为(22.63±2.38)d,治疗组死亡2只,其余均存活至实验结束(80 d)(P =0.001).解剖发现,对照组小鼠均可见肿瘤生长,治疗组在实验结束前死亡的2只可见肿瘤生长,存活至实验结束的小鼠未见肿瘤生长.结论 GL261细胞抗原诱导的特异性T细胞在动物实验中有抑制胶质瘤的作用.
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甲状腺全切除术对大鼠甲状腺癌组织的生长因子、凋亡因子、免疫调节因子的影响
目的 观察甲状腺全切除术对大鼠甲状腺癌组织的生长因子、凋亡因子、免疫调节因子的影响.方法 60只雄性SD大鼠按随机数字表法分为模型组,手术组,正常对照组,各20只.建立甲状腺癌动物模型,手术组甲状腺全切除术,3组给予3 g生理盐水,处理8周.采用苏木素-伊红(HE)染色法观察甲状腺组织的情况,采用Western blot法检测大鼠甲状腺组织内血管内皮生长因子(VEGF)、可溶性Fas受体(sFas)及可溶性Fas受体配体(sFasL)蛋白的表达,并采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)测定大鼠甲状腺组织内VEGF、sFas、sFasL mRNA的表达,酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测白细胞介素(IL)-1β、IL-6及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)浓度.结果 Western blot结果和RT-PCR结果显示,与阴性对照组比较,模型组、手术组的VEGF、sFas、sFasL蛋白、VEGF mRNA、sFas mRNA、sFasL mRNA的表达量、TNF-α、IL-1β、IL-6明显增加(P=0.000);与模型组比较,手术组的VEGF、sFas、sFasL蛋白、VEGF mRNA、sFas mRNA、sFasL mRNA的表达量、TNF-α、IL-1β、IL-6水平明显降低(P =0.000).结论 甲状腺全切除术可以切除甲状腺癌组织,并影响甲状腺癌的生长转移,这与下调生长因子、凋亡因子、免疫调节因子表达有关.
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稳定过表达微小RNA-637对甲状腺癌细胞生物学行为的影响
目的 观察过表达微小RNA(miRNA,miR)-637对甲状腺癌细胞TPC-1生物学行为的影响.方法 采用慢病毒转染将过表达miR-637质粒(实验组)和空白质粒(阴性对照组)分别转入TPC-1细胞,通过细胞计数试剂盒(CCK-8)法观察细胞增殖情况,流式细胞仪分析细胞凋亡率及周期分布,划痕实验和Transwell侵袭实验评价细胞迁移和侵袭能力.结果 实验组TPC-1细胞生长曲线趋势较为平缓,细胞生长速度较阴性对照组显著降低(t =5.840,P=0.028).与阴性对照组[(12.50±1.71)%]比较,实验组[(20.75±0.93)%] TPC-1细胞的凋亡率明显增加(t=19.674,P=0.003).与阴性对照组细胞比较,实验组细胞在48 h后S期下降至23.35%,Ge/M期下降至17.58%.划痕实验及TransweU侵袭实验表明,与阴性对照组细胞比较,实验组的细胞迁移数明显减少(t=-26.186,P=0.001).结论 过表达miR-637能降低TPC-1细胞的增殖、凋亡、迁移和侵袭能力.
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微小RNA-128在慢传输型便秘小鼠模型中的差异表达
目的 检测微小RNA(miRNA,miR)-128在慢传输型便秘(STC)小鼠模型中的表达.方法 雌性小鼠54只,随机分成生理盐水组、吗啡组、吗啡+大黄组.吗啡组通过连续6d皮下注射吗啡制作急性便秘模型.确定急性便秘模型制作成功后,缓慢递增剂量喂食大黄汤120 d,建立小鼠STC动物模型.观察小鼠排便、肠道传输试验、结肠组织形态学变化,并通过实时定量聚合酶链反应(q-PCR)检测小鼠结肠组织miR-128的表达.结果 吗啡+大黄组小鼠肠道传输距离显著缩短.吗啡+大黄组、生理盐水组及吗啡组小鼠肠道传输距离分别为(-1.60±3.21)、(14.75±3.75)、(6.50±1.50) cm.生理盐水组比吗啡+大黄组,差异有统计学意义(P=0.003);吗啡组比吗啡+大黄组,差异有统计学意义(P=0.024).组织学结果显示吗啡+大黄组肠管明显变薄且肌层结构紊乱.吗啡+大黄组小鼠结肠组织中miR-128的表达显著下调.吗啡+大黄组、生理盐水组及吗啡组小鼠结肠组织中miR-128的表达量分别为(7.30±8.40)×10-7、(3.03±1.98)×10-6、(3.72 ±0.69)×10-6.生理盐水组比吗啡+大黄组,差异有统计学意义(P=0.048);吗啡组比吗啡+大黄组,差异有统计学意义(P =0.037).结论 运用小鼠慢性便秘模型验证了miR-128在STC结肠组织中表达下调.
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靶向表皮生长因子受体Ⅲ型突变体的嵌合抗原受体修饰T细胞对肝癌细胞SMMC-7721的特异杀伤作用
目的 观察靶向表皮生长因子受体Ⅲ型突变体(EGFRv Ⅲ)的嵌合抗原受体修饰T细胞(EGFRv Ⅲ/2CAR-T)对肝癌细胞SMMC-7721的特异杀伤作用.方法 二代EGFRv Ⅲ CAR表达框(EGFRv Ⅲ/2CAR,1 374 bp)克隆入PiggyBac转座子载体PB513B-1的Xba Ⅰ和BamH Ⅰ位点,转座子载体(PB-EGFRv Ⅲ/2CAR)和转座酶双质粒电穿孔(1×20ms,840 v)转导人外周血T细胞,流式细胞术检测EGFRv Ⅲ/2CAR表达.Western blot法检测SMMC-7721中EGFRvⅢ表达.EGFRv Ⅲ/2CAR-T细胞和SMMC-7721细胞共培养,乳酸脱氢酶(LDH)释放试验检测特异杀伤作用、酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测干扰素(IFN)-γ分泌水平.结果 重组载体PB-EGFRv Ⅲ/2CAR经Xba Ⅰ和BamH Ⅰ酶切、电泳分析及DNA测序证明基因片段连接无误、核酸序列正确.流式细胞术检测结果转座子/转座酶双质粒电穿孔外周血T细胞EGFRvⅢ/2CAR表达率为55.5%.Western blot显示SMMC-7721在相对分子质量145 000处EGFRv Ⅲ表达.EGFRv Ⅲ/2CAR-T和SMMC-7721共培养24h,LDH释放试验证明肿瘤特异性杀伤,与效靶比呈正比(E∶T为1∶1、5∶1、10∶1、15∶1、20∶1);ELISA检测到IFN-γ分泌量为(1 060.1 ±89.0) pg/ml,明显高于对照组(P=0.000).结论 靶向EGFRv Ⅲ的二代CAR-T细胞能够特异杀伤EGFRv Ⅲ+的肝癌细胞SMMC-7721.
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茵陈蒿汤在梗阻性黄疸大鼠模型中的保肝作用及对G蛋白耦联受体5、法尼酯衍生物X受体表达水平的影响
目的 观察中药茵陈蒿汤(YCH-)对梗阻性黄疸大鼠模型中G蛋白耦联受体5(TGR5)、法尼酯衍生物X受体(FXR)变化并探讨其机制.方法 24只大鼠随机分为假手术组(Sham)、胆总管结扎组(BDL)、茵陈蒿汤组(BDL+ YCHT)并建模,检测肝功能相关指标;酶联免疫吸附法检测白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-a)的水平;免疫组织化学法检测肝组织TGR5蛋白的变化;实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)和Western blot测定肝组织TGR5、FXR mRNA及蛋白表达水平.结果 BDL组大鼠谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、总胆红素(TBil)、直接胆红素(DBil)、总胆汁酸(TBA)等明显增高(P均=0.000)且血清IL-1、IL-6和TNF-α也显著增高(P=0.002、0.000、0.004);与BDL组比较,BDL+ YCHT组各项肝功能指标均明显降低(P=0.005、0.000、0.028、0.009、0.029)且IL-1、IL-6和TNF-α也显著降低(P=0.021、0.042、0.037);BDL组TGR5表达明显增高(P=0.030),BDL+ YCHT组的表达也明显高于BDL组(P=0.042);BDL组TGR5 mRNA及蛋白表达明显增加(P均=0.000)而FXR mRNA和蛋白表达却明显降低(P均=0.000);BDL+ YCHT组较BDL组TGR5、FXR mRNA及蛋白的表达均显著升高(P=0.007、0.032、0.007、0.000).结论 梗阻性黄疸时肝组织TGR5表达增高而FXR的表达降低.YcHT治疗梗阻性黄疸大鼠模型有明显疗效,可能通过促进TGR5、FXR的表达减轻肝脏损伤.
