中华实验外科杂志
Chinese Journal of Experimental Surgery 중화실험외과잡지
- 主管单位： 中国科学技术协会
- 主办单位： 中华医学会
- 影响因子： 0.75
- 审稿时间： 1-3个月
- 国际刊号： 1001-9030
- 国内刊号： 42-1213/R
- 论文标题 期刊级别 审稿状态
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携带前强啡肽基因的Ad5 F35重组腺病毒制备及鉴定
目的 用Ad5F35载体制备携带前强啡肽基因的重组腺病毒Ad5F35-PDP并对其进行鉴定.方法 利用NheI和Agel分别对合成的目的 基因prodynorphin聚合酶链反应(PCR)产物和pDC316-LacZ-a载体质粒进行双酶切.将PDP目的 基因片段和线性化的pDC316连接,克隆构建pDC316-PDP.pDC316-PDP与腺病毒骨架pBHG-fiber5/35共转染293细胞制备Ad5F35-PDP重组腺病毒,收获并纯化病毒,检测重组病毒滴度,运用PCR进行鉴定.结果 编码PDP的基因序列经测序鉴定证实与Gene Bank中的一致,pDC316-PDP构建成功.pDC316-PDP与腺病毒骨架共转染293细胞后见明显的毒斑,说明两者在293细胞中同源重组并包装成功.经PCR证实Ad5F35-PDP重组腺病毒构建完成.病毒滴度为1×1012v.P./ml.结论 本实验成功制备了含PDP全序列的高滴度、高纯度的Ad5F35-PDP重组腺病毒,为下一步进行该重组病毒生物安全性能和生物学功能研究及今后应用Ad5F35-PDP重组腺病毒对吗啡成瘾患者进行基因治疗奠定了基础.
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SLC35 F2抗体制备与非小细胞肺癌组织中SLC35 F2蛋白表达检测
目的 制备SLC35F2多肽抗体,鉴定其性能,检测其对应蛋白在非小细胞肺癌(NSCLC)组织中的表达.方法 通过蛋白质序列分析,选4段氨基酸序列合成多肽,混合免疫家兔,制备抗SLC35F2多肽抗体,经纯化、效价检测、特异性鉴定后,将抗体用于NSCLC标本免疫组织化学染色.结果 获得兔抗人SLC35F2多肽抗体,效价1:10<"5,Western blot可特异识别41 KD的SLC35F2蛋白,免疫组织化学示细胞胞质特异性染色.129例NSCLC的组织微阵列免疫组织化学染色显示,SLC35F2蛋白表达在90.7%(117/129)肺癌标本为++到+++;而仅在17.1%(22/129)癌旁正常肺组织为++,其余为-或+;SLC35F2蛋白表达在NSCLC组织中高于癌旁正常肺组织(P<0.01);NSCLC病理分期与SLC35F2的升高表达存在低度相关(r=0.175).结论 用多肽免疫家兔制备抗SLC35F2抗体具有较高的效价和特异性,SLC35F2在NSCLC中表达高于癌旁正常组织.
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肾细胞癌中Livin的表达及其意义
目的 探讨凋亡抑制蛋白Livin的表达及与肾细胞癌发生、发展的关系.方法 应用免疫组织化学及逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测38例肾细胞癌和10例正常肾组织中Livin的表达.结果 免疫组织化学及RT-PCR法检测38例肾细胞癌中Livin的阳性率分别为57.89%(22/38)、60.53%(23/38);而10例正常肾组织中Livin均无表达,肾癌组和对照组差异有统计学意义(P<0.01).Livin表达率与肾细胞癌的病理类型、临床分期、病理分级、肿瘤大小无明显相关性(P>0.05).结论 Livin在肾癌的发生、发展中起重要作用,可能成为肾细胞癌的重要诊断指标和治疗靶点.
