中华实验外科杂志
Chinese Journal of Experimental Surgery 중화실험외과잡지
- 主管单位： 中国科学技术协会
- 主办单位： 中华医学会
- 影响因子： 0.75
- 审稿时间： 1-3个月
- 国际刊号： 1001-9030
- 国内刊号： 42-1213/R
- 论文标题 期刊级别 审稿状态
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人神经内分泌瘤细胞BON-1和H727细胞株三维培养模型的构建
目的 建立人神经内分泌瘤细胞的体外三维培养模型.方法 制备琼脂糖凝胶、海藻酸盐/聚丙烯酰胺共聚物(ALG/PAAm)水凝胶及聚乙二醇(PEG)交联聚甲基乙烯基醚-alt-马来酸(PMVE-alt-MA)水凝胶,基于这3种材料构建人神经内分泌瘤H727及BON-1细胞株三维培养模型,每24h通过倒置相差显微镜观察其形态学变化.结果 三维培养下H727及BON-1细胞的形态不同于二维平面培养;培养至1周左右,H727细胞在琼脂糖凝胶、ALG/PAAm水凝胶及PEG交联PMVE-alt-MA水凝胶中分别形成了球径350～ 450、150 ～ 250及50～100μnn的多细胞球体;而BON-1细胞在PEG交联PMVE-alt-MA水凝胶中则生长成球径150 ～ 200 μm的多细胞球体,但在另外两种材料中仅形成形状不规则的多细胞聚集体.结论 该3种材料可应用于H727及BON-1细胞株体外三维培养模型构建,且各有优劣之处,可根据具体的实验要求选择合适的培养材料.
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顺铂和铜绿假单胞菌注射液联合腹腔循环热灌注治疗兔胃癌伴幽门梗阻
目的 建立兔VX-2胃癌伴幽门梗阻模型,探讨顺铂(DDP)和铜绿假单胞菌注射液(PA-MSHA)联合腹腔循环热灌注对胃癌伴幽门梗阻兔模型的治疗效果及安全性.方法 通过注射VX-2肿瘤细胞悬液建立兔胃癌伴幽门梗阻模型,将42只兔模型随机分为对照组和治疗组.所有兔模型治疗前行血常规、肝肾功能、电解质检测,对照组兔21只,给予直接胃癌切除手术;治疗组兔21只,给予术前DDP和PA-MSHA联合腹腔循环热灌注后再行手术.记录联合腹腔循环热灌注化疗治疗后兔模型生存情况,所有兔死亡当天予以剖腹及开胸,观察胃窦部原发癌灶大小和幽门梗阻程度等,分别于治疗前开腹探查时、死亡当天取原发病灶及转移病灶标本,行苏木素-伊红(HE)染色,在光学显微镜下观察.兔死亡后取胃原位癌灶及转移癌灶.免疫组织化学检测血管内皮生长因子(VEGF)和增殖细胞核抗原(PCNA)表达水平.结果 实验组和对照组胃癌根治性切除率分别为85.5％(18/21)和66.7％(14/21),实验组显著高于对照组,差异有统计学意义(P =0.025).实验组与对照组在术中出血量、手术时间及术后发生吻合口瘘或十二指肠瘘、大出血、应激性溃疡出血和肠梗阻差异无统计学意义(P =0.253).而治疗组在术后发生腹腔感染、肺部感染及胃瘫较对照组明显降低(P=0.019).对照组死亡标本解剖见典型胃癌转移瘤特征,与对照组比较,实验组腹腔转移程度较轻,出现肝转移较少,转移结节较小.对照组实验性腹膜转移癌指数(ePCI)评分为(18.00±1.55)分,实验组ePCI评分为(12.00±1.79)分,两组间差异有统计学意义(P=0.013).对照组腹腔内粘连评分为(3.67 ±0.52)分,实验组腹腔内粘连评分为(1.17±0.75)分,两组间腹腔内粘连评分比较差异有统计学意义(P=0.016).对照组VEGF相对表达量为77.33-6.77,实验组VEGF相对表达量为200.17 ±4.26,对照组PCNA相对表达量为83.33±3.49,实验组PCNA相对表达量为184.83±3.76,两组比较差异均有统计学意义(P=0.006、0.011).结论 术前DDP和PA-MSHA联合腹腔循环热灌注化疗支持治疗对控制胃癌进展和缓解幽门梗阻具有较好效果,且安全性较高.
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芬戈莫德对小鼠类风湿关节炎骨质疏松的保护作用
目的 观察芬戈莫德(FTY720)对牛2型胶原诱导小鼠类风湿关节炎(RA)骨质疏松的保护作用.方法 2型胶原诱导小鼠RA骨质疏松症造模10周后分组,连续8周灌胃给予0.25、0.50、1.00 mg/kgFTY720,观察RA骨质疏松小鼠的体重、评分、钙磷含量、骨密度、形态学的变化.结果 FTY720给药第6～8周关节炎评分明显降低(P=0.000 ～0.038),给药8周时模型小鼠关节炎评分为(10.25±0.45)分,高剂量组小鼠评分降至(7.75±0.25)分;给药第5～8周后脚趾肿胀度明显降低(P =0.008 ～0.043),FTY720高剂量组小鼠给药8周时血清钙含量明显升高(P =0.033),FTY720中、高剂量组小鼠尿液钙含量明显降低(P=0.000);高剂量组小鼠的胫骨和股骨的骨密度明显升高(P =0.013 ～0.019),同时可改善模型小鼠软骨受损,骨小梁结构破坏等病理变化.结论 TY720可抑制小鼠RA骨质疏松发生.
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前列腺癌中精子相关抗原9与上皮-间充质转化、细胞外基质异常相关分析
目的 探讨精子相关抗原9 (SPAG9)与上皮-间充质转化(EMT)、细胞外基质(ECM)相关蛋白在前列腺癌中的表达及相关性.方法 应用免疫组织化学技术检测60例前列腺癌和30例前列腺增生组织中SPAG9、E-钙黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)和基质金属蛋白酶-2(MMP-2)的表达,并分析SPAG9与E-cadherin、Vimentin及MMP-2之间的相关性.结果 在转移性前列腺癌、非转移性前列腺癌和前列腺增生组织中,SPAG9蛋白表达的平均吸光度(A)值为466.34±13.52、284.98±25.69和106.01±13.58,而E-cadherin蛋白在3组中表达的平均A值为148.62±28.31、286.73±18.73和417.73±12.90,组间比较差异均有统计学意义(P=0.000),Vimentin为285.79±15.85、184.20±21.31和79.56±7.96,组间比较差异均有统计学意义(P=0.000),MMP-2为269.97±15.74、175.82 ±21.81和87.86±17.61,组间比较差异均有统计学意义(P=0.000);SPAG9、E-cadherin、Vimentin和MMP-2经Spearman等级相关分析,其相关系数为-0.431、0.443和0.610,P值分别为0.017、0.014和0.001,差异有统计学意义,说明SPAG9、E-cadherin、Vimentin和MMP-2在前列腺癌组织中的表达明显相关,且与E-cadherin呈负相关,而与Vimentin、MMP-2呈正相关.结论 SPAG9可能通过调控EMT、ECM相关蛋白E-cadherin、Vimentin和MMP-2促进前列腺癌的发生、转移.
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人低氧诱导因子-1α和LIM矿化蛋白-1联合表达重组腺病毒构建及其成骨作用
目的 利用内部核糖体进入位点(IRES)连接低氧诱导因子-1α(HIF-1 α)与LIM矿化蛋白-1(LMP-1),构建同时表达LMP-1和HIF-1α的腺病毒载体,检测其在体外培养大鼠骨髓基质干细胞(BMSCs)的成骨作用.方法 应用聚合酶链反应(PCR)法扩增出人HIF-1α (2 481 bp)和LMP-1(1 374 bp)及IRES(564 bp)序列,依次插入pShuttle-IRES-hrGFP-1中构建腺病毒穿梭质粒pS-HIF-LMP-1-GFP;将其与质粒pAdEasy-1在BJ5183细胞中同源重组,得到重组腺病毒质粒(pAd-HIF-LMP-1-GFP).经Pac I酶切转染AD293细胞进行包装得到重组腺病毒Ad-HIF-LMP-1-GFP.以腺病毒为载体,将人HIF-1α和LMP-1联合基因转染大鼠BMSCs细胞,分别观察转染后实验组与对照组碱性磷酸酶活性、钙形成以及骨钙素和核心结合蛋白因子2(Runx2)的表达变化,探讨HIF-1α与LMP-1联合表达的成骨作用.结果 成功获取联合表达HIF-1α与LMP-1的重组腺病毒.HIF-1 α和LMP-1基因能在BMSCs中高效表达,转染后BMSCs的碱性磷酸酶活性增强,与对照组比较,差异有统计学意义(P =0.000),活性分别为0.145、0.160、0.170、0.167(0.160 ±0.011) ng/μg蛋白和0.045、0.057、0.056、0.054(0.053 ±0.005) ng/μg蛋白;钙沉积明显增多,与对照组比较,差异有统计学意义(P=0.001),钙形成定量分别为0.636、0.544、0.591、0.515 (0.570 ±0.050)和0.121、0.150、0.144、0.167(0.145 ±0.019);骨钙素表达显著提高,与对照组比较,差异有统计学意义(P=0.017),分别为2.688、2.997、2.777(2.820±0.159)和2.009、1.916、1.944(1.956±0.047);Runx2的表达明显增强,与对照组比较,差异有统计学意义(P=0.000),分别为0.440、0.465、0.456(0.454±0.0L0)和0.096、0.108、0.117(0.107±0.010).结论 成功利用IRES序列连接人HIF-1α和LMP-1基因构建重组腺病毒载体,Ad-HIF-LMP-1-GFP转染BMSCs后,能明显促进BMSCs向成骨细胞分化.
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nm23-H1基因对肺癌细胞株L9981中Wnt信号传导通路中糖原合成激酶-3β的表达和活性的影响
目的 观察转移抑制基因nm23-H1对肺癌细胞株L9981中Wnt信号传导通路中糖原合成激酶-3β(GSK-3β)的表达量和活性的影响.方法 将稳定转染nm23-H1基因的肺癌细胞株、原代细胞株L9981和空载体转染细胞株培养传代,分别设为nm23-H1转染组、对照组和空白转染组.应用Western blot分别检测应用20 mmol/L LiCl处理前后3组肺癌细胞株胞质、胞核中GSK-3β的表达水平,测定上述肺癌细胞株胞质和胞核中的GSK-3β活性.结果 (1)nm23-H1转染组胞质和胞核中GSK-3β蛋白表达量分别为(6 639±503)和(4481 ±446)A,空白转染组分别为(645±352)和(726 ±68)A,对照组分别为(763±267)和(683 ±49)A.3组细胞株间胞质和胞核中GSK-3β表达量差异有统计学意义(P =0.025).两两比较:nm23-H1转染组胞质和胞核GSK-3β表达水平均显著高于空白转染组和对照组(P=0.017),而后两者之间比较均差异无统计学意义(P=0.094).(2)nm23-H1转染组胞质和胞核GSK-3β激酶活性分别为(29 371 ±2 492)和(9647±859)每分钟脉冲数,空白转染组分别为(11241 ±1495)和(1 492±176)每分钟脉冲数,对照组分别为(14 271±1 137)和(1 853±113)每分钟脉冲数.3组细胞株间胞质和胞核中GSK-3β酶活性差异有统计学意义(P =0.032),两两比较:nm23-H1转染组,胞质和胞核GSK-3β酶活性均显著高于空白转染组和对照组(P =0.027),而后两者之间比较均差异无统计学意义(P=0.131).(3)经20 mmol/L LiCl处理后,nm23-H1转染组胞质和胞核中GK-3β表达量分别为(5 037±427)和(823±350)A,与处理前比较均差异无统计学意义(P=0.168),空白转染组细胞株经LiCl处理后胞质和胞核中GSK-3β表达量分别为(2 174 ±126)和(248±12)A,对照组则分别为(2 273±128)和(253±14)A,两个细胞株胞质和胞核中GSK-3β表达量均显著低于处理前(P=0.012、0.015).(4)经LiCl处理后,nm23-H1转染组胞质和胞核GSK-3β激酶活性分别为(12 837±1 042)和(748 ±215)每分钟脉冲数,空白转染组分别为(4 739 ±401)和(947±126)每分钟脉冲数,对照组分别为(4 638 ±401)和(1 162±127)每分钟脉冲数,3组细胞株胞质和胞核GSK-3β激酶活性均显著低于处理前(P=0.006、0.029、0.010).结论 nm23-H1基因转染能显著上调人肺癌细胞L9981中GSK-3β的蛋白表达和活性.其可能通过上调人肺癌细胞中GSK-3β的蛋白表达和活性抑制Wnt信号传导而发挥作用.