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线粒体分裂抑制剂对脓毒症大鼠器官功能的保护作用
目的 观察线粒体分裂抑制剂(Mdivi-1)对脓毒症大鼠器官功能的保护作用.方法 采用盲肠结扎穿孔术(CLP)复制大鼠脓毒症模型,将120只体重为200~220 g的SD大鼠,随机分成假手术组、脓毒症组、常规治疗组、常规治疗+ Mdivi-1(1 mg/kg)治疗组(M1)、常规治疗+Mdivi-1(3 mg/kg)治疗组(M3),其中常规治疗组在CLP 12 h后从股静脉给予乳酸林格液输注,同时给予抗生素头孢呋辛钠(100 mg/kg)和血管活性药物多巴胺;M1组和M3组是在常规治疗液体中给予Mdivi-1 1 mg/kg和3 mg/kg从股静脉输注;脓毒症组在CLP 12 h后,股动静脉插管后放置;假手术组大鼠除不结扎盲肠和穿孔外,其余操作同模型组.观察各组对脓毒症大鼠肝脏、肾脏、肠道和心脏功能及动物存活时间、存活率的影响.结果 与假手术组比较,脓毒症后大鼠的器官功能明显受损,表现为谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、尿素氮(BUN)和肌酐(Cr)、肌钙蛋白T以及D-乳酸在脓毒症后均升高,与假手术组比较,差异有统计学意义;采用输液、抗感染以及血管活性药物常规治疗并不能明显改善大鼠的器官功能;不同浓度(1、3 mg/kg)的线粒体分裂抑制剂Mdivi-1联合常规治疗可明显改善肝脏、肾脏、肠道和心脏功能,其中3 mg/kg效果更好,与常规治疗组比较,AST为(152.2±11.8比216.5±14.7,P=0.000),ALT为(49.0±3.8比66.3±2.3,P=0.000)、BUN分别为(11.2±1.6比16.1±2.8,P=0.001),Cr为(23.6±2.5比35.7 ±2.7,P=0.000)、D-乳酸(D-lac)为(1.3±0.1比2.8±0.3,P=0.000);同时可提高组织氧供和氧耗,延长动物存活时间[(60.30 ±30.82)h比(11.28±20.77)h,P=0.000],提高存活率(8/16比1/16).结论 线粒体分裂抑制剂Mdivi-1对脓毒症大鼠多器官功能有保护作用.
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五味子乙素对人尤文肉瘤细胞抑制增殖及促进凋亡作用及其机制
目的 探讨五味子乙素(Sch B)对人尤文肉瘤细胞株A673的抑制增殖和促进凋亡的作用机制及其相关信号通路表达.方法 体外培养人尤文肉瘤细胞株A673,采用噻唑蓝(MTT)法研究不同浓度(0、10、20、50、100 μmol/L)Sch B对尤文肉瘤细胞的增殖抑制作用,并采用集落形成实验观察其(0、5、10、15μmol/L)浓度的Sch B对尤文肉瘤细胞集落形成的抑制作用.Western blot 实验分析(10、20、50 μmol/L)浓度梯度下Sch B调控B细胞淋巴瘤/白血病-2(bcl-2)、bcl-2相关X蛋白(bax)、p53、细胞周期蛋白(Cyclin) D1蛋白的表达.结果 Sch B有明显抑制人尤文肉瘤细胞增殖作用,随浓度增加增殖抑制率为18.22%、22.50%、34.43%、53.56%;并呈现出浓度和时间依赖效果,同时还有明显抑制其集落形成能力,集落个数分别是110.5±12.4、82.2±14.1、54.3±9.2、38.4±16.5.对尤文肉瘤细胞中的凋亡蛋白研究显示Sch B具有明显的抑制bcl-2和Cyclin D1表达,同时促进bax和p53蛋白表达的作用.结论 Sch B对人尤文肉瘤细胞有明显抑制增殖和促进凋亡作用,其具体机制与抑制bcl-2和Cyclin D1表达,促进bax和p53蛋白表达有关.
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Wnt5a对甲状腺乳头状癌细胞增殖及侵袭能力的影响
目的 观察Wnt5a表达对甲状腺乳头状癌细胞生物学行为的影响.方法 噻唑蓝(MTT)法检测敲低或过表达Wnt5a对甲状腺乳头状癌细胞增殖活性的影响.克隆形成实验检测敲低或过表达Wnt5a对甲状腺乳头状癌细胞单个细胞克隆形成能力的影响.Transwell实验检测敲低或过表达Wnt5a对甲状腺乳头状癌细胞侵袭能力的影响.结果 MTT法实验显示,Wnt5a过表达的K1细胞在3、4d检测到的吸光度(A)值(0.403 ±0.003、0.562±0.005)均大于对照组(0.371±0.006、0.454±0.002),Wnt5a-小干扰RNA(siRNA)-2组A值(0.342±0.005、0.402±0.004)均小于对照组,差异有统计学意义(t=0.951、14.206、-6.431、-20.140,P=0.030、0.000、0.003、0.000).Wnt5a过表达BCPAP细胞在3、4d检测到的A值(0.454±0.007、0.603±0.002)均大于对照组(0.403±0.006、0.493±0.002),Wnt5 a-siRNA-2组A值(0.362±0.005、0.370±0.003)均小于对照组,差异有统计学意义(t =0.839、27.361、-9.092、-29.087,P=0.010、0.000、0.001、0.000).平板克隆形成实验显示,过表达Wnt5a后,细胞株K1及BCPAP细胞克隆的形成数[(130.00±4.34)、(117.00±3.54)个]均明显高于对照组[(88.00±3.44)、(86.00±3.48)个],敲低Wnt5a后,K1及BCPAP细胞克隆的形成数[(50.00±3.45)、(47.00±4.01)个]均明显低于对照组,差异均有统计学意义(t=13.136、10.816、-13.510、-12.253,P=0.000).Transwell实验显示,过表达Wnt5a后,与对照组[(80.20±1.23)、(83.90±1.45)个]比较,细胞株K1及BCPAP每个高倍镜视野中穿过基底膜细胞数[(155.60±2.01)、(164.50±2.09)个]明显增多,差异均有统计学意义(t=-25.420、-24.881,P=0.000).敲低Wnt5a后,与对照组比较,细胞株K1及BCPAP穿过基底膜细胞数[(50.80±1.02)、(52.30±1.08)个]明显减少,差异均有统计学意义(t=21.868、28.938,P=0.000).结论 过表达Wnt5a能够促进甲状腺乳头状癌细胞的增殖、克隆和侵袭;敲低Wnt5a能够抑制细胞的增殖、克隆和侵袭.
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PiggyBac转座子介导的嵌合抗原受体修饰T细胞研究
目的 建立一种非病毒的T细胞基因转导方法,为CAR-T细胞免疫治疗提供基因修饰策略.方法 将CD19CAR表达框(1 470 bp)克隆人PiggyBac转座子载体PB513B-1的Xba Ⅰ和EcoR Ⅰ位点,构建靶向CD19的PiggyBac转座子载体(pb19CAR);将转座子和转座酶双质粒,经电穿孔仪(1×20 ms 830 V/840 V/850 V)和核转仪(U014/T023)转导原代T细胞,优化转导程序,比较两种转导装置的效率及细胞存活率;用靶抗原CD19蛋白(5μg/ml)和CD3/CD28 mAb(5μg/ml)两种包被平板激活、白细胞介素(IL)-2(500 U/ml)和混合细胞因子IL-7(10 ng/ml)/IL-15(10 ng/ml)/IL-21(20 ng/ml)两种扩增方法,比较激活、扩增、CD19CAR表达和细胞表型.结果 转座子载体(pb19CAR)经Xba Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切和基因测序确认构建成功.经流式细胞术及细胞活力计数仪检测,电穿孔仪转导效率及细胞活率均高于核转仪[(51.0±2.3)%比(36.5±1.8)%(P=0.000),(75.0±3.8)%比(60.0±3.0)%(P=0.000)];电穿孔后培养扩增12d流式细胞术检测CD19CAR表达显示靶抗原CD19蛋白组明显高于CD3/CD28 mAb组[(70.0±3.5)%比(54.0±2.7)%(P=0.000)]、细胞表型分析显示混合细胞因子组比IL-2组有更高比例的Tscm/Tscm-like(25.00±1.25)%比(12.20±0.60)% (P =0.000)、Tcm细胞(10.20±0.51)%比(3.00±0.15)%(P=0.000).结论 pb19CAR/转座酶双质粒电穿孔具有较高的转导效率和细胞活率;靶抗原CD19蛋白刺激可优势扩增CAR-T细胞;混合细胞因子支持具有中央记忆和干细胞记忆表型的CAR-T细胞生长.