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硫酸镁对弥漫性脑损伤脑组织的保护作用及机制
目的 探讨硫酸镁对于弥漫性脑损伤脑组织可能的保护机制.方法 依据Marmarou's弥漫性脑损伤动物模型有改进,采用成年健康SD雄性大鼠,体质量325～375 g,共50只.其中,外伤组25只,干预组25只(两组外伤后12、24、48、72 h,1周,每组各5只).干预组应用微泵给予硫酸镁静脉注射治疗,外伤后大鼠自由进食水,按时间段处死大鼠,提取大鼠皮层脑组织,应用实时逆转录.聚合酶链反应(realtime RT-PCR)检测外伤组与干预组不同时间段ET-1 mRNA、iNOS mRNA表达,另取脑组织应用脑组织干湿重比表示脑组织含水量.结果 ET-1 mRNA表达干预组较外伤组干预组降低,应用成组t检验分析方法检验可得:6、12、24、48 h组组间差异有统计学意义(P<0.01),72 h,1周组间比较差异无统计学意(P>0.05).iNOS mRNA表达干预组较外伤组降低,干预组与外伤组相应时间组组间差异有统计学意义(P<0.01).结论 应用微泵静脉注射硫酸镁早期减少了ET-1 mRNA、iNOS mRNA的表达,从而使ET-1、iNOS、NO合成减少,减轻了脑组织缺血缺氧及对脑细胞的毒性,从而使干预组弥漫性脑损伤大鼠脑组织含水量较单纯外伤组弥漫性脑损伤大鼠脑组织含水量减少的原因.
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腺病毒介导的野生型p53基因逆转乳腺癌耐药细胞株MCF-7/A耐药性的研究
目的 探讨野生型p53基因对乳腺癌耐药细胞株MCF-7/A耐药性的逆转作用及其机制.方法 选用含野生型p53基因的重组腺病毒载体,转染乳腺癌耐药细胞株MCF-7/A,绘制细胞生长曲线,利用流式细胞计数仪检测细胞周期分布及凋亡分析、TUNEL法检测细胞凋亡的发生,并采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot印迹转移检测p53基因的表达情况.结果 野生型p53基因转染MCF-7/A后的24、48 h均检测到p53基因的表达,并显著抑制MCF-7/A细胞的增殖;细胞周期发生改变,转染后的MCF-7/A的G0%G1期DNA百分含量(76.22%)明显高于对照组(43.64%,P<0.05),凋亡率(10.76%)与对照组(1.48%)之间差异有统计学意义(P<0.05).结论 重组腺病毒介导的野生型p53基因对乳腺癌耐药细胞株MCF-7/A的耐药性有明显的逆转作用,其机制可能是引起明显的G1期阻滞并诱导细胞凋亡.
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COX-2启动子在胰腺癌细胞中活性的检测
目的 通过基因转染检测COX-2启动子在胰腺癌细胞中的活性.方法 利用已构建的包含COX-2启动子和报告基因SSTR2的E1剔出重组腺病毒AdCOX-2-SSTR2转染胰腺癌细胞BxPC-3,包含CAG启动子的AdCAG-SSTR2作为阳性对照.逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western印迹法分析检测SSTR2在细胞中的表达.Real Time PCR检测bax、VEGF的表达.结果 AdCAG-SSTR2转染胰腺癌细胞后检测到SSTR2 mRNA的表达,是内参β-actin的24%,在55KDa处检测到SSTR2蛋白条带,bax的表达量明显升高,VEGF的表达量明显下降,分别是对照组的3.18倍和0.23倍;AdCOX-2-SSTR2转染胰腺癌细胞则未检测到SSTR2mRNA和蛋白明显的表达,bax、VEGF的表达也无明显变化,分别是对照组的1.23倍、1.12倍.结论 在胰腺癌细胞株BxPC-3中COX-2启动子驱动SSTR2表达未显示出肿瘤特异性启动子的优势.
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椎体终板损伤对兔椎问盘髓核Ⅰ、Ⅱ型胶原的影响
目的 观察椎体终板损伤对兔椎间盘髓核Ⅰ、Ⅱ型胶原的影响并探讨其机制.方法 4个月龄清洁级日本大白兔12只,完整取出40个包含终板的完整椎间盘(L2-L5),随机分为实验组和对照组,每组20个.实验组参考Daniel Haschtmann的方法建立终板损伤模型.椎间盘整体培养2周后,免疫组织化学方法观察椎间盘髓核中Ⅰ、Ⅱ型胶原的表达情况,并用HMIAS-2000图像分析系统进行半定量分析.结果 免疫组织化学染色显示:实验组椎间盘髓核Ⅰ型胶原的表达比对照组高;而Ⅱ型胶原的表达则比对照组低,差异均有统计学意义(P<0.05).结论 外伤致椎体终板损伤后会导致椎间盘髓核Ⅰ、Ⅱ型胶原的变化,继而加速椎间盘退行性变.