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姜黄素联合顺铂对HepG2肝癌细胞增殖、凋亡、迁移及侵袭的影响
目的 观察姜黄素联合顺铂对HepG2肝癌细胞的增殖、凋亡、迁移及侵袭的影响.方法 肝癌HepG2细胞加药处理,分为二甲基亚砜(DMSO)对照组、姜黄素处理组(5、10、20 μmol/L)、顺铂处理组(1、5、10 μmol/L)和联合用药处理组(5μmol/L姜黄素+5μmol/L顺铂、10 μmol/L姜黄素+5 μmol/L顺铂).使用噻唑蓝(MTT)法检测不同药物处理后HepG2细胞的增殖能力的变化;使用Hoechst 33258检测药物处理后细胞凋亡的变化;应用划痕愈合实验和Transwell侵袭实验检测药物处理后肿瘤细胞的迁移和侵袭能力的变化.结果 MTT结果显示联合用药组与5μmol/L顺铂组比较细胞存活率明显降低[(40.27±4.80)％比(61.80±9.14)％,P =0.023;(19.37±5.02)％比(61.80±9.14)％,P=0.002];Hoechst 33258染核10 μmol/L姜黄素+5μmol/L顺铂组与5μmol/L顺铂组比较细胞凋亡率增加[(18.95±1.30)％比(10.35±1.46)％,P =0.012];划痕愈合实验结果显示联合用药组较5 μmol/L顺铂组迁移愈合率明显下降[(33.81±1.63)％比(39.77±2.48)％,P =0.026;(24.54 ±4.93)％比(39.77±2.48)％,P=0.003],联合用药后可抑制细胞迁移能力;Transwell侵袭实验示联合用药组侵袭细胞数较5μmol/L顺铂组比较明显减少[(24.33±2.52)个比(32.00±3.61)个,P=0.039;(15.67 ±3.06)个比(32.00±3.61)个,P=0.004],提示联合用药后细胞侵袭能力下降.结论 姜黄素联合顺铂可以促进HepG2细胞凋亡,抑制其增殖、迁移和侵袭能力,且较同浓度单药作用增强.
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莪术醇对膀胱癌EJ细胞增殖、凋亡和果蝇zeste基因增强子同源物2表达的影响
目的 观察莪术醇对体外培养人膀胱癌EJ细胞增殖、凋亡及果蝇zeste基因增强子同源物2(EZH2)表达的影响,并探讨其分子机制.方法 使用不同浓度莪术醇(12.5、25.0、50.0、100.0 mg/L)及含1％无水乙醇培养基的对照组干预处理人膀胱癌EJ细胞,细胞计数试剂盒(CCK-8)法检测细胞的增殖能力,Hoechst 33258荧光染色法观察细胞凋亡的形态变化,流式细胞术检测细胞凋亡率,反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot检测细胞中EZH2 mRNA及蛋白的表达.结果 莪术醇对EJ细胞的增殖有抑制作用,抑制率分别为(32.94±0.93)％、(46.75±1.28)％、(58.16±0.76)％、(69.13±1.94)％,并诱导其凋亡,凋亡率为(3.60±0.46)％、(6.70±1.83)％、(16.20±1.61)％、(28.70±2.65)％,呈一定的浓度和时间依赖性(P=0.006、0.028、0.003、0.000);在高浓度莪术醇组的细胞荧光染色结果中可发现典型的细胞凋亡形态;随着莪术醇浓度的增加,EZH2 mRNA和蛋白的表达量逐渐降低,与对照组比较差异有统计学意义(P=0.023、0.002、0.001、0.000,0.016、0.001、0.000、0.000).结论 莪术醇可抑制膀胱癌EJ细胞的体外增殖并诱导细胞凋亡,其机制可能与EZH2基因表达下调有关.
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吉西他滨对人胶质瘤SHG-44细胞增殖和凋亡的作用
目的 观察抗癌药物吉西他滨对人胶质瘤SHG-44细胞增殖和凋亡的影响.方法 细胞计数试剂盒(CCK-8)检测不同浓度吉西他滨和不同药物处理时间对SHG-44细胞增殖的影响;Hochest33258和膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素(Annexin V-FITC)/碘化丙锭(PI)染色技术检测吉西他滨对SHG-44细胞凋亡的影响;后,利用半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶(Caspase)-8/Caspase-9/Caspase-3特异性抑制剂预处理细胞后,检测了吉西他滨对细胞增殖的影响.结果 随着吉西他滨浓度和处理时间的增加,细胞抑制率也随之增高(P=0.003);吉西他滨处理细胞24 h后,细胞核发生固缩,并有凋亡小体出现;流式细胞仪结果显示,0.1、1.0、10.0μmol/L吉西他滨诱导的细胞凋亡率分别为(11.4±3.9)％、(34.6±4.2)％、(74.9±4.6)％;抑制Caspase-8和Caspase-3,可以明显抑制吉西他滨引起的细胞活性下降.结论 吉西他滨可以抑制细胞浓度和时间依赖性的增殖,并诱导SHG-44细胞内源性Caspase-8和Caspase-3介导的凋亡.
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心跳骤停及复苏过程中脑损伤的程度及其机制
目的 探讨大鼠心跳骤停及复苏过程中脑损伤的程度及机制.方法 选用雄性Sprague Dawley (SD)大鼠16只,随机分为假手术组(Sham)和心跳骤停心肺复苏组(CA/CPR).采用窒息法建立大鼠心跳骤停模型.双抗体夹心酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清中神经元烯醇化酶(NSE)、S100β蛋白水平;Western blot检测海马凋亡蛋白B细胞淋巴瘤/白血病-2相关X蛋白(bax)、B细胞淋巴瘤/白血病-2(bcl-2)、半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶(Caspase)-3表达;原位末端转移酶标记法(TUNEL)检测神经凋亡细胞并观察大鼠脑形态学改变.结果 与Sham组比较,CA/CPR组S100β在复苏后0、3、6h含量均较高,分别为(4.488±0.762)、(6.003 ±0.718)、(5.913±1.817) ng/ml,且差异有统计学意义(P=0.010、0.000、0.038);NSE在复苏后6h含量为(15.628 ±3.750) ng/ml,也高于对照组的(9.376±2.865) ng/ml,差异有统计学意义(P =0.038).CA/CPR组NSE、Sl00β蛋白水平呈上升趋势,S100β升高0、3h差异有统计学意义(P=0.031、0.012).与Sham组bax (0.326 ±0.041),Caspase-3(0.394±0.038),bcl-2 (0.212±0.039)比较,CA/CPR组bax (0.731±0.018)、Caspase-3 (0.445±0.028)表达升高,而bcl-2 (0.125±0.036)表达降低,且差异均有统计学意义(P=0.000、0.001、0.003).脑组织形态以CA/CPR组改变更明显.CA/CPR组神经元凋亡率为(29.72±6.29)％,较Sham组高,差异有统计学意义(P =0.000).结论 心跳骤停5 min及复苏成功的大鼠脑损伤比较明显,且随时间逐渐加重,可能与触发凋亡机制有关.
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过氧化物酶体增殖物激活受体-γ在七氟醚后处理减轻小鼠心肌缺血再灌注损伤中的作用
目的 观察七氟醚对缺血再灌注心肌中过氧化物酶体增殖物激活受体-γ(PPAR-γ)的影响并探讨PPAR-γ在七氟醚后处理减轻心肌缺血再灌注损伤中的作用.方法 雄性C57BL/6小鼠按随机数字表法分为4组(n=5):对照组(Control组)、七氟醚后处理组(SPostC组)、七氟醚后处理+ PPAR-γ抑制剂组(SPostC+ GW9662组)和PPAR-γ抑制剂组(GW9662组),各组均建立小鼠在体心肌缺血再灌注损伤模型(缺血30 min,再灌注120 min),再灌注开始15 min内吸入3.4％七氟醚作为七氟醚后处理,各组均在缺血前30 min腹腔注射抑制剂或安慰剂.实验中测定小鼠心肌缺血前和再灌注后的心率(HR)及平均动脉压(MAP);实验结束后留取心脏,测定心肌梗死面积和PPAR-γ转录活性.结果 与Control组[(24.68±1.03)％,0.081 8±0.0060]比较,SPostC组的心肌梗死面积[(18.70±2.58)％]显著降低(P =0.000),同时PPAR-γ转录活性(0.0918±0.006 8)升高(P=0.026),SPostC+ GW9662组、GW9662组的心肌梗死面积[(23.55±1.60)％,(23.14±1.46)％,P=0.324,P=0.185]和PPAR-γ转录活性(0.0824±0.005 7、0.0802±0.007 2)与Control组比较差异无统计学意义(P =0.887,P=0.690).缺血前HR及MAP在各组间差异无统计学意义(P =0.763,P=0.455),再灌注后HR及MAP在各组间差异亦无统计学意义(P=0.801,P=0.341).结论 七氟醚后处理能够活化再灌注心肌中的PPAR-γ,提高其转录活性,从而降低心肌缺血再灌注损伤后的心肌梗死面积,发挥其心肌保护作用.
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微小RNA-23a在恶性胶质瘤患者血清和肿瘤组织表达及其调控ATP5A1基因表达的作用
目的 检测微小RNA(miRNA,miR)-23a在恶性胶质瘤(GBM)患者血清和肿瘤组织表达,探讨其在GBM中的功能.方法 通过实时定量反转录聚合酶链反应(RT-qPCR)检测GBM患者血清和肿瘤组织miR-23a表达变化;采用miR-23a mimic转染GBM细胞株U87MG、U251、T98G、A172,并用CellTiter-Glo(R) Luminescent Cell Viability Assay检测细胞生长,同时测定转染miR-23amimic的U87MG、U251细胞实体瘤生长;通过RT-qPCR检测GBM患者组织ATP5A1 mRNA表达,免疫组织化学方法检测肿瘤组织ATP5A1蛋白的表达;用miR-23a mimic转染GBM细胞株U87MG、U251、T98G、A172,Western blot检测ATP5A1蛋白的表达变化.结果 GBM患者血清和肿瘤组织miR-23a表达分别为0.40±0.18和1.00±0.12,明显低于癌旁组织(1.50 ±0.56) (P=0.005)和健康人血清(2.60 ±0.45) (P=0.005),同时miR-23a mimic可以抑制GBM细胞株U87MG、U251、T98G、A172的生长以及U87MG、U251实体瘤的生长(P=0.011),U87MG和U251感染pLKO.1慢病毒的细胞实体瘤大小分别为(597.1 ±95.4) cm3和(429.5±78.7)cm3,感染miR-23a mimic的分别为(153.2±38.6)cm3和(168.7±33.1) cm3(P=0.008);RT-qPCR以及免疫组织化学检测表明ATP5A1 (5.4±1.1)在GBM肿瘤组织中表达明显升高,而miR-23a mimic可以降低ATP5A1在GBM细胞株U87MG、U251、T98G、A172中的表达.结论 miR-23a具有抑制GBM细胞株生长和实体瘤形成的作用,miR-23a可以调节ATP5A1蛋白的表达.
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楼梯实验检测中脑细胞移植治疗亨廷顿病大鼠的运动功能修复效果
目的 观察不同测试条件下楼梯实验用于检测亨廷顿病大鼠前肢运功功能恢复的敏感性,探讨多能干细胞的移植治疗及建模作用.方法 将SD大鼠48只,分为对照组、毁损组和移植组,每组16只.对照组不予任何处理,其余两组均用奎宁酸(QA)脑内注射,并向移植组注射胎龄为14d子鼠的腹侧中脑(VM)细胞.每个组分别分为两个亚组,在移植后第5、12、17、19周进行楼梯实验,判定在不同密度糖丸布置下,大鼠抓握和取食能力的不同表现;对照组和移植组在第28周进行DARPP-32染色,评估测算移植物的体积,移植物中DARPP-32阳性细胞数量.结果 在双侧和单侧强迫测试中,仅在高密度配置条件下才能观测到移植物介导治疗的功能修复,大鼠抓握[(32.9±4.5、47.4±2.8,P=0.024);(32.7±5.1、42.5±3.9,P=0.029);(35.6±2.8、46.1±4.1,P=0.027]、大鼠取食(27.5±6.1、30.1±4.0,P=0.038);(21.6±4.6、29.3±2.8,P=0.031);(21.6±4.6、29.3±2.8,P=0.033)在低密度配置情况下则没有.结论 在特定的测试条件下,楼梯实验可检测VM细胞诱导等移植治疗的亨廷顿病大鼠运动功能改善.