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含有人端粒酶反转录酶的溶瘤腺病毒Ad11联合异环磷酰胺对人骨肉瘤细胞的杀伤作用及其机制
目的 探讨溶瘤腺病毒Ad11联合异环磷酰胺对入骨肉瘤细胞的杀伤作用及机制.方法 体外培养人骨肉瘤细胞株MG63,采用细胞毒性检测法(MTS法)检测Ad11的50%大效应浓度(EC50)和异环磷酰胺的25%抑制浓度(IC25)和50%抑制浓度(IC50).使用MTS法分别检测对照组、Ad11组[转染复数(MOI)=5]、异环磷酰胺组1(IC25=15 μmol/ml)、异环磷酰胺组2(IC50=25 μmol/ml)、联合组1(Ad11 +IC25)、联合组2(Ad11+ IC50)的细胞活性.Western blot技术检测对照组和实验组的自噬相关蛋白Beclin-1和LC3A/B的表达.结果 MTS实验显示Ad11处理骨肉瘤细胞,其EC50值为5.26 MOI,联合异环磷酰胺后对骨肉瘤细胞MG63具有协同杀伤作用.Western blot结果显示Ad11联合异环磷酰胺处理细胞时,异环磷酰胺引起的细胞自噬作用受到抑制.结论 Ad11对骨肉瘤细胞株MG63具有杀伤作用,联合异环磷酰胺时杀伤作用增强,该协同作用可能是由于Ad11减弱了MG63细胞的保护性自噬作用.
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噬菌体裂解酶对兔膝关节假体周围感染的影响
目的 观察噬菌体裂解酶(LysGH15)关节腔内局部注射对兔膝关节假体植入术后金黄色葡萄球菌感染的影响.方法 建造兔膝关节假体植入术后金黄色葡萄球菌感染模型,分为裂解酶实验组和生理盐水对照组.在裂解酶或盐水注射前和注射后的第1、3、7、14天,采集兔假体植入侧膝关节液做细菌培养和细胞间黏附基因A(icaA)的反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测.后一次采集膝关节液标本后,游离并取出植入假体做扫描电镜观察,检测其表面生物膜生成并做评分.结果 实验组兔在LysGH15注射后的第1、3天,关节液内细菌浓度迅速下降为(105.3±53.8) cfu/ml和(37.9±22.5)cfu/ml,与注射前(255.7±103.4) cfu/ml做组内纵向对比差异明显(t=5.771,P=0.000;t=9.205,P=0.000),而对照组则在盐水注射前后无明显差异(t=0.388,P=0.700);实验兔的关节液内细菌icaA基因表达相对灰度比值在LysGH15后的第1、3天迅速下降为0.848±0.412和0.156±0.071,与注射前(2.371±0.940)做组内纵向(t=6.636,P=0.000;t=10.508,P=0.000),而对照组则在盐水注射前后无明显差异(t=0.709,P=0.483);膝关节假体表面生物膜的扫描电镜观察显示,实验组较对照组的生物膜破坏较严重,等级秩和检验结果显示两组差异有统计学意义(U =2.254,P=0.024).结论 噬菌体裂解酶LysGH15关节腔内局部注射能够快速减少兔膝关节假体植入术后金黄色葡萄球菌感染细菌的浓度、降低细菌icaA基因的表达和破坏假体表面细菌合成的生物膜.
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微小RNA-1243对人甲状腺乳头状癌TPC-1细胞增殖和迁移的作用及其机制
目的 观察微小RNA(miRNA,miR)-1243过表达对人甲状腺乳头状癌细胞TPC-1增殖和迁移的生物学影响.方法 利用实时定量反转录聚合酶链反应(RT-qPCR)技术检测甲状腺乳头状癌2×105个TPC-1细胞不同转染组miR-1243的表达,水溶性甲臢化合物(MRS)法检测2×104个细胞的增殖能力及迁移小室(Transwell)检测1×105对数生长期的TPC-1细胞的迁移能力.利用生物信息学软件预测miR-1243的靶基因.采用双荧光素酶报告基因验证miR-1243对靶基因的直接调控.结果 空白对照和阴性对照组中miR-1243的表达量分别为0.97±0.31,1.208±0.40,显著低于miR-1243模拟物转染组932.84±52.34,差异有统计学意义(P=0.000);细胞转染48h后,空白对照及阴性对照组细胞相对存活率分别为4.82±0.10和4.91±0.09,显著高于miR-1243模拟物转染组4.41 ±0.06,细胞转染miR-1243的增殖能力被显著抑制(P=0.032).miR-1243模拟物转染组迁移细胞数为15.5±6.5,均少于空白对照组33.5±9.5和阴性对照组31.75±10.75,差异均有统计学意义(P=0.016).经过生物信息学网站miRanda和RNAhybrid共同分析,可见AKT丝氨酸/苏氨酸激酶1(AKT1) mRNA是miR-1243的潜在靶基因.双荧光素酶报告基因结果显示,与空载体组(98.97±9.96),突变组(85.02±11.04)及阴性对照模拟物组(97.38±10.29)比较,共转染miR-1243模拟物的野生型组荧光素酶活性显著下降(45.92±10.91) (P=0.005),证实miR-1243直接调控制AKT1表达.结论 过表达miR-1243可以抑制TPC-1细胞的增殖和迁移能力.miR-1243可能通过直接靶向AKT1参与调控甲状腺乳头状癌的进展.
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孕酮对脊髓急性缺血再灌注损伤后的保护作用
本研究旨在探讨孕酮对兔脊髓急性缺血再灌注损伤后的神经保护作用及其机制.一、材料与方法1.动物模型:雄兔54只[SYXK(冀)2009-0022],单纯随机法分为假手术、脊髓损伤、孕酮治疗组,每组分72 h和14 d两个时间,每时间点9只.脊髓损伤组和孕酮治疗组制作脊髓缺血再灌注模型,孕酮治疗组术后每24h注射孕酮1次(华中药业公司,H42021495).
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E-钙黏蛋白在结直肠癌组织的表达
我们采用免疫组织化学法探讨E-钙黏蛋白(E-cadherin)蛋白在结直肠癌患者癌组织、癌旁组织中的差异表达及其与患者临床病理特征的关系.一、资料与方法1.相关资料:我院收治并手术治疗的结直肠癌患者47例,采用免疫组织化学链菌素抗生物素蛋白-过氧化物酶(SP)法检测癌组织与癌旁组织中E-cadherin的表达水平.病例入选标准:术后病理明确诊断为结直肠癌,患者临床资料完整.47例患者男28例,女19例,平均年龄(60.3±15.6)岁,高中分化腺癌22例,低分化腺癌25例.
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沉默调节蛋白1抑制剂增强吉西他滨治疗胰腺癌的敏感性
目前,胰腺癌对吉西他滨具有严重抵抗反应,本研究旨在观察沉默调节蛋白1(SIRT1)抑制剂联合吉西他滨对PANC-1细胞的影响.一、材料与方法1.磁珠细胞分选(MACS)胰腺癌细胞中CD133+ CD44+肿瘤干细胞:人胰腺癌细胞PANC-1干细胞按照比例加入缓冲液(1×107/100μl)、CD44抗体(1×107/100 μl)和CD133抗体(1×107/100 μl)混匀.计算CD44+ CD133+双阳性细胞比例.2.检测细胞内烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)活性:将分选出的PANC-1胰腺癌干细胞分为3组:正常组、吉西他滨组、吉西他滨+ SIRT1抑制剂EX527组.药物作用48 h后测定NAD活性.
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一种用于脑肿瘤模型小鼠放射治疗研究的实验装置
我们在长期动物放疗实验中设计了一种用于脑肿瘤模型小鼠放疗研究的新型的实验装置,现介绍如下.一、材料与方法本装置分为有机玻璃和铅板两部分.当进行头部照射时,将小鼠置于放疗单元中,使小鼠右侧头部恰好位于头部照射孔下,根据小鼠体长选用不同挡板使小鼠紧紧卡住,不能随意活动.放射时,将带头部照射孔的铅板置于有机玻璃装置上表面,并使其照射孔与有机玻璃上表面的照射孔对应.
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深部电刺激对帕金森病大鼠多巴胺受体的影响
我们通过Morris水迷宫和免疫组织化学方法探讨脑深部电刺激术(DBS)对帕金森大鼠认知的影响[1].一、材料与方法1.造模:首尾环绕旋转行为即6-羟基多巴胺(6-OHDA)的帕金森(PD)模型组.双极同心圆刺激电极植入丘脑底核(STN)即DBS大鼠.2.DBS大鼠分刺激组和假刺激组,刺激组连续电脉冲刺激,假刺激组不通电.Morris水迷宫行定位航行实验和空间探索实验.免疫组织化学学法对海马区和额叶皮层多巴胺D1受体染色并进行平均密度统计分析.
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膀胱肿瘤抗原、尿脱落细胞学、泌尿系彩超联合检查在膀胱癌诊断中的价值
膀胱镜检查是诊断膀胱癌的金标准,但其属有创检查,患者较为痛苦;膀胱肿瘤抗原(BTA) stat作为一种新的、敏感度较高的尿膀胱肿瘤标志物[1-2],其操作具有简便、快捷、无创等特点,通过与尿脱落细胞学、彩超联合可提高膀胱癌检出率,能达到部分替代膀胱镜检查的效果.