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Rho激酶在体外神经元缺氧及再灌注损伤中的作用
目的 观察Rho激酶(ROK)及下游底物肌球蛋白轻链(MLC)在体外培养的神经元缺血及再灌注过程中的变化,探讨ROK在神经元受损后轴突萎缩中的作用和机制.方法 培养N2a细胞并分为对照组、缺氧组、再灌注组、Y-27632干预缺氧组和Y-27632干预再灌注组共5组,Western blot检测ROCKⅠ和ROCKⅡ蛋白的表达以及ROK下游MLC的磷酸化水平;噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞活力;FTTC标记的鬼笔毒环肽(phalloidin)染色神经元纤维状肌动蛋白(F-actin)骨架,免疫荧光观察轴突细胞骨架重组变化.结果 N2a细胞缺氧和再灌注损伤过程中ROCKⅡ的表达分别升高了29.7%和57.4%,而磷酸化MLC(p-MLC)的表达分别升高了21.5%和49.3%,免疫荧光镜下观察正常N2a细胞轴突、树突形态清晰,纤维状肌动蛋白丝主要分布于细胞周边,应力纤维少,而经历缺氧和再灌注损伤的N2a细胞胞浆内应力纤维增多,周边肌动蛋白丝带模糊,同时轴突回缩,MTT提示细胞增殖率低于阴性对照,分别下降了22.7%和45.6%;加入浓度为30 mol/L的Rho激酶抑制剂Y-27632的N2a则无此反应,且在再灌注过程中干预可使轴突已回缩的N2a重新出现丝状伪足,MTT提示加入Y-27632能显著提高N2a细胞缺氧及再灌注损伤24 h后的存活率(P<0.05).结论 神经元在经历缺氧及再灌注过程中ROCKⅡ激活并导致轴突内MLC过度磷酸化,这可能是致使轴突内肌动蛋白细胞骨架重组而终导致生长锥的塌陷和神经突起的回缩的主要机制;对ROK进行抑制则可以预防或逆转这一过程.
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高原低氧应激对肾脏的影响
目的 观察高原不同海拔地区低氧应激对人和兔肾脏的影响.方法 将平原兔12只随机分为4组,每组3只.A组为对照组,B、C、D组为平原兔在48 h内直接迁饲到海拔4320 m后1、7、30 d组.E组为饲养在海拔2260 m地区的高原兔(高原对照组),F组为海拔2260 m高原兔24 h内迁饲到4320 m后1 d.各组宰杀后行肾脏组织病理学观察.将进入高原2730 m不同时间(G组<6 m,250人,H组2 Y,110人)的健康青年共350人行尿生化及尿微量蛋白检测,设平原健康青年100人为对照组(Ⅰ组).结果 从平原急进4320 m地区后兔肾脏的改变为肾小球毛细血管内皮细胞肿胀、变性、结构不清,间质内毛细血管明显充血,肾小管上皮细胞水样变性.G组和H组尿生化总阳性率28.9%,对照Ⅰ组7%(P<0.01),且G组32.8%～(82/250)高于H组25.0%(25/100,P<0.01),α1微球蛋白G组(48.89±27.23)mg/L,H组(10.14±0.59)mg/L,均高于参考值5.86±4.50(P<0.01).结论 从平原急进入高原地区可致肾小球和肾小管同时受损,表现为尿生化和尿微球蛋白检测阳性.当大气氧分压突然较大幅度降低时,不同大气压环境下生存的动物均可引起肾小球和肾小管应激性损害,其组织病理学改变基本相同.
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神经营养因子-3修饰的神经干细胞移植大鼠受损脊髓后的存活及分化
目的 观察增强型绿色荧光蛋白(EGFP)标记的神经营养因子(NT)-3修饰的胚胎脊髓来源的神经干细胞(NSCs)移植入受损脊髓后的存活及分化.方法 将体外构建的EGFP标记NT-3修饰的NSCs(NT-3-NSCs)移植入SD在胸9水平脊髓半切的大鼠(10只),通过免疫组织化学方法检测移植细胞的存活、分化及NT-3的表达,并与未进行NT-3修饰的NSCs移植组(NSCs)(10只)进行比较.结果 NT-3-NSCs组移植细胞存活数(304±40)比NSCs组(258±41)更多(P>0.05).NT-3-NSCs组中NT-3阳性细胞的比例(74.2±14.1)%明显高于NSCs组(22.9±11.1)%(P<0.01);NT-3-NSCs组中少突胶质细胞分化率(53.8±12.4)%明显高于NSCs组(39.7±13.7)%(P<0.05).结论 NT-3修饰能促进NSCs在受损脊髓内存活、表达NT-3及分化为少突胶质细胞,有助于NSCs移植对脊髓损伤(SCI)的治疗效果.