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阿托伐他汀预处理对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用
目的 观察阿托伐他汀预处理对缺血再灌注损伤大鼠心肌细胞保护作用,并探讨其作用机制.方法 将40只健康雄性SD大鼠随机分为4组,即假手术组(A组,n=10)、心肌缺血再灌注损伤组(B组,n=10)、阿托伐他汀灌胃预处理组(C组,20 mg/d;D组,40 mg/d).除A组外均建立在体大鼠心肌缺血再灌注损伤模型.苏木素-伊红(HE)染色法观察大鼠心肌细胞病理学改变;反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)测定凋亡相关基因B细胞淋巴瘤/白血病-2(bcl-2)、bcl-2相关X蛋白(bax) mRNA表达水平,检测大鼠心肌组织中超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)水平的变化.结果 与A组比较,B组和各预处理组均出现明确的心肌缺血和心肌梗死区域;C、D预处理组中心肌细胞bcl-2 mRNA表达水平(3.31±0.27,t=2.231,P=0.028;4.93±0.53,t=2.125,P=0.034)以及SOD活性[(59.81±6.02) U/mg蛋白,t=3.510,P=0.000;(68.78±4.37) U/mg蛋白,t=4.439,P=0.000]均较B组[1.67±0.31、(32.95±4.51) U/mg蛋白]显著提高,bax mRNA表达水平(3.28±0.31,t=3.630,P=0.000;2.06±0.41,t=4.039,P=0.000)以及MDA含量[(4.63±0.27) nmol/mg蛋白,t=2.151,P=0.031;(3.55±0.57) nmol/mg蛋白,t=2.445,P=0.024]较B组[5.70±0.42、(6.77±0.44) nmol/mg蛋白]明显降低.结论 阿托伐他汀预处理能够明显增强抗氧化酶活性,抑制脂质过氧化,减少缺血再灌注损伤诱导的心肌细胞凋亡作用,减轻再灌注造成的损伤,具有较好的心肌保护作用.
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过表达SOCS1分子的树突状细胞诱导T细胞无能及其对小鼠移植物的免疫保护作用
目的 探讨过表达细胞因子信号抑制因子1(SOCS1)的树突状细胞(DC)对T细胞功能的影响和对小鼠移植物的免疫保护作用及其机制.方法 通过腺病毒将SOCS1基因转入小鼠DC,观察SOCS1基因修饰DC表型及功能变化;建立小鼠同种异体胰岛移植模型,各组受体于术前24h分别输入DC、DC-SOCS1细胞或磷酸盐缓冲液(PBS),术后观察各组移植胰岛存活时间,并于术后第7天检测受体糖耐量、移植胰岛的病理学改变、脾脏及引流淋巴结内T细胞亚群及细胞因子的含量变化.结果 DC-SOCS1表诱导T细胞的增殖能力明显弱于DC(19.9％比51.1％,P＜0.05).DC-SOCS1组移植胰岛平均生存时间为(37.00±2.19)d,较空白组[(20.00±0.55)d,P=0.008]及DC组[(10.00±0.45)d,P=0.001]均显著延长.移植术后第7日,DC-SOCS1组受体较其他组对葡萄糖的耐受良好,组织学结果表明DC-SOCS1组受体胰岛移植物活性更优.DC-SOCS1组小鼠脾脏内辅助性T细胞(Th1)及细胞毒性T细胞(Tc1)的含量[(9.92±1.57)％,P=0.027]、脾脏内CD4+细胞[(17.77±2.80)％,P=0.007]、CD8+细胞[(14.92±2.18)％,P=0.004]及引流淋巴结内的CD4+淋巴细胞[(26.00±2.02)％,P=0.034]明显减少.结论 SOCS1基因抑制DC成熟,诱导T细胞无能并保护胰岛移植物.
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脾动脉结扎对部分肝切除大鼠肝再生过程中转化生长因子-α表达的影响
目的 观察脾动脉结扎对部分肝切除大鼠肝脏再生过程中转化生长因子-α(TGF-α)表达的影响,探讨脾动脉结扎对肝再生的影响.方法 将72只雄性SD大鼠随机分为3组:假手术组(A组):假手术处理;70％肝切除组(B组):行70％肝切除;70％肝切除±脾动脉结扎组(C组):结扎脾动脉,其余操作同B组.每组再分为3个阶段检测:术后24h、术后48 h、术后72 h,采用免疫组织化学方法检测肝组织中TGF-α的表达,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清中TGF-α的水平.结果 与A组比较,术后24、48和72 h血清TGF-α水平在B组[(242.35±9.33)、(163.64±9.22)、(206.42 ±8.42) pg/ml]和C组[(259.00±11.50)、(170.77±9.04)、(212.12± 10.63) pg/ml]均明显升高(P=0.000);术后24、48、72 h肝组织中TGF-α的表达水平均明显增高(P =0.000).与B组比较,C组术后24 h血清中TGF-α水平和肝组织中TGF-α的表达水平均增高(P=0.006,P=0.019),在术后48、72 h血清中TGF-α水平和肝组织中TGF-α的表达水平与C组比较差异无统计学意义(P=0.163、P=0.074;P =0.194、P=0.096).结论 结扎脾动脉可促进70％肝切除大鼠术后24 h TGF-α的表达,提示脾动脉结扎可能促进了70％肝切除大鼠术后早期(24 h)肝脏的再生.
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小干扰RNA沉默活体内芳香烃受体核转运子基因对结肠癌HCT8细胞生长的影响
目的 观察小干扰RNA (siRNA)沉默活体内芳香烃受体核转运子(ARNT)基因对结肠癌HCT8细胞生长及体内成瘤的影响.方法 ARNT-短发卡RNA(shRNA)慢病毒转染结肠癌HCT8细胞,建立裸鼠皮下移植瘤模型,聚合酶链反应(PCR)法测定HCT8细胞中ARNT mRNA表达量,Western blot法测定HCT8细胞中ARNT蛋白水平,细胞计数试剂盒(CCK-8)法测定HCT8细胞增殖,流式细胞仪测定HCT8细胞凋亡,建模后1个月称取移植瘤重量、测量移植瘤体积.结果 siRNA-ARNT组ARNT mRNA相对表达量(0.489±0.057)显著低于siRNA-NC组(0.921 ±0.102)和空白对照组(1.000±0.000) (P=0.000).siRNA-ARNT组ARNT蛋白表达量(0.478 ±0.025)显著低于siRNA-NC组(0.818±0.017)和空白对照组(0.827 ±0.013) (P=0.000).siRNA-ARNT组细胞24、48、72 h吸光度(A)值均高于siRNA-NC组(0.512 ±0.107、1.012±0.123、1.121±0.128)和空白对照组(0.503±0.956、0.989 ±0.121、1.116±0.131)(P =0.000、0.000、0.000).siRNA-ARNT组细胞凋亡率(55.13±2.78)％高于空白对照组[(4.75±0.68)％,P=0.000],低于siRNA-NC组[(68.32±3.12)％,P=0.000],siRNA-NC组细胞凋亡率高于空白对照组(P=0.000).siRNA-ARNT组大鼠移植瘤重量[(0.551±0.171)g]和体积[(0.557±0.153) cm3]均高于siRNA-NC组[(0.351±0.082)g、(0.414±0.071) cm3]和空白对照组[(0.325±0.111)g、(0.396±0.063) cm3,P=0.000、0.000].结论 沉默ARNT基因促进结肠癌HCT8细胞增殖、抑制HCT8细胞凋亡、促进体内移植瘤生长,ARNT基因可能为结肠癌的抑癌基因.
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瘦素对结肠癌细胞SW480增殖和凋亡的影响
目的 观察瘦素对人结肠癌SW480细胞增殖及凋亡的影响.方法 分别用不同浓度的瘦素(0、20、50、100、200 ng/ml)处理人结肠癌SW480细胞12、24、36、48 h后,采用细胞计数试剂盒(CCK-8)试剂盒检测各组细胞的增殖率;以血清饥饿诱导细胞凋亡,同时给予瘦素刺激,膜联蛋白V(Annexin V)/碘化丙锭(PI)双染及流式细胞术检测各组细胞凋亡率;反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测各组SW480细胞中生存素(Survivin)和β-连环蛋白(β-catenin)基因的mRNA表达.结果 与对照组比较,随着瘦素浓度的上升(20、50、100、200 ng/ml),结肠癌SW480细胞的增殖率[12 h:(118.1±2.0)％、(132.6±3.9)％、(141.9±1.3)％、(145.6±4.9)％,P=0.000、0.000、0.000、0.000;24 h:(120.8±2.7)％、(137.0±1.0)％、(149.7±1.6)％、(176.6±2.9)％,P=0.000、0.000、0.000、0.000;36 h:(123.9±0.5)％、(133.9±0.8)％、(169.4±1.1)％、(182.8±1.1)％,P=0.001、0.001、0.000、0.000;48 h:(132.7±1.2)％、(146.0±3.3)％、(172.0±0.6)％、(185.5±0.5)％,P=0.001、0.005、0.000、0.000]不断升高,同时血清饥饿诱导的细胞凋亡率分别为(30.23±0.15)％、(28.87±1.01)％、(18.23±0.35)％、(16.33±0.51)％、(9.20±0.26)％,不断降低,P=0.388、0.000、0.001、0.000.不同剂量瘦素处理组Survivin和β-catenin基因的mRNA与对照组比较,差异有统计学意义(P=0.007、0.003、0.000、0.000;P=0.000、0.000、0.000、0.000).结论 瘦素可促进结肠癌细胞的增殖并抑制其凋亡.
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外泌体中微小RNA-19a靶向第10号染色体上缺失与张力蛋白同源的磷酸酯酶基因/蛋白激酶B/p53轴介导乳腺癌耐药性的机制
目的 探讨微小RNA(miRNA,miR)-19a通过乳腺癌阿霉素(ADM)耐药癌株MCF-7/A来源的外泌体在化疗药物耐药性传递中的作用及其潜在的分子机制.方法 采用超速分级离心法从乳腺癌细胞培养上清中分离提取外泌体,投射电镜及Nanosight对外泌体进行观察鉴定.利用重组慢病毒载体构建稳定表达绿色荧光蛋白(GFP)的乳腺癌敏感细胞株GFP-MCF-7/S,通过细胞-细胞及细胞-外泌体共培养实验观察耐药性传递现象.实时定量聚合酶链反应(Real-time PCR)、Western blot及细胞转染技术检测miR-19a及第10号染色体上缺失与张力蛋白同源的磷酸酯酶基因/蛋白激酶B/p53(PTEN/Akt/p53)轴在耐药性发生过程中的作用.结果 与MCF-7/S比较,MCF-7/A细胞中miR-19a的表达(1.03 ±0.16比3.56±0.58,P=0.002)显著增加,miR-19a抑制剂处理后MCF-7/A细胞对化疗药物ADM的敏感性[(41.17±10.65)％比(23.45±8.89)％,P=0.011]显著增加.电镜下观察两种乳腺癌细胞分泌的外泌体均呈圆形或椭圆形,直径为40 ～ 100 nm.荧光显微镜下对GFP的观察及细胞计数试剂盒(CCK-8)法对细胞增殖抑制率的检测结果显示ADM对MCF-7/S +MCF-7/A及MCF3/S+ MCF-7/A exos组细胞的增殖抑制率显著低于MCF-7/S+ MCF-7/S[(31.50 ±6.68)％比(51.20±12.44)％,P =0.006]及MCF-7/S+MCF-7/Sexos[(27.67±6.02)％比(49.65±10.52)％,P=0.000]组细胞,且伴随着细胞miR-19a表达的增加(1.01 ±0.13比2.67±0.62,P=0.000).Western blot检测结果显示外泌体中miR-19a能够通过显著抑制PTEN(1.15±0.18比0.67 ±0.13,P =0.000)及p53(0.99 ±0.18比0.49±0.11,P=0.005)蛋白的表达,增加Akt的磷酸化水平(1.15 ±0.18比0.67 ±0.13,P=0.000)促进受体细胞耐药的发生.结论 miR-19a可通过外泌体包裹的形式传递乳腺癌细胞间的耐药性,进而通过对PTEN/Akt/p53轴的调控促进受体细胞耐药的发生.