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大肠癌相关癌前病变患者血浆微小RNA的表达特征
大肠癌(CRC)患者血浆微小RNA(miRNA,miR)-15b、miR-17、miR-21、miR-26b和miR-145表达明显失调[1].本研究旨在探讨高级别腺瘤(AA)和溃疡性结肠炎(UC)患者候选miRNA的表达特征.一、资料与方法1.一般资料:选取2014年6月至2016年8月我院AA患者17例,活动期UC患者25例,CRC患者32例(结肠17例,直肠15例)和健康体检者(HC)32例,其中,CRC与AA患者均经病理确诊的首次就诊者,活动期UC患者指炎性指标提示疾病处于活动期.血浆miRNA提取试剂盒(Qiagen公司,德国);miRNA反转录及荧光定量试剂盒(BioTNT公司,中国);ViiATM 7实时荧光定量PCR仪(Life Technology公司,美国).
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逼尿肌过度活动E-钙黏蛋白/β-连环蛋白的表达及临床意义
逼尿肌过度活动(DO)是膀胱出口梗阻(BOO)重要的病理生理改变.我们检测40例BPH致DO患者逼尿肌E-钙黏蛋白(E-cadherin)/β-连环蛋白(β-catenin)复合体的表达,发现其变化与DO密切相关.一、资料与方法经尿流动力学检查证实存在DO的BPH患者40例,根据国际膀胱过度活动症状评分(OABSS)分组.38例无DO的BPH患者作对照.术中获取膀胱壁组织.
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桡骨远端C3型骨折植骨对掌侧钢板内固定预后的影响
桡骨远端C3型骨折中,骨性结构的破坏常伴有干骺端分离、压缩、坍陷、骨量缺损.骨性结构重建及关节功能恢复是治疗的目标.随着能中和骨折端应力的掌侧低切迹锁定钢板的广泛使用,临床疗效得到明显提升,但植骨能否进一步提高疗效现存在一定争议[1].
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血管内支架置入术治疗颅外段颈动脉粥样硬化狭窄远期效果
脑血管疾病已成为威胁我国居民健康的第一大杀手[1].缺血性脑血管疾病(缺血性脑卒中)占所有脑血管疾病的60%以上,25%左右的缺血性脑卒中和颅外段颈动脉动脉硬化狭窄有关.积极外科处理严重颈动脉动脉硬化狭窄可显著降低患者发生缺血性脑卒中的风险,降低致残率和死亡率.
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腹腔镜早期探查在腹部钝性外伤继发肠损伤中的诊断价值
腹部外伤是急诊与创伤外科为常见的一类腹部急症,根据受伤机制可分为锐器外伤与腹部钝性损伤.本研究旨在探讨腹腔镜早期探查在腹部钝性外伤继发肠损伤中的诊断价值.一、资料与方法1.一般资料:2015年1月至2018年1月我科收治的腹腔镜早期探查在腹部钝性外伤继发肠损伤患者36例,其中男21例,女15例,年龄19~68岁.所有患者均有明确腹部外史,伤后主要表现为腹痛、腹壁淤血.术前腹部计算机断层扫描(CT)检查显示腹腔积液、肠壁增厚、游离气体等.
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低氧诱导八聚体结合转录因子4蛋白的小泛素样修饰增强胃癌侧群细胞化疗抵抗
本研究旨在探讨乏氧增加胃癌侧群细胞化疗抵抗的内在分子机制,现报道如下.一、材料与方法1.试剂与细胞:顺铂(山东齐鲁制药公司),氯化钴(Sigma公司);免疫磁珠细胞分选试剂盒(Miltenyi Biotec公司);噻唑蓝(MTT)试剂盒和原位凋亡试剂盒(鼎国公司).2.Western blot方法检测八聚体结合转录因子4(Oct4)和SUMO-1蛋白表达:利用磁场及分离柱装置分离CD133+的SGC-7901胃癌侧群细胞后,聚丙烯酰胺凝胶电泳法检测Oct4和SUMO-1蛋白表达.
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多西他赛联合顺铂对舌部鳞癌移植瘤模型大鼠血管内皮生长因子及基质金属蛋白酶的影响
本文通过建立舌部鳞癌移植瘤模型的方法,以血管内皮生长因子(VEGF)、基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9蛋白表达为切入点,分析多西他赛联合顺铂治疗舌部鳞癌的可能作用机制.一、资料与方法1.一般资料:(1)实验动物:60只6~8周龄清洁级SD雄性大鼠购自南昌大学实验动物中心.(2)主要材料:人舌部鳞癌细胞株Tca8113;鼠人抗VEGF、MMP-2、MMP-9.2.模型建立及干预方法:建立Tca8133细胞裸鼠皮下移植瘤模型,模型成功建立第8天,选择体重、瘤体体积基本相同的48只裸鼠,随机分为对照组、顺铂组、多西他赛组、顺铂联合多西他赛组各12只.顺铂组:腹腔注射顺铂5 mg/kg;多西他赛组:腹腔注射多西他赛10 mg/kg;顺铂联合多西他赛组:腹腔注射顺铂5 mg/kg、多西他赛10 mg/kg;对照组:注射等量生理盐水.注射时间:第1、8、14、21天,共4次.
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沉默低氧诱导因子-1与蛋白激酶B基因联合干预人肝癌细胞株SMMC-7721增殖
大多数进展期肿瘤都处于缺血缺氧状态,低氧诱导因子-1(HIF-1)是缺氧状态下的主要调节因子;而蛋白激酶B(Akt)是多条通路的重要靶点.本实验旨在观察HIF-1与Akt之间的相互作用模式及其对肝癌细胞增殖的影响,探讨两者在肝癌增殖中的网络调控关系.
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姜黄素抑制哺乳动物雷帕霉素靶蛋白通路延缓肠炎炎癌转化
炎症性肠病不能及时有效治疗易反复发作,病情逐渐加重,形成迁延难愈的慢性结肠炎,慢性肠炎长期发展极易发生炎癌转化终恶化为肠癌[1].我们采用氧化偶氮甲烷(AOM)/葡聚糖硫酸钠(DSS)方式构建小鼠结肠炎癌转化,探讨磷酸肌醇3激酶(PI3K)-蛋白激酶B(Akt)-哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路在炎癌转化中的作用及姜黄素通过该通路治疗小鼠结肠炎癌转化的作用与机制.
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腺病毒介导骨形态发生蛋白-2基因修饰骨髓间充质干细胞适病毒感染滴度
骨形态发生蛋白(BMP)除了BMP-1外,均属于转化生长因子-β超家族成员,可诱导骨和软骨分化、促进新骨形成,在骨、软骨缺损修复中发挥着重要的作用[1].我们通过将腺病毒(Ad)-BMP-2基因转染参数进一步优化,为动物体内修复骨缺损实验及未来临床应用提供参数.一、材料与方法1.材料:4周龄Fisher大鼠,无特定病原体(SPF)级,购自北京维通利华实验动物技术有限公司.小鼠抗人BMP-2一抗购自美国RD公司,荧光定量免疫扩增(PCR)仪购自德国Eppendorf公司.
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兔纤维环细胞分离培养优化选择
椎间盘主要由纤维环及髓核构成,获得活力良好的原代纤维环细胞是研究椎间盘退变及修复的基础.本研究旨在观察不同消化酶组合对兔纤维环细胞产量、活力的影响.一、材料与方法1.材料:9只4个月龄新西兰兔由扬州大学动物实验中心提供[动物许可证号SYXK(苏)2016-0019].杜尔伯科改良伊格尔(DMEM)培养基、胎牛血清(美国Gibico公司),胰酶、Ⅱ型胶原酶(美国Sigma公司).
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胰岛素对老年痴呆模型大鼠学习记忆能力的影响
老年痴呆又称阿尔茨海默病氏病,是临床上较为常见的一类老年中枢神经系统退行性改变导致的疾病.临床表现主要以记忆障碍、失语、失用、失认、视空间技能损害、执行功能障碍以及人格和行为改变等全面性痴呆表现为特征,该病的病因及发病机制目前仍未阐明.
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腹腔镜胆囊切除术中胆囊意外破裂分析
腹腔镜胆囊切除术已成为胆道外科的标准手术方式之一,术中胆囊破裂是为常见的并发症之一,报道其发生率为10%~35%[1].我们拟探讨腹腔镜胆囊切除术中发生胆囊破裂的危险因素.一、资料与方法1.研究资料:我院2013年至2017年行腹腔镜胆囊切除术的患者102例,其中术中发生胆囊意外破裂者24例(病例组),无意外破裂者78例(对照组).102例患者中男49例,女53例,平均年龄(53.4±18.4)岁,术前诊断急性胆囊炎31例,慢性胆囊炎22例,胆囊颈部结石嵌顿16例,萎缩性胆囊炎27例,其他6例.所有患者术前肝肾功能、心电图及出凝血基本正常,无手术禁忌证.