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纳米级全氟丙烷脂质超声微泡造影剂的制备
目的 研制一种新型的直径在纳米级的全氟丙烷脂质超声微泡造影剂,检测其物理特征,探讨并验证其佳制备条件.方法 以混合的半合成磷脂和全氟丙烷作基本原料,司盘60和吐温80为膜稳定剂,以高剪切分散法制备纳米级超声微泡造影剂.荧光显微镜观察形态分布特点,激光粒度分析仪检测其粒径分布.经均匀设计法及多元回归分析探索各制备条件对超声微泡粒径的影响.结果 经多元回归分析得出高剪切速度和高剪切时间对超声微泡粒径有显著性影响,优制备条件为:高剪切速度为6档;高剪切时间为8 min;DPPC浓度20 mg/50 ml;T80/S60比值为1,该条件下制备的超声微泡分散均匀、浓度较高,平均粒径为(335±5)nnl.结论 优条件高剪切分散法制备的超声微泡造影剂粒径分布在208%416 mn之间,是一种达到纳米级的新型超声微泡造影剂.
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血管内皮生长因子基因稳定转染兔骨髓基质干细胞的研究
目的 检测人血管内皮生长因子(VEGF)基因稳定转染对兔骨髓基质干细胞(BM-SC)VEGF表达的影响.方法 分离并培养兔骨髓基质干细胞,利用脂质体介导pcDNA3.1-VEGF165转染兔BMSC,G418筛选稳定表达pcDNA3.1-VEGFl65的细胞克隆,RT-PCR、Western blot法检测转染前后细胞中VEGF165 mRNA和蛋白的表达.结果 通过筛选获得了稳定表达pcDNA3.1-VEGF165的细胞克隆.逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blot结果显示:稳定转染组BMSC中可检测到VEGF165 mRNA和蛋白的表达,空白和空载体组未见VEGF表达.结论 pcDNA3.1-VEGF165载体转染的兔BMSC可稳定表达外源性VEGF165 mRNA和蛋白,可作为治疗骨缺损和骨缺血性坏死研究的种子细胞.
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表达IκBα突变体的树突状细胞对大鼠移植肾存活时间的影响
目的 观察IκBα突变体基因修饰的供体树突状细胞(IκBαM-Dc)对大鼠移植肾存活时间的影响.方法 利用重组腺病毒载体将IκBαM基因转染WF大鼠骨髓DC,流式细胞仪检测DC共刺激分子CD80、CD86表达.以wF大鼠为供体,Lewis大鼠为受体,行同种肾移植.术前7 d,受体输注供体IκBαM-DC作为IκBαM组,未输注IκBαM-DC的受体作为对照组,观察移植肾存活时间和术后肾功能变化.术后第14天检测受体T细胞对供体成熟DC及第三方大鼠成熟DC的反应性.结果 IκBαM明显抑制DC共刺激分子CD80、CD86表达.IκBαM组受体鼠移植肾存活时间为(32.5±7.8)d,较对照组移植肾存活时间(8.5±1.7)d明显延长(P<0.01);而其术后7 d血清肌酐为(57.3±8.2)μmol/L,较对照组血清肌酐(498.0±46.3)μmol/L明显减低.肾移植术后,IκBαM组受体T细胞对供体成熟DC反应明显低于对照组,而对第三方大鼠成熟DC的反应性与对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05).结论 表达IκBα突变体的供体树突状细胞能诱导受体大鼠T细胞对供体抗原的免疫低反应,显著延长大鼠移植肾存活时间.
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两种大鼠肺动脉高压模型肺血管重塑的血流动力学、组织学和体视学指标变化
目的 构建大鼠颈动静脉分流型(CA-JV)和野百合碱诱导型(MCT)肺动脉高压模型,观察两种肺动脉高压模型肺血管重塑的血流动力学、组织学和体视学指标改变.方法 36只Spargue-Dawley大鼠,对照组、CA-JV和MCT肺动脉高压模型各12只,MCT组6周,其余两组12周后测定右心室收缩压(RVSP),并取左下肺组织测定肺小动脉横截面厚度指数(TI)和面积指数(AI)以及肺小动脉纤维比例.结果 大鼠分流型与药物型肺动脉高压模型中RVSP(37.69±3.00、43.99±4.60)、TI(0.43±0.16、0.41±0.13)和AI(0.65±0.19、0.64±0.15)和肺小动脉纤维比例(33.59±7.58、30.33±7.24)均较对照组均显著升高,药物型模型RVSP升高更明显(P<0.05),分流型模型肺小动脉纤维比例更高(P<0.05).结论 两种肺动脉高压模型均可以造成大鼠血流动力学变化和肺血管结构改变,不同模型肺血管重塑存在不同特点.