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骨骼肌来源和骨骼肌筋膜来源的间充质干细胞成软骨差异的研究
目的 观察骨骼肌来源和骨骼肌筋膜来源的间充质干细胞成软骨能力的差异,以期找到合适的种子细胞达到抑制甚至逆转骨性关节炎软骨细胞退变.方法 取膝关节置换的患者的髌下骨骼肌组织及骨骼肌筋膜组织,酶消化法原代培养至第3代.波形蛋白(Vimentin)免疫荧光鉴定两种细胞,然后两种细胞进行三维立体培养(3D培养)来模拟体内细胞的生长环境并石蜡切片,阿尔新蓝(Alcian blue)染色研究两种细胞的成软骨能力差异.同时通过实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)检测成软骨及成骨标志物的基因表达量差异.结果 骨骼肌干细胞和骨骼肌筋膜干细胞爬片Vimentin免疫荧光结果,可以看到骨骼肌干细胞Vimentin免疫荧光的信号很弱,而骨骼肌筋膜干细胞的Vimentin免疫荧光呈阳性表现;两种细胞培养第14及第21天在3D培养条件下Alcian blue染色的情况是染色均有加深,但骨骼肌筋膜干细胞更加明显;骨骼肌筋膜干细胞的成软骨标志物性别决定区Y框蛋白9(SOX9)、Ⅱ型胶原(CollagenⅡ)表达量明显高于骨骼肌干细胞.结论 骨骼肌筋膜来源间充质干细胞属于成纤维类细胞,而骨骼肌来源间充质干细胞属于成肌细胞.骨骼肌筋膜来源间充质干细胞成软骨能力较骨骼肌来源间充质干细胞更强,相反骨骼肌来源间充质干细胞的成骨能力更强.
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复元胶囊对大鼠骨折转化生长因子-β1、胰岛素样生长因子-1、骨钙素、Ⅰ型胶原表达的影响
目的 探讨复元胶囊对糖尿病骨折大鼠血清中转化生长因子-β1(TGF-β1)、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、骨钙素及Ⅰ型胶原表达水平的影响.方法 随机抽样法将48只SD雄性大鼠分为复元胶囊组(A组,n=24,高、中、低剂量亚组各8只)、胰岛素组(B组,n=8)、模型组(C组,n=8)和空白对照组(D组,n=8).腹腔内注射链脲佐菌素诱导糖尿病(D组除外),建立左胫骨上段斜型骨折模型后复位夹板外固定干预;A组根据高、中、低剂量(1.23、0.82、0.41 g/kg)予以复元胶囊灌胃给药,B组用6～8U胰岛素治疗,C、D组等量生理盐水局部注射.建模后1、3、5周检测各组大鼠血清中TGF-β1、IGF-1、骨钙素及Ⅰ型胶原表达情况;建模5周处死大鼠,检查其主要脏器有无病理改变.结果 C组大鼠各时间点血清中TGF-β1[(116.52±10.55)、(117.25±10.37)、(117.82±10.24) ng/L]、IGF-1[(3.16±0.42)、(3.18±0.44)、(3.21±0.41) ng/ml]、骨钙素[(3.03±0.91)、(4.06±0.92)、(12.05±2.91) U/ml]及Ⅰ型胶原[(5.32±1.15)、(5.36±1.18)、(14.34±2.15) pg/ml]表达水平均明显低于其他组大鼠(F=10.369、16.836、20.583、9.364、9.025、10.352、9.684、18.364、22.536、8.365、14.834、16.286,P=0.014、0.000、0.000、0.019、0.020、0.014、0.018、0.000、0.000,0.022、0.000、0.000);建模1周时,B组、A组3个亚组大鼠血清中各指标表达水平均略高于D组,但比较差异无统计学意义(P =0.752、0.694、0.633、0.645、0.160、0.153、0.120、0.134、0.853、0.805、0.820、0.822、0.909、0.884、0.857、0.870);建模后3、5周时,B组、A组高剂量组大鼠血清中各指标表达水平虽明显高于D组(P=0.005、0.003、0.000、0.000、0.021、0.024、0.017、0.018、0.000、0.000、0.007、0.007、0.000、0.000、0.013、0.014),但显著低于A组中、低剂量组大鼠(P =0.032、0.030、0.045、0.042、0.033、0.030、0.036、0.034、0.016、0.016、0.015、0.016、0.020、0.023、0.017、0.020、0.002、0.001、0.001、0.001、0.021、0.022、0.020、0.021、0.003、0.004、0.003、0.003、0.010、0.011、0.010、0.010);A组中、低剂量组大鼠各时间点血清中各指标表达水平比较,差异均无统计学意义(P =0.988、0.979、0.978、0.964、0.966、0.932、1.000、0.995、0.985、0.987、0.946、0.985).连续给药5周后,除A组高剂量组中1只大鼠存在肾脏近曲小管上皮细胞局部轻度水肿改变外,剩余大鼠重要脏器均未见异常病理形态改变.结论 复元胶囊能有效调节糖尿病骨折大鼠血清中TGF-β1、IGF-1、骨钙素及Ⅰ型胶原表达,对于其骨折断端愈合有利.
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人Runt相关转录因子3通过调控上皮-间充质转化抑制涎腺腺样囊性癌转移
目的 观察过表达人Runt相关转录因子3(RUNX3)对腺样囊性癌细胞上皮-间充质转化(EMT)的影响.方法 利用慢病毒感染腺样囊性癌SACC-83、SACC-LM细胞,获得稳定过表达RUNX3的细胞株(过表达RUNX3组),并设置空白慢病毒感染的阴性对照细胞株(阴性对照组).用Western blot法检测RUNX3蛋白过表达;采用实时定量反转录聚合酶链反应(RT-qPCR)和Western blot检测过表达RUNX3对SACC-83、SACC-LM细胞中E-钙黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)、纤维粘连蛋白(Fibronectin)及Snail基因mRNA和蛋白表达水平的影响;采用Western blot检测过表达RUNX3对SACC-83、SACC-LM细胞基质金属蛋白酶(MMP)-2和MMP-9表达的影响.采用细胞划痕实验检测细胞迁移能力.结果 慢病毒感染SACC-83、SACC-LM细胞后,其RUNX3蛋白表达[(0.968±0.035)、(0.956±0.037)]均显著上调,与阴性对照组[(0.425±0.031)、(0.196±0.028)]比较差异有统计学意义(P=0.002、P=0.000).RT-qPCR和Western blot检测表明,与阴性对照组比较,过表达RUNX3组的Vimentin、Fibronectin、Snail mRNA表达下降34.2％～61.9％、蛋白表达下降31.8％～71.8％;而SACC-83细胞的E-cadherin mRNA和蛋白分别上调2.671、2.237倍,SACC-LM细胞的E-cadherin mRNA和蛋白分别上调3.687、5.454倍.Westem blot检测显示,与阴性对照组比较,过表达RUNX3组的MMP-2和MMP-9表达显著下降(P=0.005、P=0.004).细胞划痕实验显示,过表达RUNX3细胞的迁移率较低.结论 RUNX3可以抑制人腺样囊性癌细胞的EMT,这是其抑制腺样囊性癌细胞侵袭与转移的机制之一.
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肿瘤抑制候选基因3在胃癌中的表达及其生物学功能
本研究探讨肿瘤抑制候选基因3(TUSC3)在胃癌组织中的表达并采用小干扰RNA(siRNA)技术下调胃癌细胞株中TUSC3的表达,探讨其影响胃癌细胞增殖、侵袭和转移的生物学功能.一、资料与方法1.病例资料:手术治疗的胃癌患者44例,术前未接受新辅助放化疗,平均年龄(56.8±18.3)岁,男26例,女18例,Ⅰ/Ⅱ期20例,Ⅲ/Ⅳ期24例,肿瘤位于贲门18例,幽门20例,位于胃体6例,术后证实区域淋巴结转移者30例.
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微小RNA-542-3p在膀胱癌细胞增殖、迁移中的作用研究
微小RNA(miRNA,miR)-542-3p是近年来研究的一个非编码RNA,文献报道其可抑制肠癌细胞的迁移能力[1].本研究旨在探讨其在膀胱癌中的表达及其生物学功能.一、资料与方法1.临床资料:手术治疗的膀胱癌患者36例,术中留取患者癌组织及癌旁组织标本,迅速置入液氮中冷冻,防止RNA降解,然后置入-80℃冰箱保存待检.36例膀胱癌患者中男22例,女14例,平均年龄(56.3±16.5)岁,世界卫生组织(WHO)肿瘤分级G1级15例,G2级12例,G3级9例.国际抗癌联盟(UICC)临床分期标准:Tis/T1期16例,T2～T4期20例.肿瘤初发者28例,复发者8例.
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长链非编码RNA HOTAIR在乳腺癌细胞中的表达及其功能
长链非编码RNA(lncRNA)是近年来发现的一类长度在200 ～ 100 000 nt的RNA分子,该RNA虽然不编码蛋白质,但其通过自身复杂的结构和庞大的种类发挥着包括表观遗传学调控在内的多种生物学调控功能[1].HOTAIR是新近发现的具有较多生物学功能的lncRNA,其参与了多种肿瘤的侵袭转移过程.我们以人乳腺癌组织及人乳腺癌细胞株MDA-MB-231为研究对象,采用小干扰RNA(siRNA)技术下调HOTAIR的表达,探讨HOTAIR在人乳腺癌中的生物学功能.
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可溶性髓样细胞触发受体-1对自发性细菌性腹膜炎的诊断价值
本研究检测自发性细菌性腹膜炎(SBP)患者腹水、血清中可溶性髓样细胞触发受体-1(sTREM-1)的表达情况,并与常用炎症标志物C反应蛋白(CRP)和前降钙素原(PCT)比较,探讨sTREM-1作为SBP诊断的价值.一、资料与方法1.病例选择:我院消化内科收治的肝硬化腹水患者,23例并发SBP的患者做为实验组(SBP组),同期住院的肝硬化腹水未并发SBP的66例患者做为对照组(非SBP组),记录患者的性别、年龄、病因及Child分级等.SBP的诊断标准参照2000年国际腹水俱乐部制定的诊断标准.
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胰腺癌严重联合免疫缺陷小鼠移植瘤模型的建立
动物模型是进行转化医学研究的重要工具.本文拟介绍一种胰腺癌严重联合免疫缺陷(SCID)小鼠移植瘤模型的建立方法.一、材料与方法1.实验动物:采用5～6周龄的雌性SCID小鼠,饲养于无特定病原体(SPF)条件.2.肿瘤组织接种:取得肿瘤组织后,剪成10～15 mm3的小块;将总体积50 mm3的肿瘤组织与30 ～ 50μl的Matrigel(354248,Corning公司)混合;从小鼠一侧腰胁部靠近大腿处戳入肿瘤植入针,在小鼠皮下朝腋窝方向行针,待针头行至离腋窝1 cm处、即小鼠肩胛区,将肿瘤组织推入小鼠皮下.
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常温机械灌注下大鼠骨髓间充质干细胞修复同种心脏死亡器官捐献供脏的研究
本研究旨在观察常温机械灌注联合间充质干细胞(MSCs)对心脏死亡器官捐献(DCD)的肝脏的修复作用.一、材料与方法1.建模与分组:雄性Wistar大鼠(180 ～200 g),建立热缺血45 min模型.分成单纯常温机械灌注(NMP)组、常温机械灌注+ MSCs组(N+B)组、冷保存(CS)组3组,每组取2h和4h.2.检测三磷酸腺苷(ATP)含量:采用ATP含量测定盒,按说明书进行检测.3.统计学方法:应用SPSS 17.0统计软件分析,采用t检验,以P＜0.05为差异有统计学意义.
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靛胭脂在炎症相关性结直肠癌小鼠模型肿瘤计数中的应用
小鼠结直肠癌实验中,由于肿瘤较小,易被漏检,而检出结直肠肿瘤对实验结果意义重大,本研究旨在观察靛胭脂在小鼠结直肠肿瘤计数中的作用.一、材料与方法5～6周龄雄性C57BL/6小鼠15只,以氧化耦氮甲烷联合葡聚糖硫酸钠的方法建立结直肠癌模型[1],处死小鼠后,0.1％靛胭脂染色前后分别计数结直肠肿瘤个数.采用配对样本t检验.