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髋臼骨折手术疗效相关因素研究
髋臼骨折可由骨盆骨折时耻骨坐骨或髂骨骨折而波及髋臼,也可由髋关节中心性脱位所致,亦可由髋关节脱位所致.髋关节是人体大的负重关节,其骨折后功能恢复对患者术后生活质量有重要意义[1].一、资料与方法1.临床资料:对近5年我科手术治疗的髋臼骨折患者98例临床资料进行回顾性分析,其中术后功能优良者74例,可差者24例(Merled'Aubigne-Postel髋臼骨折功能评级).98例患者左侧骨折46例(46.9%),右侧52例(53.1%);简单骨折42例(42.9%),复杂骨折56例(57.1%),(Judet-Letoumel分型).
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进展期结直肠癌患者循环肿瘤细胞水平及其与患者临床特征和预后的关系
目的 探讨进展期结直肠癌患者循环肿瘤细胞(CTC)水平与患者临床病理特征和预后的关系.方法 我院接受治疗的180例进展期结直肠癌患者和50例同期非肿瘤患者外周静脉血,采用流式细胞术检测CK+4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)+ CD45-的CTC细胞,并根据CTC进行分组,分析CTC与患者临床病理特征以及预后的关系.结果 成功检测结直肠癌患者CTC,180例进展期结直肠癌患者CTC阳性74例(41.11%),阴性者106例(58.89%).CTC与肿瘤分化程度、临床分期、是否远端转移、血清癌胚抗原(CEA)水平以及淋巴结转移等指标均有相关(P=0.017、0.023、0.000、0.000、0.000).CTC阳性组患者的中位无进展生存期(26个月)和总生存期(57个月)明显低于阴性组患者的中位无进展生存期(37个月)和总生存期(92个月),差异有统计学意义(Log-rank=3.193,P=0.014;Log-rank=5.109,P=0.007).Cox比例风险回归模型,发现肿瘤分化程度、临床分期、是否远端转移、淋巴结转移和CTC等指标与总生存率和无进展生存期均存在相关性(P=0.015、0.032、0.018、0.027、0.009;P=0.009、0.020、0.011、0.031、0.006).CTC是影响患者术后总生存期和无进展生存期的独立风险因素(P =0.009、0.006).结论 CTC与进展期结直肠癌患者临床病理特征和预后密切相关.
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视黄酸诱导基因蛋白-I在胃癌组织的表达及临床意义
目的 观察视黄酸诱导基因蛋白-I (RIG-I)在胃癌组织中的表达,探讨RIG-I干预对人胃癌细胞株的功能调节作用.方法 免疫组织化学检测胃癌组织芯片癌及癌旁组织中RIG-I表达,秩和检验比较癌及癌旁组织中RIG-I表达差异,x2检验分析RIG-I表达与临床病理参数的关系,Log-rank分析RIG-I表达与患者预后的关系,Cox模型评价不同指标的预后价值.选用人胃癌细胞株SGC-7901及AGS,经RNAi技术构建RIG-I稳定下调表达细胞株,分别通过实时定量聚合酶链反应(Real-time PCR)和Western blot进行验证,并通过细胞计数试剂盒(CCK-8)细胞增殖实验、划痕实验及Transwell实验探讨RIG-I干预对上述胃癌细胞株生物学功能的调节作用.结果 胃癌组织中RIG-I表达水平显著低于癌旁组织(U=1 490,P=0.001).病理分级Ⅲ~Ⅳ级的患者,肿瘤组织中RIG-I高表达比率(68.18%)显著低于I~Ⅱ级的患者(94.12%,x2=4.668,P=0.031).RIG-I高表达患者其术后生存期较低表达患者显著延长(P=0.023).COX模型分析结果显示年龄(P=0.047)、TNM分期(P =0.039)、RIG-I高表达(P =0.007)可作为评估胃癌患者预后的独立风险因素.经过RNAi及慢病毒转染,选用SGC-7901和AGS成功构建RIG-I稳定下调表达细胞株LV-RIG-I-短发卡RNA(shRNA)及对照组LV-NC.CCK-8实验表明在培养后48 h及72 h,LV-RIG-I-shRNA组吸光度(A)值显著高于LV-NC组(SGC7901:P =0.000及P=0.000;AGS:P =0.002及P=0.016);划痕实验显示LV-RIG-I-shRNA组细胞迁移能力显著高于LV-NC组(SGC7901:P =0.001;AGS:P =0.004);Transwell侵袭实验表明,LV-RIG-I-shRNA组细胞侵袭数量显著多于LV-NC组(SGC7901:P=0.032;AGS:P =0.016).结论 RIG-I在胃癌的发生及发展中具有重要作用,胃癌细胞中RIG-I的下调表达可显著促进细胞增殖、侵袭及迁移能力.
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彩色超微血管成像技术及高频超声在早期幼年特发性关节炎膝关节病变的应用
目的 探讨彩色超微血管成像(cSMI)技术联合高频超声在早期活动性幼年特发性关节炎(JIA)患儿膝关节病变的应用.方法 临床确诊为早期活动期JIA患儿90例,所有患儿均伴有膝关节疼痛、肿胀,应用高频超声对所有JIA患儿膝关节进行检查,观察JIA患儿膝关节病变的主要超声征象,记录滑膜增厚关节数目,统计滑膜增厚关节滑膜厚度及髌上囊积液厚度,分别用cSMI、能量多普勒(PDUS)对增厚滑膜进行血流检测,并对血流信号进行半定量评分,同时收集患儿同期的红细胞沉降率(ESR)、C-反应蛋白(CRP),比较cSMI、PDUS对增厚滑膜血流显示差异,对cSMI、PDUS血流信号评分结果、ESR、CRP、增厚滑膜、髌上囊积液进行相关分析.结果 110个膝关节髌上囊显示滑膜增厚,滑膜增厚关节均伴有不同程度的髌上囊积液;增厚滑膜厚度及髌上囊积液厚度分别为(6.01±3.08)、(7.45±3.91) mm;增厚滑膜PDUS、cSMI血流显示率分别为59.09%、86.36%,两成像方式血流显示差异有统计学意义(P=0.000);膝关节增厚滑膜内PDUS与cSMI血流分级间差异有统计学意义(P=0.000),较PDUS,cSMI可上调血流分级;PDUS及cSMI血流信号分级与CRP、ESR、增厚滑膜及髌上囊积液均呈正相关(P=0.000),CRP与ESR、增厚滑膜呈正相关(P=0.000),ESR与增厚滑膜及髌上囊积液呈正相关(P=0.000),增厚滑膜与髌上囊积液呈正相关(P =0.000).结论 cSMI联合高频超声有助于诊断早期活动性JIA患儿膝关节病变.
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痘苗病毒相关激酶1在胶质瘤组织的表达及临床意义
目的 探讨痘苗病毒相关激酶1(VRK1)在胶质瘤组织的表达及临床意义.方法 Western blot分析VRK1在胶质瘤组织蛋白表达水平;Kaplan-Meier分析VRK1与患者预后参数关系;RNA干扰胶质瘤细胞VRK1的表达,细胞计数试剂盒(CCK-8)细胞计数和集落分析细胞增殖.结果 Western blot表明VRK1蛋白在胶质瘤组织中高表达.VRK1的表达与胶质瘤患者性别、年龄无明显相关(P=0.556),而VRK1表达与WHO分级明显相关(P =0.002).Kaplan-Meier分析显示高表达VRK1的患者预后较差(P=0.050).CCK-8细胞计数和集落结果表明VRK1促进胶质瘤细胞增殖.结论 VRK1在胶质瘤患者中高表达,与胶质瘤发生和发展有关.
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异柠檬酸脱氢酶和端粒酶反转录酶启动子突变对较低级别胶质瘤患者临床预后的影响
目的 观察异柠檬酸脱氢酶(IDH)和端粒酶反转录酶(TERT)启动子突变对较低级别胶质瘤患者临床预后的影响.方法 纳入经术后病理证实的初发较低级别胶质瘤病例260例,收集相关资料.Kaplan-Meier法计算生存率,Cox模型比例风险评估行多因素分析.结果 IDH突变组和未突变组的中位生存期分别为42.00个月和27.55个月,差异有统计学意义(P =0.001);TERT 启动子突变组和未突变组的中位生存期分别为42.00个月和33.50个月,差异无统计学意义(P=0.660).IDH和TERT启动子联合分析显示IDH未突变(wt)/TERT突变(mut)组预后差(P=0.001),有IDH突变存在组预后较好(P=0.001).结论 IDH突变能够预测较低级别胶质瘤患者的预后,而TERT启动子突变可以作为IDH突变的补充.