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表达金黄色葡萄球菌肠毒素A基因的高靶向、双调控溶瘤腺病毒载体的构建、鉴定及其抗膀胱肿瘤作用
目的 构建表达超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素A基因的高靶向、双调控选择增殖型溶瘤腺病毒SG502-SEA及对照组携带超抗原SEA基因的非增殖溶瘤腺病毒DC318-SEA,并探讨其潜在的抗膀胱肿瘤作用.方法 将超抗原SEA基因片段经SpeⅠ和SalⅠ双酶切后,克隆入经同样酶切后的非增殖溶瘤腺病毒载体pSG218中,将鉴定正确的腺病毒载体命名为pDC318-SEA.同样方法将超抗原SEA基因片段克隆入双调控特异性增殖溶瘤腺病毒载体pSG502中,将鉴定正确的腺病毒载体命名为pSG502-SEA.将以上两种携带SEA基因的病毒载体与病毒骨架质粒PPE3-ccdB共转染293细胞,9～14 d出现病毒空斑,经过3次病毒空斑纯化,提取腺病毒DNA,应用PCR进行鉴定,经鉴定正确的腺病毒分别命名为DC318-SEA和SG502-SEA.大量扩增后,氯化铯梯度离心纯化腺病毒,测病毒滴度.结果 经PCR及酶切鉴定,SEA基因成功克隆到两病毒载体中,可以表达SEA基因,且病毒滴度为2.5 × 1010pfu/ml.结论 成功构建表达超抗原SEA基因的双调控、高靶向选择增殖型溶瘤腺病毒SG502-SEA及对照组携带超抗原SEA基因的非增殖溶瘤腺病毒DC318-SEA.
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内皮素-1受体拮抗剂(BQ-123)对大鼠肺缺血-再灌注损伤的保护作用
目的 观察大鼠肺动脉阻断不同时段肺功能及结构的变化及内皮素-1受体拮抗剂的肺保护作用.方法 Wistar大鼠24只,雌雄不分,随机分成4组(每组6只),假手术组(Ⅰ组)、左肺动脉阻断45 min(Ⅱ组)、左肺动脉阻断60 win(Ⅲ组)、左肺动脉阻断60 min前静脉注射内皮素-1受体拮抗剂BQ-123,1 mg/kg(Ⅳ组).实验结束时,检测肺组织的湿/干比(W/D)、血浆内皮素含量(ET-1)、平均肺动脉压力(mPAP)、PaO2、免疫组织化学方法测定肺组织Fas蛋白表达的变化,同时观察肺组织光学显微镜下的变化.结果 与Ⅰ组比较Ⅱ组肺组织的W/D、ET-1、mPAP、PaO2、肺组织Fas蛋白表达变化差异无统计学意义(P>0.05)、Ⅲ组W/D、ET-1、mPAP、Fas蛋白表达增加,PaO<<2下降(P<0.01).Ⅳ组与Ⅲ组比较,W/D、ET-1、mPAP、Fas蛋白表达降低,PaO2升高(P<0.01).光学显微镜下观察见Ⅱ、Ⅳ组肺组织损伤明显轻于Ⅲ组.结论 大鼠可以耐受左侧肺动脉阻断45 min,恢复灌注后缺血-再灌注损伤对肺结构和功能影响较小,而阻断60 min,再灌注后对肺结构和功能均有较明显损伤,内皮素-1受体拮抗剂具有一定的对肺缺血-再灌注损伤的肺保护作用.
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TIP30在胃癌及其肝转移灶中的表达
目的 检测TIP30蛋白在胃癌及其肝转移灶中的表达,探讨其在胃癌发生发展中的作用.方法 用免疫组织化学和逆转录.聚合酶链反应(RT-PCR)的方法,检测86例胃癌及22肝转移标本中TIP30表达.结果 TIP30蛋白在胃癌及其肝转移灶中的阳性表达率分别为60.5%和45.5%,与正常组织(89.5%)比较,差异有统计学意义(P<0.05).TIP30表达水平与患者年龄、性别、病理分化程度无明显相关,与有无淋巴结转移有关.TIP30在肝转移灶中的表达水平较原发灶中偏低(P<0.05).结论 TIP30在胃癌及肝转移组织中表达降低,提示其在胃癌发生及转移过程中发挥作用.