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小干扰RNA下调长链非编码RNA TUG1表达对肠癌细胞LoVo增殖、迁移能力的影响
我们探讨TUG1在多株人肠癌细胞中表达情况及其与肠癌细胞生物学功能的关系.一、材料与方法1.材料:肠癌细胞株HCT116、HCT8、HT29、LS174T、LoVo和SW620购自美国典型菌种保藏中心(ATCC).Lipofectamine 2000购自Invitrogene公司;针对TUG1的小干扰RNA(siRNA)及无关序列由深圳吉玛公司合成;反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)仪购自美国ABI公司;细胞计数试剂盒(CCK-8)购自上海碧云天生物技术公司;Transwell试剂盒购自B&D公司.
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热休克蛋白90α功能性基因序列过表达慢病毒载体的构建和鉴定
我们利用基因工程技术构建热休克蛋白90α(Hsp90α)功能性基因F-5的过表达慢病毒载体,并体外转染以检测其表达的准确性,为下一步研究F-5多肽对组织的重建修复奠定实验基础.一、材料与方法1.材料:(1) GV358载体:元件顺序为Ubi-MCS-3FLAGSV40-EGFP-IRES-puromycin;(2)引物:上游引物(F):5'-GAGGATCCCCGGGTACCGGTCGCCACCATGGAAGAAAAGGAAGACAAAG-3';下游引物(R):5'-TCCTTGTAGTCCATACCATCAAAAGGAGCACGTC-3'.
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右归丸对去卵巢骨质疏松大鼠骨密度、神经肽Y和血管活性肠肽的影响
我们以SD大鼠为研究对象建立绝经后骨质疏松模型,探讨右归丸对大鼠骨密度、神经肽Y和血管活性肠肽的影响.一、材料与方法1.材料:清洁级SD大鼠60只,体重180～ 220 g;X线骨密度仪(Lunar Prodigy)购自美国通用公司;神经肽Y酶试剂盒购自上海纪宁实业有限公司;血管活性肠肽试剂盒购自北京雅安达生物技术有限公司.
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盆腔引流液pH值变化对直肠癌术后吻合口瘘的早期预测价值
目的 探讨监测盆腔引流液pH值的连续变化对直肠癌术后吻合口瘘风险的早期预测价值.方法 753例直肠癌患者分为两组,其中确诊为吻合口瘘组(瘘组,n=57)及未发生吻合口瘘组(无瘘组,n=696),连续监测并比较两组患者术后盆腔引流液的pH值(25℃).结果 瘘组患者的吻合口瘘确诊时间在术后的第6至12天,平均为术后第8天.术后第1天及第2天两组患者盆腔引流液平均pH值差异无统计学意义,而术后第3天瘘组患者引流液平均pH值较无瘘组显著下降(P =0.000),对术后第3天瘘组平均pH值进行诊断试验获得一个截断值,pH=6.978(灵敏度为98.7％,特异度为94.7％)结论 盆腔引流液pH值变化有助于预测直肠癌术后吻合口瘘,早于常规确诊时间.
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沉默信息调节因子7和p53在胃癌组织的表达及临床意义
目的 探讨沉默信息调节因子7(Sirt7)和p53在胃癌组织中的表达及其与胃癌临床病理特征的关系.方法 应用免疫组织化学方法检测60例胃癌组织及癌旁组织中Sirt7和p53的表达,并随机选取20例胃癌及癌旁组织蛋白行Western blot检测,分别检测Sirt7和p53的表达水平.结果 胃癌组织中Sirt7和p53的阳性率(63.33％、66.67％)明显高于癌旁正常组织的阳性率(21.67％、0.00％),差异有统计学意义(P=0.024,P=0.000).Sirt7和p53在胃癌组织中的表达与患者年龄、性别无明显相关(x2=0.057,P=0.811;x2=0.028,P=0.866及x2=0.564,P=0.453;x2 =0.566,P=0.566),而与胃癌肿瘤大小、淋巴结转移、浸润深度、胃癌TNM分期明显相关(,=6.007,P=0.014;x2=7.578,P=0.006;x2=8.403,P=0.004;x2=15.083,P=0.002及x2=6.652,P=0.010;x2=4.431,P=0.035;x2=4.660,P=0.031;x2=9.947,P=0.019).Western blot检测显示20例胃癌患者Sirt7和p53在胃癌组织的表达水平明显高于癌旁组织,差异有统计学意义(P=0.017).配对资料相关性分析显示Sirt7和p53在胃癌组织中表达呈正相关(r=0.324,P=0.008).结论 Sirt7和p53在胃癌组织中高表达,且与胃癌肿瘤大小、淋巴结转移、浸润深度、胃癌TNM分期密切相关,表明Sirt7和p53可能参与胃癌的发病过程.
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程序性死亡分子-1+T细胞免疫球蛋白黏蛋白结构域相关分子-3+细胞在结直肠癌患者外周血及组织CD4+T淋巴细胞中的比例及临床意义
目的 探讨程序性死亡分子-1(PD-1)+T细胞免疫球蛋白黏蛋白结构域相关分子-3(Tim-3)+细胞在结直肠癌(CRC)患者外周血和组织CD4+T淋巴细胞中的比例及其与CRC疾病进展的关系.方法 连续采样的方法,收集2012年1月至2013年1月于我院收治的58例确诊CRC患者的外周血标本(CRC组),并同时收集其中7例Ⅲ期患者的肿瘤组织和癌旁组织标本,密度梯度离心法分离获得单个核细胞,采用流式细胞学方法检测PD-1+ Tim-3+细胞在CD4+T淋巴细胞中的比例.结果 PD-1+ Tim-3+细胞在CRC组外周血CD4+T淋巴细胞中的比例明显高于其在20例对照组外周血中的比例(2.1％比1.2％,P=0.012).PD-1+ Tim-3+细胞在Ⅲ/Ⅳ期CRC患者外周血CD4+T淋巴细胞中的比例明显高于其在Ⅰ/Ⅱ期CRC患者(3.5％比1.9％,P=0.024)及对照组中的比例(3.5％比1.2％,P=0.002).PD-1+Tim-3+细胞在CRC肿瘤组织CD4+T淋巴细胞中的比例明显高于其在癌旁组织(21.58％比5.66％,P=0.002)及外周血(21.58％比2.44％,P=0.001)中的比例.CD4+ PD-1+ Tim-3+T淋巴细胞分泌干扰素-γ(IFN-γ)的能力低于其他各亚群.结论 CRC患者外周血及肿瘤组织CD4+T淋巴细胞中比例升高的PD-1+ Tim-3+细胞亚群与T细胞功能耗竭有关,可能是CD4+T细胞参与肿瘤细胞免疫逃逸,促进CRC病情进展的机制之一.
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紧密连接蛋白Claudin-1在大肠癌及大肠腺瘤组织的表达
目的 检测紧密连接蛋白Claudin-1在正常大肠黏膜、不同病理分型的大肠腺瘤和不同分期的大肠癌组织中的表达,探讨其在大肠癌变过程中不同阶段表达的意义.方法 收集内镜下切除的不同病理分型的大肠腺瘤标本共80例,其中包括管状腺瘤30例、管状绒毛状腺瘤30例、绒毛状腺瘤20例;以及普通外科手术切除的大肠癌组织60例和癌旁组织40例,应用免疫组织化学法检测组织中Claudin-1蛋白的表达.结果 Claudin-1在正常大肠组织、大肠腺瘤和大肠癌组织中的表达阳性率分别为20.0％、46.2％、81.7％,差异有统计学意义(P =0.000).其表达从大肠腺瘤开始显著升高,到大肠癌逐渐增强.并且在大肠癌组织中的表达与Dukes分期、淋巴结转移有关.在大肠管状腺瘤、混合性腺瘤、绒毛状腺瘤中的表达阳性率分别为33.3％、43.3％、70.0％,在绒毛状腺瘤中的表达水平高于管状腺瘤和混合性腺瘤,差异有统计学意义(P =0.036).结论 Claudin-1的表达促进了肿瘤的发生、发展.其表达量的改变提示早期大肠癌的发生,和(或)大肠腺瘤的癌变风险.
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肿瘤转移抑制基因Kiss1在结直肠腺瘤和结直肠癌组织的表达及意义
目的 观察肿瘤转移抑制基因Kiss1在结直肠腺瘤和结直肠癌的表达,探讨其临床意义.方法 采用免疫组织化学及实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)方法检测Kiss1在20例正常结直肠黏膜、30例结直肠癌以及80例结直肠腺瘤组织中的表达.结果 Kiss1在正常结直肠黏膜、结直肠腺瘤及结直肠癌组织中表达水平的差异有统计学意义(P =0.005),阳性表达率分别为93.3％、58.8％、5.0％.在管状腺瘤、混合性腺瘤、绒毛状腺瘤组织中阳性表达率分别为80.0％、66.7％、35.0％,差异有统计学意义(P=0.005).FQ-PCR检测结果显示在正常对照组、管状腺瘤组、混合性腺瘤组、绒毛状腺瘤组及结直肠癌组Kiss1表达量分别为28.85±8.34、14.61±1.65、7.58±1.31、2.26±1.56、0.50±0.40.结论 Kiss1在结直肠腺瘤的恶变及结直肠癌的发生发展过程中起一定作用;Kiss1表达下调可能是结直肠腺瘤的癌变及结直肠癌发生的诱因.
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髓样分化因子88酵母双杂交诱饵质粒构建及鉴定
髓样分化因子88(MyD88)是Toll样受体信号通路中的一个关键接头分子[1].我们构建MyD88蛋白酵母双杂交诱饵质粒,用于筛查与其相互作用的蛋白.一、材料与方法1.分子克隆:通过反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)获得MyD88片段,PCR产物及pGBKT7质粒分别采用Nde Ⅰ和EcoR Ⅰ进行双酶切并纯化后,16℃连接过夜后转化大肠杆菌,进行双酶切和测序鉴定.
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微小RNA-100与微小RNA-143在膀胱癌患者血清的表达及临床意义
目的 探讨联合检测血清微小RNA(miRNA,miR)-100与miR-143水平对膀胱癌的诊断价值.方法 应用实时定量反转录聚合酶链反应(RT-qPCR)检测112例膀胱癌患者和100例健康受试者血清中miR-100与miR-143的水平,并应用受试者工作特征(ROC)曲线计算miR-100与miR-143的临界值,并根据此临界值单独或联合检测血清中miR-100与miR-143水平,观察其诊断膀胱癌的灵敏度与特异度.结果 血清miR-100相对表达水平在NMIBC组(0.213±0.087)和MIBC组(0.175±0.101)分别显著低于对照组(1.086±0.493;x2=7.381,P=0.026;x2=12.322,P=0.011);血清miR-143相对表达水平在NMIBC组(0.193±0.075)和MIBC组(0.011±0.003)分别显著低于对照组(0.992±0.334;x2=9.557,P=0.019;x2=16.926,P=0.008);MIBC组血清miR-143相对表达水平(0.011±0.003)显著低于NMIBC组(0.193±0.075;x2 =4.346,P=0.033).存在淋巴结转移的膀胱癌患者血清中miR-100与miR-143的相对表达水平(0.231±0.027、0.224±0.117)分别显著高于无淋巴结转移的膀胱癌患者(0.144±0.065、0.162±0.044;x2=5.861,P=0.028;x2 =3.793,P=0.031);血清miR-100与miR-143联合检测对诊断膀胱癌的灵敏度与特异度分别为89.73％与88.91％.结论 膀胱癌患者血清中miR-100与miR-143水平显著降低;血清miR-100与miR-143联合检测有助于诊断膀胱癌.