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中高位肛门直肠畸形直肠末端病理改变及神经元特异性烯醇化酶、钙结合蛋白和c-kit的表达
目的 探讨先天性肛门直肠畸形(ARMs)患儿直肠末端肠壁病理变化及神经发育情况,探讨术后排便功能障碍的发生机制.方法 应用苏木素-伊红(HE)染色法、Masson染色、免疫组织化学和Western blot检测中高位肛门直肠畸形组和正常对照组患儿直肠末端肠壁内各层病理形态改变及神经元特异性烯醇化酶(NSE)、钙结合蛋白(S-100)、c-kit的表达.结果 与正常对照组比较,中高位ARMs组中直肠末端肠壁内存在不同程度病理形态改变,包括黏膜炎症、黏膜下脉管扩张,肌层纤维组织增生等;ARMs组直肠末端黏膜下和肌间神经元数目较正常对照组明显减少[(5.30±1.26)个比(1.20±0.73)个,P=0.007];中高位ARMs组中直肠末端肠壁内NSE、S-100和c-kit的表达量均低于正常对照组,蛋白表达量别为(NSE:0.510±0.033比0.476±0.036;S-100:0.445 ±0.009比0.420±0.012;c-kit:0.982±0.043比0.756±0.017;P=0.023、0.035、0.028).结论 先天性中高位ARMs末端直肠壁组织中存在明显的病理形态学改变,且肠壁内神经节细胞的发育及Cajal间质细胞(ICCs)的分布密度均存在不同程度异常,这可能是中高位ARMs术后排便障碍的重要发生机制之一.
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混合系列蛋白激酶样结构域蛋白在非小细胞肺癌组织的表达及其临床意义
目的 探讨混合系列蛋白激酶样结构域(MLKL)在非小细胞肺癌(NSCLC)组织的表达水平及其与NSCLC患者临床病理学特征的关系,分析其与NSCLC患者生存的相关性.方法 我院65例NSCLC患者手术新鲜标本,采用实时定量聚合酶联反应(Real-time PCR)检测NSCLC肿瘤组织和癌旁组织的MLKL的mRNA表达水平;分析MLKL的mRNA表达水平和NSCLC患者的基本临床病理学特征参数的关系;利用在线Kalpan-Meier Plotter网站分析癌组织中的MLKL表达水平和NSCLC患者生存的相关性.结果 在NSCLC癌组织中MLKL的mRNA表达水平明显低于癌旁组织(1.00±0.13比5.69±0.49,P=0.000);NSCLC组织中MLKL的mRNA表达水平与T及N分期呈明显负相关(P =0.026、0.048),较低的MLKL的mRNA表达提示较差的组织分化(P=0.040);MLKL低表达的NSCLC总人群和腺癌人群的总生存期(OS)和进展后生存期(PPS)显著低于MLKL高表达组(P=0.000、0.006、0.014、0.014).结论 MLKL在NSCLC癌组织中显著低表达,与NSLCL的分化程度、T和N分期明显相关,其低表达提示预后较差.
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三维重建在术前确定手术方式及评估手术安全性中的作用
目的 探讨三维重建技术在术前评估肝癌切除安全性及确定手术方式中的作用.方法 分析我院肝胆外科行肝癌切除手术30例患者资料.术前行CT增强扫描,结合美国EDDA公司IQQA(R)-Lver系统对肝脏CT图像进行三维重建,得出全肝体积(TLV)、肿瘤体积(TV)、功能性肝体积(FLV)、拟切除的功能性肝体积(EFLV)、拟切除的肝体积(ELV)、剩余肝体积(FLR),排水法得出实际切除的肝脏体积(AELV),计算标准肝体积(SLV).统计手术时间、术中出血量、术后并发症及死亡率.对ELV与AELV进行t检验;分析TV与EFLV、FLR相关性.结果 ELV(686±488)与AELV (687±485)差异无统计学意义(t=-0.370,P=0.773),术前模拟肝癌切除的手术方案与实际手术方案一致.对TV与EFLV、FLR进行Spearman相关性检验,TV与EFLV呈正相关(r =0.392,P=0.010),与FRL呈负相关(r=-0.476,P=0.003).术后无肝功能衰竭及死亡患者.结论 利用计算机三维辅助定量分析,进行术前模拟手术,可以在术前充分评估肝癌切除安全性;可以根据FLR来确定不同的手术方式.
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洁悠神长效抗菌材料在预防小儿肱骨远端骨折术后感染中的应用
目的 探讨长效抗菌材料洁悠神(JUC)预防肱骨远端骨折经皮克氏针固定术后针道感染的临床疗效.方法 选取符合标准的160例肱骨远端骨折患儿随机分为两组,每组各80名患儿.所有患儿行闭合复位经皮克氏针内固定术后分别采用JUC或安慰剂喷洒克氏针针尾.无菌敷料包扎后行屈肘位石膏固定.术后4~6周拆除石膏,比较两组患儿针道感染率.结果 JUC组克氏针针道感染率为1.25%,细菌培养为金黄色葡萄球菌;安慰剂组感染率为10.00%,其中金黄色葡萄球菌感染7例、铜绿假单胞菌感染1例.JUC组感染率明显低于安慰剂组,且差异有统计学意义(P=0.016).结论 术中使用JUC能有效预防经皮克氏针固定术后针道的感染,明显降低针道感染率.
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3D腹腔镜袖状胃切除术治疗肥胖症合并2型糖尿病的临床疗效及机制
目的 探讨3D腹腔镜袖状胃切除术(LSG)治疗肥胖症合并2型糖尿病(T2DM)的安全性、可行性、临床疗效及对胰高血糖素样肽1(GLP-1)和胃饥饿素(Ghrelin)水平的影响.方法 我院收治的26例肥胖症合并T2DM患者均由同一手术团队施行3D腹腔镜袖状胃切除术.术后随访1年,观察术后恢复情况、减重降糖效果及Ghrelin和GLP-1的变化.结果 26例患者均顺利完成手术,无中转开腹,术后均无吻合口漏、出血及狭窄等严重并发症发生和围手术期死亡.手术时间为(60.00±17.06) min,术中出血量为(7.31±2.54) ml,下床活动时间为(1.58±0.50)d,术后胃肠功能恢复时间为(1.92±0.63)d,术后住院时间为(7.50±1.21)d,术后第1天数字分级法(NRS)评分为(3.42±0.50)分,术后第3天NRS评分为(1.42±0.50)分.26例患者均获得术后随访.与术前比较,所有患者术后3、6、12个月体重、体重指数(BMI)、腰围、臀围、腰臀比均显著降低(体重:P =0.001、0.000、0.000;BMI:P=0.001、0.000、0.000;腰围:P =0.000、0.000、0.000;臀围:P=0.017、0.000、0.000;腰臀比:P =0.017、0.000、0.000),减重效果显著.与术前比较,所有患者术后3、6、12个月空腹血糖、空腹胰岛素、空腹C肽、糖化血红蛋白均明显降低(空腹血糖:P =0.000、0.000、0.000;空腹胰岛素:P=0.000、0.000、0.000;空腹C肽:P =0.002、0.000、0.000;糖化血红蛋白:P=0.000、0.000、0.000),降糖效果显著.26例患者术后12个月T2DM缓解率92.31% (24/26),有效率为100.0%(26/26).所有患者术后3、6、12个月血Ghrelin水平较术前明显降低(0.000、0.000、0.000),GLP-1未见显著变化(P=0.797、0.300、0.597).结论 LSG治疗肥胖症合并T2DM安全可行,近期临床效果显著.LSG主要通过改变Ghrelin的含量来调控血糖.
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自身免疫性脑脊髓炎小鼠神经源性膀胱的发生机制进展
自身免疫性脑脊髓炎(EAE)小鼠模型目前被认为是研究多发性硬化(MS)的首选动物模型.MS是一种常见的中枢神经系统白质炎症脱髓鞘疾病,常导致神经源性膀胱(NGB)的发生.其发生机制目前尚未完全阐明,可能涉及包括膀胱重塑、神经传导、逼尿肌间缝隙连接等在内的多个细胞信号转导通路的异常.我们就EAE小鼠中NGB的分子机制研究进展做一综述,以供参考.
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基于XAGE-1b抗原靶向免疫治疗在前列腺癌中的研究进展
前列腺癌是男性常见的恶性肿瘤之一,严重威胁着男性健康,其发生发展是一个多基因相互作用、相互影响的复杂过程,免疫反应在整个过程中扮演了重要的角色.随着对前列腺癌肿瘤免疫学和肿瘤微环境研究的不断深入,靶向免疫治疗被认为是前列腺癌有前景的治疗方式.XAGE-1b抗原是一种前列腺癌相关抗原,具有强免疫原性,大量研究表明其与前列腺癌的发生及进展密切相关,不少学者认为XAGE-1b抗原是晚期前列腺癌免疫治疗的潜在靶点.现就针对XAGE-1b抗原前列腺癌靶向免疫治疗研究进展作一综述.
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门静脉癌栓形成机制的研究进展
门静脉癌栓(PVTT)是晚期肝癌常见的并发症及肝内转移的主要途径,是指在多种因素作用下肝癌细胞侵犯肝门静脉系统,并在门静脉内增殖形成癌栓.PVTT的形成不仅引起门静脉的血供不足、肝功能下降,还可导致门静脉高压、腹腔积液、消化道出血等症状.近年来国内外学者对PVTT的形成机制进行了积极的探索,并取得了很大进展.本文将从血流动力学、分子生物学、肝癌微环境等多方面综述PVTT形成机制的研究现状及进展.