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淋巴靶向性MR造影剂Dextran-Gd-DTPA对兔腘窝VX2肉瘤转移性淋巴结的诊断价值
目的 探讨新型淋巴靶向造影剂Dextran-Gd-DTPA对良、恶性淋巴结的鉴别诊断价值.方法 取12只新西兰大白兔(24个胭窝淋巴结)分成2组:正常组及VX2肉瘤腘窝淋巴结肿瘤转移组各6只.经双侧趾蹼间隙注射Dextran-Gd-DTPA后行MR增强扫描,计算标准化信号强度(SI)和增强率(En%).同时在体外检测Dextran-Gd-DTPA溶液中质子的自旋-晶格弛豫时间T1并计算R1值.结果 Dextran-Gd-DTPA的T1值为0.035 56 s,R1值为33.37·L(mmol·s)-1.正常组淋巴结明显强化,增强率约100%;VX2肉瘤转移性淋巴结表现为强化不明显,增强率为23%,两组差异有统计学意义.结论 Dextran-Gd-DTPA经组织间隙给药明显增强正常淋巴结,转移性淋巴结强化效应不明显,这种新型MR造影剂对鉴别良恶性淋巴结有重要价值.
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生物钟基因hPer2在人结直肠癌中的表达及其临床意义
目的 检测hPer2蛋白在人结直肠癌中的表达,探讨其临床意义.方法 取人结直肠癌及癌旁组织各38例,以免疫组织化学方法检测其中hPer2蛋白的表达,并分析其表达与l临床及病理常用指标的关系.结果 在结直肠癌及癌旁正常黏膜细胞中hPer2均有表达,阳性表达率分别为81.6%(31/38)及97.4%(37/38),两者间差异有统计学意义(P<0.05).以癌旁组织为参照,hPer2在癌组织中表达下调者占63.1%(24/38),表达上调者占5.3%(2/38),无明显区别者占31.6%(12/38),其差异有统计学意义(P<0.01).hPer2表达失调与结直肠癌患者年龄≤50岁、肿瘤组织学分级高、浸润深度深、有淋巴结转移、TNM分期晚相关(P<0.05).结论 hPer2在人结直肠癌中表达下调.hPer2表达的失调甚至缺失可能与结直肠癌的生长、浸润、转移相关.
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毒性多结节性甲状腺肿细胞的生物学行为改变
目的 观察毒性多结节性甲状腺肿(TMG)促甲状腺激素受体(TSHR)基因突变情况及探讨TSHR基因突变引起TMG细胞的生物学行为的改变.方法 将21例TMG患者手术切除标本中甲状腺结节组织及其作为对照组的结节周围正常的甲状腺组织分别提取DNA,对目的 基因片段进行扩增聚合酶链反应(PCR)反应及DNA测序分析.结果 21例TMG标本中发现11例存在TSHR基因突变(52.3%).其中,4例碱基插入性突变:在1928和1929位核酸之间播入了一个鸟嘌呤(G),使该密码子609位以后的氨基酸发生了移码突变;7例为点突变:第613位密码子的第一碱基即第1937位核苷酸发生T→A转换,使密码子由TAC变为AAC,酪氨酸被天冬酰胺置换即Tyr613Asn(TAC→AAC).对照组未发现TSHR基因突变.结论 基因突变的TSHR对TMG细胞的生物学行为的改变起着一定作用.
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甲基强的松龙在过伸性颈髓损伤围手术期的应用
本研究旨在观察甲基强的松龙在过伸性颈髓损伤围手术期的应用结果.一、材料与方法2004年4月至2008年4月间我科行手术治疗的过伸性颈髓损伤病例共计53例,其中围手术期使用甲基强的松龙的病例33例(A组),未使用甲基强的松龙的20例(B组).A,B组年龄、性别构成无统计学差异,组间术前JOA评分差异无统计学意义(P>0.01).
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体内外联合切除法在大鼠30%减体积肝移植中的应用
大鼠30%减体积肝移植模型是临床亲体肝移植、劈离式肝移植等实验研究的重要工具[1].供肝修整时切除左外叶、中间叶达到减体积目的是目前普遍采用的方法"[1,2],我们以体内外联合切除法建立大鼠30%减体积移植模型,探讨其优越性.
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补阳还五汤预处理大鼠对其脑死亡后肝脏的保护作用
脑死亡供体器官移植后易发生急慢性排斥反应,移植前改善脑死亡供体器官质量是获得移植物长期存活和功能的关键[1].本研究旨在观察补阳还五汤(BYHWT)预处理大鼠对其脑死亡后肝脏炎症细胞因子、p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)磷酸化和反应性氧族(ROS)的变化,探讨其对肝脏的保护机制.