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脑膜瘤磁共振成像与基质金属蛋白酶-9的关系
目的 探讨基质金属蛋白酶-9(MMP-9)与脑膜瘤的浸润、血管生成和瘤周水肿的关系.方法 经临床病理检查证实的60例不同级别脑膜瘤患者,其中Ⅰ级脑膜瘤34例,Ⅱ级脑膜瘤17例,Ⅲ级脑膜瘤9例.采用3.0T磁共振成像(MRI)平扫和增强扫描.利用免疫组织化学法检测不同级别脑膜瘤组织中MMP-9的表达.结果 34例WHO Ⅰ级脑膜瘤中阳性表达率为8.82％,阴性31例,弱表达2例,中性表达1例;17例WHOⅡ级脑膜瘤中阳性表达率为41.00％,阴性10例,弱表达5例,中性表达2例;9例WHOⅢ级脑膜瘤中阳性表达率为100.00％,强表达9例.MMP-9在不同级别脑膜瘤中表达差异有统计学意义(x2 =68.880,P=0.001),Ⅲ级脑膜瘤组表达水平较Ⅱ级显著增高,差异有统计学意义(x2=26.000,P=0.001),Ⅱ级脑膜瘤组表达水平较Ⅰ级显著增高,差异有统计学意义(x2 =7.550,P=0.023).在正常脑膜组织表达低,在Ⅲ级脑膜瘤MMP-9表达水平高,MMP-9蛋白的表达水平随着脑膜瘤级别升高有增加趋势.结论 随着脑膜瘤级别升高,MMP-9表达也相应升高,Ⅲ级脑膜瘤表达MMP-9量高.脑膜瘤通过高表达MMP-9促进瘤周水肿的形成,对肿瘤的增殖和浸润起协同作用.
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肺腺癌预后与中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白、基质金属蛋白酶-9的关系
目的 探讨中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白(NGAL)和基质金属蛋白酶-9(MMP-9)与肺腺癌患者预后的关系,以及NGAL和MMP-9在肺腺癌中的相关性.方法 收治50例肺腺癌患者,免疫组织化学法检测肿瘤组织中NGAL和MMP-9的表达,分析NGAL、MMP-9与临床预后的关系以及NGAL与MMP-9的相关性.结果 与正常对照人群比较,肺腺癌患者肿瘤组织中NGAL平均表达百分比为70％,MMP-9平均表达百分比为30％.单因素分析结果显示NGAL水平、肿瘤分期均与患者总生存期(OS)相关.NGAL表达水平＜70％的患者OS中位数是45.7个月[95％可信区间(CI):15.2～76.2];NGAL表达水平≥70％的患者OS中位数是4.6个月(95％ CI:0.5～18.8;P=0.000).Ⅲ期肿瘤患者OS中位数是15.6个月(95％ CI:9.8～21.2),Ⅳ期肿瘤患者OS中位数是9.6个月(95％ CI:0.8～18.4,P=0.002).NGAL与MMP-9呈低度相关.MMP-9表达水平与OS无明显相关.结论 胰腺癌患者肿瘤组织中NGAL表达≥70％提示预后较差,MMP-9表达水平与预后无明显相关.
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缝隙连接蛋白32在结直肠腺瘤及结直肠癌组织的表达及其临床意义
目的 观察缝隙连接蛋白32(connexin 32)在正常结直肠黏膜、不同病理类型的结直肠腺瘤和结直肠癌组织中表达,探讨其临床意义.方法 利用免疫组织化学方法检测connexin 32在80例结直肠腺瘤、60例结直肠癌以及60例正常结直肠黏膜组织中的表达及定位情况;利用实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)方法检测connexin 32 mRNA的表达情况.结果 connexin 32的表达与淋巴结转移、肿瘤的分化程度、Dukes分期明显相关(P =0.032),而与年龄、性别无明显相关(P=0.061).connexin 32在正常结直肠黏膜组、结直肠腺瘤组及结直肠癌组织中表达水平的差异有统计学意义(P=0.000),阳性表达率分别为66.7％、36.2％、5.0％.在管状腺瘤、混合性腺瘤、绒毛状腺瘤组织中阳性表达率分别为47.5％、35.0％、15.0％,差异有统计学意义(P=0.047);FQ-PCR结果显示connexin 32特异性扩增,connexin 32在正常结直肠黏膜、管状腺瘤、混合性腺瘤、绒毛状腺瘤及结直肠癌组织中表达依次降低(P =0.006).结论 connexin 32与结直肠腺瘤的恶变及结直肠癌的发生相关;connexin 32表达下调提示结直肠腺瘤的癌变及结直肠癌发生.
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假肥大性肌营养不良基因异常表达在儿童股骨头骨骺缺血性坏死的研究
目的 探讨假肥大性肌营养不良(DMD)基因与儿童股骨头骨骺缺血性坏死(Perthes病)致病的关系.方法 利用名为CytoScan HD的基因芯片对18例Perthes病患者血液标本进行全基因组检测,实时定量聚合酶链反应(Real-time PCR)验证Perthes病患者和正常人血液标本中DMD基因含量.结果 所有Perthes病患者中均发现基因序列水平的异常,高频率的拷贝数增加和拷贝数缺失发生在染色体Xp21.1的区域,该区域编码DMD基因,Real-time PCR验证结果显示DMD基因相对表达量在Perthes病患者为0.74±0.10,而在健康组为1.23±0.41 (P =0.038).结论 DMD基因出现在所有Perthes病患者基因拷贝数异常中,DMD基因的低表达可能是Perthes病的一个致病因素.
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聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1在原发性肝癌组织的表达及其与上皮-间充质转化的相关性
目的 探讨聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1(PARP-1)在原发性肝癌组织的表达及其与上皮-间充质转化(EMT)的相关性.方法 选取择期行手术切除的原发性肝癌患者82例,免疫组织化学染色法检测原发性肝癌组织和癌旁组织PARP-1、E-钙黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)和Snail蛋白表达,实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)检测原发性肝癌组织和癌旁组织PARP-1、E-cadherin、Vimentin和Snail mRNA表达,利用Pearson相关分析对变量间相关性进行分析,利用Kaplan-Meier生存分析对原发性肝癌组织中PARP-1蛋白对生存时间的影响.结果 原发性肝癌组织中PARP-1、Vimentin和Snail阳性表达率均高于癌旁组织,而E-cadherin阳性表达率低于癌旁组织,差异均有统计学意义(P=0.000);原发性肝癌组织中PARP-1蛋白表达与病理学分级、TNM分期、镜下癌栓和门静脉癌栓有关(P =0.000);原发性肝癌组织中PARP-1 mRNA、Vimentin mRNA和Snail mRNA相对表达量均高于癌旁组织,而E-cadherin mRNA相对表达量低于癌旁组织,差异均有统计学意义(P=0.000);Pearson相关分析显示,原发性肝癌组织中PARP-1 mRNA相对表达量与E-cadherin mRNA相对表达量呈负相关(r=-0.617,P=0.000),而与Vimentin mRNA和Snail mRNA相对表达量均呈正相关(r =0.483、0.517,P=0.000);Kaplan-Meier生存分析结果显示,PARP-1阳性患者术后中位无瘤生存时间为9.0个月,PARP-1阴性患者术后中位无瘤生存时间为15.2个月,Log-rank检验差异有统计学意义(x2=6.973,P=0.008),PARP-1阳性患者术后中位总生存时间为28.6个月,PARP-1阴性患者术后中位总生存时间为44.0个月,Log-rank检验差异有统计学意义(x2=6.248,P=0.012).结论 PARP-1在原发性肝癌组织中呈高表达,与EMT密切相关.
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长链非编码RNA FEZ家族锌指1反义RNA1在人胃癌组织的表达及临床意义
目的 探讨长链非编码RNA FEZ家族锌指1反义RNA1(FEZF1-AS1)在人胃癌组织中表达及临床意义.方法 收集39例胃癌及其配对正常胃黏膜组织,采用荧光实时定量聚合酶链反应(PCR)方法检测组织中FEZF1-AS1表达水平,分析其表达与患者性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤直径、组织分化程度、肿瘤浸润深度、淋巴结转移、血管浸润、神经浸润、肝转移数目及肝转移发生时间等临床病理因素关系,并作统计学处理.结果 在39例胃癌组织中FEZF1-AS1阳性率为93.08％(36/39),而正常胃组织FEZF1-AS1阳性率为2.56％ (1/39),x2=62.986,P=0.040,差异有统计学意义.FEZF1-AS1表达量与患者性别(x2=1.224,P=0.345)、年龄(x2=2.377,P=0.395)、肿瘤位置(x2=3.029,P=0.405)、组织分化程度(x2=0.883,P=0.557)、神经浸润(x2=0.522,P=0.470)无明显相关相关,但与原发灶直径(x2 =4.672,P=0.031)、肿瘤浸润深度(x2=9.120,P=0.010)、淋巴结转移(x2=8.176,P=0.014)、血管浸润(x2=14.857,P=0.004)、肝转移数目(x2=12.594,P=0.006)、术后肝转移发生时间早晚(x2=7.419,P=0.038)均显著相关.结论 FEZF1-AS1可能是胃癌异时性肝转移重要靶点之一.
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Tip27基因在甲状腺肿瘤组织的表达及临床意义
目的 探讨Tip27基因在甲状腺癌与良性肿瘤组织中的表达差异及其与临床病理特征的相关性.方法 采用实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)和酶联免疫吸附试验(ELISA)法分析96例肿瘤组织及癌旁组织中Tip27基因的mRNA和蛋白表达水平;对肿瘤样本中Tip27基因表达诊断特异性进行受试者工作特征(ROC)曲线分析;对Tip27基因表达与临床病理特征相关程度进行Logistic回归分析等.结果 41例甲状腺癌患者癌组织中24例Tip27基因mRNA表达较癌旁组织低,占58.5％.55例甲状腺良性肿瘤患者肿瘤组织中39例Tip27基因mRNA表达较肿瘤旁组织高,占70.9％,差异有统计学意义(P=0.004);14例甲状腺乳头状癌组织中8例Tip27蛋白表达较癌旁组织低,占57.1％;13例结节性甲状腺肿患者肿瘤组织中11例Tip27蛋白表达较肿瘤旁组织高,占84.6％,差异有统计学意义(P=0.046).41例不同临床分期甲状腺癌患者Tip27基因转录差异明显(P =0.008),优势比(OR)=2.690,为保护性因素.结论 Tip27基因在甲状腺癌组织中的表达下调,在良性肿瘤组织中的表达较癌旁组织增高,且与肿瘤临床分期呈负相关,提示其可能参与了甲状腺癌的发展与转移.
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非受体型蛋白酪氨酸磷酸酶在类风湿性关节炎患者外周血单个核细胞中的表达
目的 探讨非受体型蛋白酪氨酸磷酸酶(PPN)在类风湿性关节炎(RA)患者中的表达及其临床意义.方法 选取本院住院RA患者32例和健康对照29例,抽取外周血,Ficoll密度梯度离心法分离单个核细胞.利用实时定量反转录聚合酶链反应(RT-qPCR)和Western blot法检测蛋白酪氨酸磷酸酶(PTPs) mRNA及蛋白的表达水平.同时检测外周血炎性因子白细胞介素(IL)-1β、IL-6、肿瘤坏死因子(TNF)-α及生化指标红细胞沉降率(ESR)、C反应蛋白(CRP)的水平,并计算病情活动性指标DAS28评分,统计学分析PTPs的表达水平与炎性因子、生化指标、DAS28评分间的关系.结果 与对照组比较,RA患者PTPN1、PTPN2、PTPN3、PTPN4、PTPN7、PTPN9、PTPN13的表达量下降,PTPN11(2.530±0.743,对照组1.000±0.034)和PTPN14(2.269±0.548,对照组1.000±0.057)表达明显上升.PTPN11的表达水平与TNF-α水平[(5.95±1.57) ng/ml,r=0.669,P=0.000]、CRP含量[(28.58±6.72) mg/L,r=0.795,P=0.000]、DAS28评分[(4.20±0.73)分,r=0.703,P=0.000]间具有显著正相关.PTPN14表达水平与TNF-α水平(r=0.633,P=0.000)和CRP含量(r =0.435,P=0.013)明显相关,但与DAS28评分(r=0.033,P=0.856)之间无明显相关.结论 PTPs在RA患者外周血单个核细胞中差异化表达,其中PTPN 11与RA炎性因子、CRP含量和DAS28评分呈正相关.
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下肢动脉粥样硬化闭塞性病变介入治疗的现状及前景
下肢动脉狭窄闭塞性病变是临床常见疾病,由于血管闭塞造成患者肢体缺血,引发跛行、组织坏死、截肢等严重影响生活质量的临床症状,随着介入技术和器材的飞速发展,越来越多的患者可以接受微创治疗开通血管、改善组织血供,缓解临床症状,但由于动脉硬化的进展、组织的增生反应、血管本身的弹性回缩等造成的再狭窄、再闭塞一直是困扰临床的主要问题.目前随着生物可降解材料在心血管介入器材领域的发展以及成功应用,我们似乎看到了下肢动脉病变介入治疗的方向和希望.