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延迟钆剂磁共振显像在心房颤动中的应用进展
心房颤动主要的病理生理改变是电重构和结构重构,心肌纤维化是结构重构突出特征.左心房纤维化不仅是房颤发生和进展的相关因素,也是房颤患者发生不良事件的重要的预测因素.随着磁共振影像学技术的进步,延迟钆剂磁共振显像(LGE-MRI)逐渐用于评估房颤患者的心房纤维化.因此,我们将从房颤与纤维化、LGE-MRI评估心房纤维化、预测房颤并发症及消融结局等方面进行综述,以阐明LGE-MRI在房颤领域中的作用,为LGE-MRI的临床应用提供帮助.
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程序性死亡受体-1/其配体1单抗联合放射治疗的抗肿瘤免疫机制
免疫治疗可通过激活或者增强机体抗肿瘤免疫功能杀伤肿瘤细胞或抑制肿瘤的发生发展;免疫卡控点分子程序性死亡受体-1(PD-1)与其配体PD-L1、PD-L2结合,抑制T淋巴细胞功能,使肿瘤细胞逃避免疫应答;放射治疗可杀伤肿瘤细胞,同时增强和激活机体的固有和适应性抗肿瘤免疫应答.放疗联合PD-1/PD-L1单抗能够增强抗肿瘤免疫应答、促进肿瘤细胞凋亡,发挥协同抗肿瘤作用.
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微流控芯片技术在循环肿瘤细胞富集和分析中的应用
循环肿瘤细胞(CTCs)是从肿瘤原发灶脱落并侵人人体外周血中的肿瘤细胞,可在合适的器官、组织侵出血管形成转移灶,与癌症转移密切相关.CTCs数量稀少,传统手段富集CTCs效率和纯度低,致CTCs后续生化分析难以开展.微流控芯片技术能对微量液体进行精确分析,具有独到优势,近年已被逐步应用于CTCs研究.本文主要讨论用于高效高纯度富集CTCs以及分析CTCs的微流控芯片技术.
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前列腺癌与糖代谢异常的研究进展
前列腺癌是欧美常见泌尿系肿瘤,近年来在我国的发病率也逐渐升高,肿瘤细胞具有独特的葡萄糖代谢特点并与其生物学行为密切相关.多种糖代谢相关基因已被证实在前列腺癌的发生、侵袭和转移过程中发挥了重要作用.本文将代谢综合征和细胞糖代谢异常在前列腺癌中的研究进展作以下综述.
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脑网络分析在脑血管病中的研究及应用进展
脑网络分析又称连接组学,是一种对脑连接拓扑结构分析的方式,对于神经科学基础研究及临床分析疾病进展与形成机制具有重要价值.本文旨在通过综述近年对于脑血管病认知功能下降及脑网络分析相关研究结果,为脑血管病基础研究以及临床预后判断与疾病治疗提供新的策略.
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信号转导和转录活化因子3在胰腺炎向胰腺癌转化过程中的桥梁作用
慢性胰腺炎(CP)是胰腺导管腺癌(PDAC)发生的独立危险因素.信号转导和转录活化因子3(STAT3)在正常胰腺组织中不激活,而在CP和PDAC这两个病理过程中均异常活化并发挥着重要的促进作用.研究显示STAT3参与CP向PDAC的转化过程,并发挥了关键的桥梁作用,这提示可以将STAT3作为PDAC在早期形成阶段的肿瘤治疗靶点,为其分子靶向治疗提供新思路.本文对于STAT3在CP向PDAC转化过程中的桥梁作用作一综述.
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精准医学当下的肝癌预防和筛查
精准医学是应用现代遗传技术、分子影像技术、生物信息技术,结合患者的生活方式、生活环境以及临床数据,实现精准的疾病分类及诊断,制定具有个性化的疾病预防和治疗方案.精准医学的理念,为如何实现精准化、个体化肝癌筛查和预防提供了新的思路,本文整合精准医学在肝癌筛查和预防中的研究现状与局限进行综述,以期为肝癌的精准预防提供进一步支持.
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细胞游离DNA和循环肿瘤DNA在前列腺癌检测中的研究进展
近年来的技术进步,细胞游离DNA(cfDNA)和循环肿瘤DNA(ctDNA)已作为癌症精准医疗的生物标志物.这些DNA比传统的生物标志物有优势,因为它们可以更好地捕捉肿瘤异质性和肿瘤进化的景观.现综述近年来cfDNA和ctDNA在前列腺癌中的应用进展,包括靶向治疗的监测治疗反应、化疗药物耐药性以及前列腺癌的一般预后.
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表观遗传学在恶性黑色素瘤中的研究进展
恶性黑色素瘤是外胚叶神经嵴来源的恶性肿瘤,在所有皮肤肿瘤中恶性程度高,致死性极强,其起源和进展是由于控制细胞增殖和逃避细胞死亡过程的多个复杂信号通路的变化引起的.表观遗传学是一种涉及基因功能但不涉及DNA序列改变的遗传机制,近些年的研究结果显示,表观遗传学改变对恶性黑色素瘤的发生发展具有重要意义.本文就恶性黑色素瘤表观遗传学方面的研究进展简要综述.
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泛素相关结构域样蛋白2在膀胱癌组织的表达及其对膀胱癌细胞增殖的影响
目的 观察泛素相关结构域样蛋白2 (UBAC2)在膀胱癌组织的表达及其对膀胱癌细胞增殖能力的影响.方法 采用实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)及免疫组织化学染色技术检测42例膀胱癌及其癌旁正常组织中UBAC2的表达,并分析UBAC2表达水平和患者临床病理特征之间的关系.构建短发夹RNA(shRNA)介导UBAC2沉默的质粒载体,并转染人EJ和UMUC3细胞.通过细胞计数试剂盒(CCK-8)实验及克隆形成实验分别检测不同分组膀胱癌细胞株的增殖能力.结果 FQ-PCR结果显示,与癌旁正常组织比较,膀胱癌组织中UBAC2 mRNA水平表达上调(2.201±0.826、3.721±2.912),差异有统计学意义(P=0.000).以SV-HUC-1细胞(1.000±0.029)为对照,膀胱癌细胞株EJ(2.273±0.040,P=0.000)和UMUC3 (3.038±0.115,P=0.000)细胞中的UBAC2基因的mRNA表达水平显著上调.免疫组织化学染色也表明在蛋白水平,UBAC2在膀胱癌组织中的表达水平较癌旁正常组织上调.临床病理特征分析表明,UBAC2mRNA与膀胱癌病理分级明显相关(P=0.045),与年龄、性别、淋巴结转移、临床分期、肿瘤大小等均无明显相关(P=0.961、0.641、1.000、0.227、0.426).CCK-8实验显示在EJ和UMUC3细胞中,UBAC2沉默组(shUBAC2)在对应时间点450 nm处吸光度值较对照组(shNC)明显降低(P=0.005、0.004);克隆形成实验显示EJ和UMUC3细胞中,shUBAC2组克隆形成数明显少于shNC组(P=0.002、0.005).结论 UBAC2在膀胱癌组织及细胞株中表达上调,沉默UBAC2可抑制膀胱癌细胞的增殖.
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乳腺癌转移抑制基因和骨桥蛋白在前列腺癌组织的表达及其临床意义
目的 探讨乳腺癌转移抑制基因(BRMS1)和骨桥蛋白(OPN)在前列腺癌组织的表达及其临床意义.方法 采用免疫组织化学法分别检测46例前列腺癌组织和29例良性增生组织中BRMS1、OPN蛋白的表达水平,并分析其与前列腺癌患者临床病理资料的关系.结果 BRMS1在29例良性增生组织中多为阳性表达,表达率86.2% (25/29),而前列腺癌组织中表达率为21.7%(10/46);前列腺癌组织中OPN表达率为70.0%(32/46),良性增生组织中OPN阳性表达率27.6%(8/29);两种蛋白在前列腺癌组织和增生组织中的表达差异均有统计学意义(P=0.000).BRMS1的表达与前列腺癌有无转移有关(P =0.046),与年龄、Gleason评分、前列腺特异性抗原(PSA)、肿瘤大小无关.OPN的表达与前列腺癌细胞Gleason评分、肿瘤大小和远处转移有关(P=0.046、0.029、0.035),与性别和PSA水平无关.BRMS1与OPN的表达呈负相关(P=0.021).BRMS1阴性表达伴OPN阳性表达者易发生远处转移.结论 BRMS1和OPN在前列腺癌的转移过程中发挥重要且相反的作用,两者联合检测可作为评判前列腺癌恶性程度的辅助指标.