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移植再细胞化的猪股动脉在犬体内的抗钙化作用
血管移植术是解决动脉严重狭窄等病变的主要方法之一,组织工程血管能克服现有人工血管的不足,但是否如此尚待验证,为此我们进行组织工程血管的体内研究.
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SD大鼠胰腺癌模型制作及其癌基因K-ras和抑癌基因p53、Smad4的表达
胰腺癌恶性程度高,预后差,其病因及发病机制尚未完全明了[1].我们通过6、9 mg两种不同剂量化学致癌剂二甲基苯并蒽(DMBA)诱导Sprague-Dawley(SD)大鼠原位胰腺癌模型,并比较其优劣,寻找出一个较理想的胰腺癌模型制作方法[2],用免疫组织化学方法动态检测大鼠胰腺组织标本K-ras、p53、Smad4的表达[3],探讨胰腺癌的发病机制.
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α-平滑肌肌动蛋白在高血压大鼠肾间质纤维化中的作用
本研究旨在建立两肾一夹高血压大鼠模型,观察α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、Ⅲ型胶原(COLⅢ)在大鼠高血压肾间质纤维化(RIF)中的作用.
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局部应用低剂量粒细胞集落刺激因子治疗血管新生
人粒细胞集落刺激因子(G-CSF)在治疗肢体缺血或心肌缺血中被认为是一种有效的方法,但由于其使用后可快速升高外周血白细胞数量,会产生类白血病样反应等相关不良反应[1],临床应用受到限制.本研究旨在观察低剂量G.CSF局部应用对缺血肢体产生新生血管的作用.
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前臂骨间膜的生物力学研究
前臂剧烈创伤致尺桡骨纵向分离常伴有急性骨间膜(IOM)损伤,由于X片检查无法显示骨间膜,因而漏诊较多,而漏诊的结果是桡骨上移,下尺桡关节脱位导致腕关节疼痛及前臂旋转功能障碍等[1].
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腺病毒介导的Akt1基因转染大鼠胰岛对其生存的影响
Akt亦称蛋白激酶B(ptotein kinaseB,PKB)属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族成员,在细胞存活、细胞增殖、细胞代谢和细胞凋亡等活动中扮演着关键角色[1].Akt1是Akt蛋白3种主要亚型之一.
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微生态制剂的作用机制及其在慢性肝病中的应用
微生态制剂(microbioecological preparations)亦称微生态调节剂,是在微生态理论指导下,利用对宿主有益的正常微生物及其代谢产物或生长促进物所制成的即含有活菌、灭活菌、菌体组分及产物或仅含活菌体和死菌体的微生物制剂[1].
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马血清致敏条件下鸡乙醇性股骨头坏死模型的制作
目的 制作马血清致敏条件下鸡乙醇性股骨头坏死的动物模型.方法 取64只健康成年雄性三黄鸡随机分为4组.A组:马血清+乙醇组;B组:单纯乙醇组;C组:单纯马血清组;D组:空白对照组.于灌胃第4、8周末分批处死,取股骨头制作苏木素-伊红(HE)和冰冻切片,光镜观察组织学变化并测算骨小梁面积分数、空骨陷窝计数、大脂肪细胞平均直径、股骨头坏死发生率等指标.于灌胃第8周末取股骨头制作标本在扫描电镜下观察组织学变化.结果 灌胃第4周末,各组股骨头组织未见明显病理改变.灌胃第8周末,A组股骨头软骨下骨髓内造血组织明显?栽减少,脂肪细胞增殖肥大,骨小梁明显变细、稀疏,多处断裂,骨小梁面积分数降低,空骨陷窝显著增多,与其他3组比较,P<0.01.A、B、C、D组股骨头坏死发生率分别为87.5%、25.0%、25.0%、0%.扫描电镜下观察可见A组股骨头表面凹陷,伴有多处裂痕,骨小梁失去原有形态,变细、稀疏,多处断裂,空骨陷窝增多,而B、C、D组未见到这些变化.结论 鸡是制作乙醇性股骨头坏死动物模型的理想动物;马血清致敏条件下,可以缩短造模周期,提高造模成功率.