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巨噬细胞与胰腺癌相互关系的研究进展
当前,胰腺癌是恶性肿瘤致死率高的类型之一.在2011年,胰腺癌在我国恶性肿瘤病死率中占第7位.随着人口老龄化进程加速,胰腺癌的发病率也会大大提高.遗憾的是,当前针对胰腺癌的治疗,无论是放化疗还是手术切除,5年生存率都仅为6％ ～ 10％.巨噬细胞作为重要的免疫细胞之一,有广泛的生物学功能,如吞噬、抗原提呈及免疫调节等.近来研究结果显示,巨噬细胞参与肿瘤的发生、发展、侵袭及转移等各个环节.因此,有效理解巨噬细胞在胰腺癌中所起到的作用,也许可以提供胰腺癌治疗的新方向.本文将重点阐述巨噬细胞在胰腺癌中的作用以及新的研究进展,希望在此基础上能够找到理想的治疗策略,为胰腺癌患者带来生的希望.
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血管外科基础研究新思维探索
血管外科作为迅速发展的学科之一,其疾病谱随着社会的发展和人口老年化的进程在不断的改变,如主动脉疾病、动脉粥样硬化性疾病、深静脉血栓栓塞性疾病等,逐渐形成了各大血管外科诊治中心的主要病种.本文以主动脉疾病、周围动脉疾病、周围静脉疾病和药物治疗等四个方面,简要介绍近期血管外科基础研究的部分研究热点.
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供体内皮bcl-xL基因转染对大鼠主动脉移植免疫反应的影响
目的 观察供体内皮细胞过表达bcl-xL基因对大鼠主动脉移植受体免疫反应的影响.方法 构建增强型绿色荧光蛋白(EGFP)标记的凋亡抑制基因bcl-xL的Tie2启动子慢病毒表达载体,经尾静脉注射转染供体SD大鼠,后行SD→SD和SD→Wistar大鼠的主动脉同基因及同种异基因移植.移植后1周,荧光显微镜观察及实时定量聚合酶链反应(Real-time PCR)分析移植主动脉内皮bcl-xL过表达;并分离、培养移植动脉内皮细胞、供体及受体大鼠脾细胞、细胞毒性T细胞,收集血清,行混合淋巴细胞反应实验、T细胞杀伤实验及补体依赖的抗体介导的细胞毒实验,明确供体内皮过表达bcl-xL基因对大鼠主动脉移植免疫反应的影响.结果 Tie2启动子慢病毒表达载体转染组移植主动脉内皮显著过表达bcl-xL基因[(8.5±1.1)倍比(1.0±0.2)倍,t=17.050,P =0.002].异基因移植组受体脾细胞增殖率显著高于同基因移植组[(14.2±1.8)倍比(1.0±0.1)倍,t=23.599,P=0.001;(14.7±2.2)倍比(0.8±0.1)倍,t=25.037,P=0.001]、移植动脉内皮细胞存活率显著低于同基因移植组(14.5％比92.7％,x2=244.558,P=0.000;8.9％比95.8％,x2=290.494,P=0.000;15.1％比96.7％,x2 =269.251,P=0.000;10.1％比94.7％,x2=286.190,P=0.000).而转染与非转染bcl-xL的同基因移植组间和异基因移植组间,脾细胞增殖率[(1.0±0.1)倍比(0.8±0.1)倍,t=2.108,P=0.068;(14.2±1.8)倍比(14.7±2.2)倍,t=-1.012,P=0.341]和移植动脉内皮细胞存活率(92.7％比96.7％,x2=3.078,P=0.079;95.8％比94.7％,x2=0.497,P=0.481;14.5％比8.9％,x2=2.917,P =0.088;;15.1％比10.1％,x2=2.286,P =0.131;96.6％比97.3％,x2=0.344,P=0.558;91.5％比92.1％,x2=0.033,P=0.856;19.8％比15.4％,x2 =0.387,P=0.239;10.2％比13.8％,x2=1.515,P=0.218)差异无统计学意义.结论 大鼠供体内皮过表达bcl-xL基因对主动脉移植免疫反应无显著影响.
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微小RNA表达谱在血管钙化动物模型中的差异性表达
目的 通过维生素D3结合尼古丁法构建血管钙化动物模型,观察血管钙化过程中的微小RNA(miRNA,miR)谱变化,并通过生物信息学预测分析miRNA靶基因,采用Affemitrix miRNA芯片检测血管钙化模型组和对照组主动脉组织中miRNA表达谱变化(设2倍改变为阈值),筛选差异表达的miRNAs.方法 7周龄雄性SD大鼠30只,随机分为两组,每组15只,采用维生素D3(300 kIU/kg)肌肉注射和尼古丁(5 mg/kg)灌胃建立大鼠血管钙化动物模型.对照组给予等体积的生理盐水处理.诱导4周后处死大鼠并分离主动脉组织.提取组织RNA,纯化获得miRNAs,采用Affemitrix miRNA芯片检测血管钙化模型组和对照组主动脉组织中miRNA表达谱变化(设2倍改变为阈值),筛选差异表达的miRNAs.结果 诱导第20天模型组大鼠血钙水平显著升高(P=0.000).碱性磷酸酶(ALP)的检测结果显示,与对照组比较,模型组大鼠ALP活性明显升高,第20天时,模型组大鼠ALP活性增高了85.7％.miRNA芯片结果表明在模型组中,mmu-miR-297a的表达量明显下调.结论 成功构建血管钙化动物模型,通过筛选差异表达的miRNAs,可见mmu-miR-297a在血管钙化模型中表达下调.
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糖尿病对腹主动脉瘤组织蛋白酶S表达的影响
目的 观察糖尿病(DM)对小鼠腹主动脉瘤(AAA)组织中组织蛋白酶S(Cathepsin S)及其抑制剂胱抑素C(Cystatin C)表达的影响.方法 将16只载脂蛋白E基因缺陷(ApoE-/-)的C57BL/6小鼠随机分为DM +AAA组(n=8)与AAA组(n=8)并构建相应的疾病模型.通过超声观察两组小鼠大腹主动脉直径的变化,通过酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测两组小鼠血浆Cystatin C水平,通过实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)、Western blot、免疫组织化学等方法观察两组小鼠AAA病变中Cystatin C及Cathepsin S的表达,通过Weigert弹力纤维染色法观察两组小鼠AAA中弹力纤维的破坏程度.结果 与AAA组小鼠比较,DM +AAA组小鼠大腹主动脉直径较小[(1.13±0.14) mm比(1.35 ±0.26) mm],血浆Cystatin C水平较高[(1 347.19±340.12) pg/ml比(1 060.17 ±153.55) pg/ml]、AAA病变中Cystatin C表达增加而Cathepsin S表达降低、弹力纤维破坏程度分级降低(2.00±0.76比2.88±0.64).结论 糖尿病增加Cystatin C在血浆及AAA组织中的含量,并抑制Cathepsin S在AAA组织中的表达,从而降低腹主动脉壁弹力纤维的破坏程度,在AAA的发生和进展中发挥保护作用.
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Kv1.5蛋白与脂多糖诱导的血管内皮细胞损伤的相关性
目的 探讨Kv1.5蛋白与脂多糖(LPS)诱导的血管内皮细胞损伤的相关性.方法 LPS以浓度梯度(0.5、1.0、5.0、10.0 μg/ml)及时间梯度(0、6、12、24、48 h)作用于人脐静脉内皮细胞(HUVECs),应用流式细胞仪检测细胞凋亡率,建立内皮细胞损伤模型,并通过Western blot法检测内皮细胞中Kv1.5蛋白水平;分别予以75、125、250、500 mmol/L浓度的Kv1.5特异性通道阻滞剂(MT)预处理30 min阻断Kv1.5通道后,运用流式细胞术检测内皮细胞凋亡率,酶联免疫吸附试验(ELISA)法测定内皮细胞损伤标志物内皮细胞特异性分子-1(endocan)、血管细胞间黏附分子-1(VCAM-1)的浓度.结果 LPS浓度为0.5、1.0、5.0、10.0 μg/ml刺激HUVECs 24 h,内皮细胞凋亡率分别为(33.530±1.266)％、(35.530±0.551)％、(48.270±0.901)％、(51.600±2.179)％,与对照组比较差异有统计学意义(P值分别为0.025、0.027、0.011、0.004),且在LPS 5.0μg/ml时作用显著;LPS(5.0 μg/ml)处理内皮细胞6、12、24、48 h,内皮细胞凋亡率分别为(30.200±1.113)％、(32.470±0.814)％、(46.630±0.513)％、(50.870±1.498)％,与对照组比较差异有统计学意义(P值分别为0.027、0.025、0.012、0.006),并且在24h时作用明显;建立内皮细胞损伤模型适宜的条件为5.0μg/ml LPS刺激HUVECs 24 h;同时可见不同浓度LPS组Kv1.5蛋白表达明显上调(P值分别为0.036、0.027、0.008、0.005),12、24、48 h时LPS组Kv1.5蛋白表达亦上升(P值分别为0.004、0.036、0.007),Kv1.5蛋白表达与LPS呈一定的浓度及时间依赖性.与LPS组比较,不同浓度梯度MT组(75、125、250、500 mmol/L)内皮细胞凋亡率明显降低(P值均为0.000),且细胞损伤标志物endocan(P值分别为0.001、0.000、0.001、0.006)及VCAM-1分泌减少(P值分别为0.006、0.000、0.000、0.000).结论 内毒素诱导损伤的血管内皮细胞表达Kv1.5蛋白增多;阻断Kv1.5通道能减轻内毒素诱导的血管内皮细胞损伤.
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血管腔内平整化治疗对动脉内膜剥脱术后血栓形成的影响及可能机制
目的 探讨血管腔内平整化治疗(IPT)对内膜剥脱术后血栓形成及内膜增生的作用及其机制.方法 用金钢砂磨针磨除内膜的方法建立颈动脉内膜剥脱模型.将新西兰兔采用随机数字表法分成两组(Ⅰ组、Ⅱ组),每组12只.Ⅰ组:颈动脉内膜剥脱模型对照组;Ⅱ组:用金刚砂磨针磨除内膜后,行IPT;取对侧颈动脉作为自身对照.术后即刻及2周应用超声诊断仪评价血管狭窄程度.两组分别于术前、术后3h、术后24h测定出血时间.术后24h,分别从两组随机抽取4只兔,取术侧颈动脉标本用扫描电镜评价血小板黏附情况.剩余兔2周后,取两侧颈动脉标本行苏木素-伊红(HE)染色、Masson染色,评价血栓形成.结果 术后3h、术后24h,两组出血时间比较差异无统计学意义[3h:(5.750±0.261)比(5.792±0.334) min;24 h:(5.541 ±0.498)比(5.625±0.433) min,P=0.870;P =0.666].术后24h,与对照组比较,实验组黏附于内膜剥脱部位表面的血小板数量减少了67％ [(149.000±9.557)个比(49.500±7.234)个],差异有统计学意义(P=0.000).Ⅰ组血栓形成率为75.0％,Ⅱ组血栓形成率为12.5％,两组间比较差异有统计学意义(P =0.040).结论 (1) IPT能够减少动脉内膜剥脱术后血小板黏附,进一步减少血栓形成.(2)IPT局部干扰血小板黏附、活化,不增加全身的出血风险.
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改良大鼠颈动脉移植血管病变模型中平滑肌细胞表型的变化
目的 观察改良的近交系大鼠颈动脉移植血管病变模型并研究病程中平滑肌细胞表型的变化.方法 以Wistar大鼠作为供体,分别以Wistar大鼠和Brown Norway大鼠作为受体,进行颈动脉移植.术后1、4、8、16周行高频超声检查新生内膜形成情况.采用苏木素-伊红(HE)染色、Masson染色、免疫组织化学α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、细胞核增殖抗原(Ki-67)染色,免疫荧光α-SMA、Ki-67双标染色及激光共聚焦成像,评价新生内膜的细胞成分、来源和状态.结果 高频超声探测到新生内膜随时间的推移而增厚.异系移植16周时狭窄率为41.95％.同系组16周时仅出现少量新生内膜,狭窄率为11.55％.HE染色显示新生内膜主要为梭型的平滑肌细胞,Masson染色显示新生内膜呈蓝色.免疫组织化学和免疫荧光染色均显示内膜和中膜之间出现α-SMA阳性细胞.定量分析显示移植16周后异系组中膜α-SMA阳性细胞较同系组明显减少(积分吸光度值为144.5比1 789.1,n=4,P=0.000),Ki-67阳性细胞明显增多(积分吸光度值为1 516.5比82.3,n=4,P =0.000).新生内膜为大量α-SMA阳性细胞,较多Ki-67阳性细胞,激光共聚焦成像含双阳性细胞.结论 大鼠颈动脉移植能很好地研究移植物血管病变的病理过程.中膜平滑肌去分化转变为合成型,向内膜迁移形成新生内膜.