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磺胺药物使用对肾移植术后肠道菌群结构的影响
目的 观察肾移植术后磺胺药物使用对移植患者肠道菌群结构的影响.方法 根据纳入排除标准选取在解放军第309医院全军器官移植研究所行肾移植手术的10例患者作为研究对象,收集每例患者术前3d内及术后第30天的粪便样本各1份,共计20份粪便标本,提取标本中原核生物全基因组后采用16S rDNA高通量测序方法分析菌群结构.结果 使用磺胺药物后的OTU数量仅为术前OTU数量的50%,差异有统计学意义(P =0.003);门水平:术前检测到10个菌门的细菌,而术后使用磺胺药物后仅检测到8个菌门的细菌,各类菌门丰度同样也在前后发生了显著的变化,厚壁菌门和拟杆菌门的平均相对丰度分别由术前73.20%和10.64%下降到了使用磺胺使用后的50.17%和3.13%,而变形菌门平均相对丰度由术前13.79%上升至了磺胺使用后的42.87%;属水平:术前肠道内丰度高的20类细菌多为文献已报道或研究已表明的人体正常的共生菌,而使用磺胺类药物后肠道内丰度高的20类细菌新出现的菌种却大多为致病菌.结论 磺胺类药物在移植术后的使用会明显破坏肠道菌群结构,一些共生菌和益生菌的种类明显减少,致病菌反而增加,甚至对肠道免疫和肠黏膜屏障功能也可能存在影响,这些都不同程度的增加了二次感染的风险.
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过表达三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸焦磷酸酶1促进前列腺癌细胞株LNCaP细胞周期活动
目的 探讨人三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸(dCTP)焦磷酸酶1在前列腺癌组织和前列腺癌细胞株LNCaP中的表达,观察dCTP焦磷酸酶1的过表达对LNCaP细胞周期的影响.方法 免疫组织化学法分析前列腺癌及非癌组织中dCTP焦磷酸酶1的表达量;通过Western blot检测LNCaP的dCTP焦磷酸酶1表达量(LNCaP:1.26±0.13比RWPE-1:0.52±0.01,P=0.000).构建dCTP焦磷酸酶1过表达的LNCaP细胞株,并通过流式细胞仪检测LNCaP细胞株细胞周期的变化(LNCaP-dCTP焦磷酸酶1过表达组:48.23±0.66比LNCaP-空载体组:30.10±1.01,P=0.022).结果 dCTP焦磷酸酶1在癌组织中表达上调[免疫组织化学评分:非癌组:(2.00±1.55)分,前列腺癌组:(4.00±1.52)分,P =0.000],dCTP焦磷酸酶1的高表达增加了LNCaP细胞的S+G2期的比例(P =0.000).结论 前列腺癌中的dCTP焦磷酸酶1表达增加,其高表达可能会促进前列腺癌细胞分裂.
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结肠癌转移相关基因1和胸苷激酶1在前列腺癌组织的表达及其临床意义
目的 探讨前列腺癌组织中结肠癌转移相关基因1(MACC1)和胸苷激酶1(TK1)的表达及两者在前列腺癌侵袭、转移中的影响作用.方法 应用免疫组织化学法检测70例前列腺癌组织和20例前列腺增生组织中MACC1和TK1的表达水平,分析MACC1和TK1的表达水平与前列腺癌临床病理参数的关系.结果 MACC1在前列腺癌组织中的表达率明显高于前列腺增生组织表达率(61.43%比20.00%,t=10.700、P=0.000),MACC1表达水平与前列腺癌组织学分级、临床分期和精囊腺侵犯明显相关(分别为t=8.930、P=0.010,t=6.720、P=0.010,t=4.850、P=0.030);TK1在前列腺癌组织中的表达率明显高于前列腺增生组织表达率(64.29%比15.00%,t=15.180、P=0.000),TK1表达水平与前列腺癌组织学分级和临床分期明显相关(分别为t=7.300、P=0.032,t =6.790、P=0.010).结论 MACC1和TK1的表达可能与前列腺癌的侵袭和转移有关.
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二十碳五烯酸抑制自噬反应提高膀胱癌细胞化疗敏感性
目的 探讨二十碳五烯酸(EPA)对膀胱癌T24细胞顺铂(DDP)化疗敏感性的影响及其机制.方法 根据不同药物干预情况分为5组:对照组、EPA组,DDP组、EPA+ DDP组、EPA+DDP+雷帕霉素组(EPA+ Rapa+ DDP组).细胞计数(CCK-8)试剂盒法和流式细胞仪检测T24细胞增殖抑制率和凋亡率,Western blot法检测凋亡因子[活化的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3(Cleaved Caspase-3)、B细胞淋巴瘤/白血病-2相关X蛋白(bax)],抗凋亡因子(bcl-2)和自噬反应相关因子(LC3-Ⅱ、Beclin-1)的表达.结果 与DDP组比较,EPA+ DDP组T24细胞的增殖抑制率明显增高[(73.19±6.92)%比(48.62±4.0)%,P=0.000],凋亡率明显增高[(64.30±6.53)%比(35.90±4.21%,P=0.010].Western blot检测显示,与DDP组比较,EPA+DDP组Cleaved Caspase-3、bax表达增加,而bcl-2、LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白表达减少(P均=0.000).EPA+ Rapa+DDP组增殖抑制率和凋亡率较EPA+ DDP组明显降低,同时自噬反应表达增加.结论 EPA预处理增强DDP抑制膀胱癌T24细胞增殖,促进细胞凋亡,提高DDP化疗敏感性,其机制可能是通过抑制化疗后增高的自噬反应.
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长链非编码RNA RPL41影响肾癌细胞迁移和侵袭过程
目的 观察长链非编码RNA(lncRNA) RPL41对肾癌细胞迁移和侵袭过程的影响.方法 实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)检测26例肾癌组织及3种肾癌细胞株(786-0、769-P、ACHN)中lncRNA RPL41的表达.通过慢病毒筛选稳转株后,噻唑蓝(MTT)实验、Transwell检测lncRNA RPL41对肾癌细胞的潜在生物功能影响.结果 lncRNA RPL41在26例肾癌组织中的表达量显著低于其在正常组织中的表达量(40.69±0.74比82.92±1.26,P=0.000,n=26),且lncRNA RPL41在肾癌细胞株769-P中表达水平高,其次是786-0,在ACHN中的表达量低(F =65.810,P =0.000,n=5).细胞功能实验表明,lncRNA RPL41对肾癌细胞迁移和侵袭过程产生了显著影响.786-0组迁移实验中细胞穿透数目分别为(150.90±14.89)个比(247.30±13.17)个比(260.30±18.96)个(n=10,P=0.000);ACHN组迁移实验中细胞穿透数目分别为(130.90±14.89)比(240.30±18.96)比(227.30±13.17)个(n=10,P=0.000).786-0组侵袭实验中细胞穿透数目分别为(72.90±14.89)个比(94.30±13.17)个比(102.20±16.19)个(n=10,P=0.008);ACHN组侵袭实验中细胞穿透数目分别为(72.90±14.89)个比(97.30±18.96)个比(84.30±13.17)个(n=5,P=0.007).结论 lncRNA RPL41在肾癌组织及细胞株中明显低表达,同时对肾癌细胞株的迁移和侵袭功能产生了明确的影响.
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骨组织内微血管可视化研究模型的建立
目的 建立一种骨内微血管可视化及形态学研究的新模型,测量血管参数并对模型可靠性进行评估.方法 10只新西兰大白兔行腹主动脉microfill灌注,取股骨远端标本进行固定、脱钙,利用microCT扫描三维重建对骨内微血管进行可视化研究,选取股骨远端标本制成厚约300 μm的硬组织切片,在荧光背景下观察骨内微血管分布及形态特征,对血管主要参数进行测量.结果 标本脱钙后进行microCT扫描重建,能够屏蔽骨组织CT值与灌注液CT值相近引起的干扰;厚切片荧光背景显像可以特异性显示微血管在骨组织中的分布及形态;在单位面积血管数、平均血管直径、血管面积分数测量中,microCT与组织学之间差异无统计学意义(P =0.075、0.921、0.661),但组织学切片中可视小血管直径达毛细血管级别,显著小于microCT测量结果[(9.03±1.14) μm比(12.61±2.01)μm,P=0.038].结论 血管灌注、microCT扫描三维重建结合厚切片荧光背景显像可作为一种骨内微血管可视化及形态学研究的可靠方法.
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前列腺癌近期研究回顾与展望
前列腺癌是男性常见的恶性肿瘤之一,其发病与年龄、遗传、饮食、环境和性激素多个因素有关.随着分子生物学、基因组学、表观遗传学等技术手段的成熟,人们对前列腺癌的发生发展、转移侵袭及由激素依赖性向去势抵抗进展的机制有了更深刻的认识.作者近年对前列腺癌基础研究的分子机制进行了多方面的详述.近半年有许多前列腺癌的基础及临床研究发表,本文就此进行总结和探讨,为前列腺癌诊断、治疗和预后提供新策略.
年 | 期数 |
2019 | 01 02 |
2018 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
2017 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
2016 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
2015 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
2014 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
2013 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
2012 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
2011 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 |
2010 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
2009 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
2008 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
2007 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
2006 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
2005 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
2004 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
2003 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
2002 | 01 02 03 04 05 06 |
2001 | 01 02 03 04 05 06 |
2000 | 01 02 03 04 05 06 |
1999 | 01 02 03 04 05 06 |
1998 | 01 02 |