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小干扰RNA沉默表皮生长因子受体对血管平滑肌细胞增殖和迁移的影响
目的 探讨小干扰RNA (siRNA)沉默表皮生长因子受体(EGFR)对血管平滑肌细胞(VSMC)增殖和迁移的影响及其机制.方法 分离、培养大鼠VSMC,取对数生长期细胞,利用慢病毒载体感染VSMC,将细胞分为siRNA-EGFR组、siRNA-阴性对照组和空白对照组,5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-BrdU)法检测各转染组细胞增殖能力,Transwell小室和划痕实验检测各转染组细胞迁移能力,实时定量聚合酶链反应(Real-time PCR)检测各转染组细胞中EGFR、细胞外信号调节激酶(ERK)、c-jun氨基末端激酶(JNK)、p38丝裂原活化蛋白激酶(p38)基因表达,Western blot法检测各转染组细胞中EGFR、磷酸化ERK(p-ERK)、磷酸化JNK(p-JNK)和磷酸化p38(p-p38)蛋白表达.结果 siRNA-EGFR组VSMC迁移细胞数[(48.5±6.1)个],均显著低于siRNA-阴性对照组和空白对照组,分别为(86.2±7.2)个和(88.3±7.6)个,差异均有统计学意义(F=37.261,P=0.000),与0h比较,24 h后,siRNA-EGFR组VSMC迁移率为(35.7±3.8)％,显著低于siRNA-阴性对照组和空白对照组,分别为(74.2±5.7)％和(75.5±6.1)％,差异均有统计学意义(F=40.315,P=0.000);siRNA-EGFR组细胞中ERK、JNK和p38 mRNA相对表达量(0.53±0.09、0.47±0.11、0.41±0.07)均低于siRNA-阴性对照组(0.82±0.12、0.64±0.10、0.68±0.09)和空白对照组(0.85±0.14、0.66±0.13、0.70±0.12),差异均有统计学意义(F=15.391、12.817、11.264,P=0.000、0.000、0.000);siRNA-EGFR组细胞中p-ERK、p-JNK和p-p38蛋白相对表达量(0.46±0.09、0.38±0.06、0.33±0.06)均低于siRNA-阴性对照组(0.71±0.12、0.57±0.08、0.52±0.07)和空白对照组(0.73±0.13、0.56±0.07、0.54±0.09),差异均有统计学意义(F=20.152、14.375、13.843,P=0.000、0.000、0.000).结论 特异性抑制EGFR可有效减少VSMC增殖和迁移能力,其机制可能与抑制丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路有关.
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慢病毒介导Yes相关蛋白基因过表达促小鼠诱导性多能干细胞来源的内皮细胞增殖
目的 探讨慢病毒介导Yes相关蛋白(YAP)过表达促小鼠诱导性多能干细胞来源的内皮细胞(miPSC-EC)增殖的机制.方法 诱导小鼠诱导性多能干细胞(miPSC)为内皮细胞(EC),慢病毒介导质粒pPGK-2Flag-YAP转染miPSC-EC,嘌呤霉素筛选出稳定转染细胞株miPSC-EC/YAP.Western blot验证YAP是否成功转染miPSC-EC,并检测转染YAP后miPSC-EC内人第10号染色体上缺失与张力蛋白同源的磷酸酯酶基因(PTEN)、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)等蛋白的表达,同时应用噻唑蓝(MTF)比色法检测YAP对miPSC-EC增殖的影响.结果 miPSC诱导分化所得细胞形态符合EC特征,几乎都表达EC标志血小板内皮细胞黏附分子(CD31).Western blot结果显示,转染YAP的miPSC-EC中YAP高表达(未转染细胞YAP几乎不表达),miPSC-EC/YAP组较未转染组PTEN相对表达量明显降低(0.635±0.017比0.879±0.034,P=0.023),p-Akt/相对表达量显著升高(0.450±0.025比0.073 ±0.018,P=0.007).同步化之后24、48、72 h,miPSC-EC/YAP组吸光度(A)值较未转染组显著增加(0.113 ±0.004比0.077±0.004,P=0.000;0.368±0.010比0.199±0.006,P=0.000;0.716 ±0.004比0.418±0.018,P=0.000).结论 成功诱导miPSC为EC,建立过表达YAP的细胞株miPSC-EC/YAP.过表达YAP抑制PTEN的表达,提高Akt磷酸化.YAP可能通过参与磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信号通路促进miPSC-EC的增殖.
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骨膜素在主动脉瓣退行性变中的表达及其意义
目的 检验骨膜素在退行性变主动脉瓣中的表达以及其病理作用.方法 连续收集接受瓣膜置换术患者的退行性主动脉瓣标本24例(男13例,女11例),取同期Bentall手术切除的正常主动脉瓣膜标本5例作为对照.组织切片常规苏木素-伊红(HE)染色观察瓣膜结构.采用免疫组织化学分析方法对瓣膜中骨膜素及血管内皮生长因子(VEGF)的表达进行比较分析.同时对冰冻标本进行Western blot检测,进一步验证相应分子表达水平组间差异.结果 退行性主动脉瓣出现结构破坏、微血管增生、钙化等表现.与正常瓣膜比较,骨膜素在退行性主动瓣膜中表达增高(0.009±0.006比0.041±0.024,P=0.001),集中表达钙化坏死区域、血管形成区域.VEGF在病变瓣膜中表达增高(0.007±0.011比0.021±0.005,P=0.002),两者呈线性相关(r=0.458,P=0.012).结论 骨膜素参与瓣膜细胞外基质增生,组织重构及新生血管形成,促进了主动脉瓣退行性变.
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携人血栓调节蛋白基因内皮祖细胞预防动脉成形术后再狭窄
目的 探讨携人血栓调节蛋白(hTM)基因的内皮祖细胞(EPCs)局部移植预防动脉成形术后再狭窄的可行性.方法 利用密度梯度离心法分离兔外周血EPCs;慢病毒载体plenti6.3-hTM-IRES-增强型绿色荧光蛋白(EGFP)感染EPCs,并以Fe2 O3磁性纳米颗粒标记;双腔Fogarty球囊制作兔右侧颈总动脉损伤模型共36只,随机平均分为3组,每组分别移植hTM-EPCs、单纯EPCs及等量生理盐水至损伤血管段;术后1周每组随机选取4只兔取损伤血管段行Western blot检测及普鲁士蓝染色,观察血管损伤处有无外源性EPCs定植;术后4、8周行磁共振(MR)扫描,评估血管腔狭窄程度;术后8周行苏木素-伊红(HE)、弹力纤维及增殖细胞核抗原(PCNA)染色,观察损伤段血管壁结构、平滑肌及内膜增生程度.结果 普鲁士蓝染色结果显示含铁EPCs附着于损伤处血管内膜;Western blot检测结果示hTM-EPCs组损伤血管段高表达hTM;MR结果显示hTM-EPCs组损伤血管段管腔狭窄程度低于单纯EPCs组及对照组;HE、弹力纤维及PCNA染色结果显示:术后8周,hTM-EPCs组、单纯EPCs组及对照组内膜/中膜比(N/M)分别为0.348 ±0.040、0.704 ±0.060和1.294±0.051,组间差异有统计学意义(P =0.000);管腔狭窄率分别为(11.4±2.3)％、(24.3±4.8)％、(35.2±9.4)％(P =0.005);PCNA阳性细胞指数分别为(12.3±3.9)％、(23.4±4.2)％、(49.3±6.8)％(P=0.000).结论 双腔Fogarty球囊阻断局部血流后,定向移植携hTM基因的EPCs可有效抑制血管成形术后再狭窄.
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兔移植静脉重塑过程中凋亡及增殖的时间特性
目的 观察移植静脉重塑过程中凋亡水平及增殖的时间特性.方法 将42只健康纯种新西兰大耳白兔分为7组,建立兔颈外静脉颈总动脉旁路移植术模型,分别于术前、术后第1、3、7、14、28及90天将移植静脉取出,并对其进行狭窄程度、增殖细胞核抗原(PCNA)蛋白水平、凋亡及透射电镜等相关检测.结果 (1)内膜厚度:正常对照组为(4.6±0.8)μm,术后1d组为(1.5±0.3) μm,较正常对照组显著降低,差异有统计学意义(t=8.778,P=0.000),术后3d组为(4.6±0.7) μm,与正常对照组比较差异无统计学意义(t=0.027,P=0.979),术后7d组为(19.0±2.8) μm(t=-12.114,P=0.000),术后14 d组为(36.2±5.8)μm(t=-13.229,P=0.000),术后28 d组为(67.2 ±4.6)μm(t=-32.842,P=0.000),术后90 d组为(95.0±6.8) μm(t=-32.322,P =0.000),均高于正常静脉组,差异有统计学意义;中膜+外膜厚度:正常静脉组为(6.6±0.8)μm,术后1d组为(8.8±1.2)μm(t=-3.737,P=0.005),术后3d组为(16.2±2.1) μm(t=-10.471,P =0.000),术后7d组为(46.2±6.1)μm(t=-15.755,P=0.000),术后14 d组为(64.0±6.1) μm(t=-22.871,P=0.000),术后28 d组为(126.1 ±6.4)μm(t=-45.409,P=0.000),术后90 d组为(132.4±11.0) μm(t=-27.951,P=0.000),均高于正常对照组,差异有统计学意义;(2)Western blot:PCNA相对表达量在正常对照组为(42.2±2.6)％,术后1d组为(33.4±3.7)％,低于正常对照组,差异有统计学意义(t =4.770,P=0.000),术后3d组为(46.3±3.8)％,高于正常对照组,差异有统计学意义(t =8.778,P=0.000),术后7d组达峰值为(79.7±8.3)％,显著高于正常对照组、术后1d组、术后3d组,差异有统计学意义(t=-10.564,P=0.000),之后缓慢下降,至术后第14天组为(72.8±3.1)％(t=-18.537,P=0.000),术后28 d组为(60.6±5.4)％(t=-7.527,P =0.000),术后90 d组为(48.0±3.8)％(t=-3.083,P=0.013),均高于正常对照组,差异有统计学意义;(3)免疫组织化学检测:PCNA阳性细胞百分比在正常对照组为(6.25±0.90)％,术后1d组为(4.96 ±0.70)％,较正常对照组略有下降,差异有统计学意义(t=2.755,P=0.021),术后3d组为(11.57±1.50)％(t=-7.458,P=0.000),术后7d组为(32.70 ±3.10)％(t=-20.101,P=0.000),与对照组比较差异均有统计学意义;自术后14d组始出现下降趋势;(4)原位缺口末端标记法(TUNEL):凋亡水平在正常对照组为(1.36±0.20)％,术后1d组细胞凋亡量骤增为(18.61±1.50)％(t=-27.873,P=0.000),与正常对照组比较差异有统计学意义;术后第3天组细胞凋亡水平下降为(7.16±0.50)％(t=-26.251,P=0.000),术后第7天组细胞凋亡水平为(1.98±0.40)％(t=-3.402,P=0.011),随后凋亡维持在较低水平,术后第14天组、术后第28天组及术后第90天组细胞凋亡水平分别为(4.37±0.70)％(t=-10.122,P=0.000)、(6.18±0.90)％(t=-12.839,P=0.000)以及(6.56±1.20)％(t=-10.497,P=0.000),上述各组与正常对照组比较,差异均有统计学意义.结论 静脉移植术后1d至术后3d,凋亡水平较高;术后7d增殖水平较高.
| 年 | 期数 |
| 2019 | 01 02 |
| 2018 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2017 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2016 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2015 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2014 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2013 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2012 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2011 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 |
| 2010 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
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