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RNA干扰白细胞抗原-G增强自然杀伤细胞对肝癌的免疫监视
目的 构建表达人类白细胞抗原-G(HLA-G)基因shRNA载体,探讨其对自然杀伤细胞(NK)细胞杀伤效应的影响.方法 构建4个HLA-G-shRNA真核表达质粒,转染至Huh7细胞.检测HLA-G mRNA及蛋白质水平的表达.将NK-92MI细胞与靶细胞共同培养,以LDH释放法观察不同效靶比时NK-92MI细胞对靶细胞的杀伤效应.结果 经酶切及测序鉴定证实,插入序列与设计的序列相符.Real Time-PCR和Western-blot结果均表明重组载体抑制了Huh7细胞HLA-G基因的表达.NK-92MI细胞对转染HLA-G的shRNA的Huh7细胞杀伤作用明显升高(P<0.01).封闭NK-92MI细胞ILT2受体后,杀伤作用降低(P<0.01).结论 HLA-G shRNA可以增强NK细胞对肝癌细胞的杀伤效应.
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表皮生长因子对肝星状细胞c-jun基因表达的影响
目的 观察表皮生长因子(EGF)对肝星状细胞c-jun基因表达的影响.方法 在培养的肝星状细胞株中加入不同浓度的EGF(终质量浓度20、100、500μg/L),于8、24、48、72 h四个时间点分别收集细胞,提取肝星状细胞总RNA;用逆转录定量聚合酶链反应(PCR)方法测定c-jun的基因表达水平.结果 EGF 3组HSC-T6细胞c-jun基因表达水平在8 h(1.46±0.16、2.12±0.20、2.78±0.32)、24 h(1.32±0.13、1.87±0.17、2.43±0.26)、48 h(1.03±0.10、1.51±0.13、2.03±0.20)、72 h(0.77±0.09、1.17±0.10、1.66±0.12)四个时间点均显著高于对照组;随剂量加大,HSC-T细胞c-jun基因表达水平逐渐升高;3组间差异有统计学意义.结论 EGF对肝星状细胞c-jun基因表达有明显的上调作用.
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重组质粒pcDNA3.1(+)/HSP70-Endo/EGFP的构建及在HepG2细胞的表达
目的 构建热休克蛋白70(HSP70)启动子调控内皮抑素(Endo)基因的重组质粒pcDNA3.1(+)/HSP70-Endo/EGFP,观察其在HepG2细胞中的表达规律.方法 用聚合酶链反应(PCR)法体外扩增HSP70启动子(350 bp);用EcoR Ⅰ、Sal Ⅰ双酶切法切取质粒pSP-Endo/EGFP中Endo/EGFP,克隆到pcDNA 3.1(+)中获得重组质粒pcDNA 3.1(+)/HSP70-Endo/EGFP.脂质体介导转染HepG2细胞,转染24 h后予以37、39、41、43、45℃加热诱导30 min,荧光显微镜和流式细胞术检测EGFP的表达,逆转录(RT)-PCR法检测细胞内Endo mRNA的表达;ELISA法检测转染细胞上清中Endo蛋白浓度.结果 合成HSP70启动子序列测序结果与Gene Bank中AL671762所提供序列完全一致.低温加热可增强HepG2细胞中Endo/EGFP表达,43℃组EGFP表达强度达37℃组的3.3倍.43℃组Endo mRNA表达水平高于不加热组.43℃组上清Endo蛋白浓度为(177±28)μg/L,高于不加热组(43±11)μg/L.结论 成功构建HSP70启动子调控Endo基因的重组质粒,低温加热可增强HepG2细胞中Endo基因的表达.
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肝靶向性Gal-PEG-PEI纳米载体介导psiRNA转染HepG2细胞效率的检测
目的 检测肝细胞靶向性Gal-PEG-PEI纳米基因载体介导psiRNA转染HepG2细胞的效率.方法 纳米粒径仪和透射电镜测定Gal-PEG-PEI/psiRNA复合物的粒径和形态,转染HepG2细胞,48 h后用流式细胞仪测定转染效率.转染前加入1 mg半乳糖观察其半乳糖竞争拮抗结果.结果 Gal-PEG-PEI/psiRNA复合物的粒径随N/P的增大而减小,小粒径为81.1 nm;Gal-PEG-PEI载体的转染效率为(37.34±2.50)%,明显高于PEG-PEI、LipofectamineTM 2000及裸psiR-NA;加入竞争拮抗剂半乳糖后Gal-PEG-PEI的转染效率下降至3.60%.结论 Gal-PEG-PEI纳米基因载体对HepG2细胞有较高的转染效率,具有良好的肝细胞靶向性.
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重组腺病毒介导白细胞介素-18和甲胎蛋白基因修饰的树突状细胞体外诱导抗肝癌免疫活性的研究
目的 探讨甲胎蛋白(AFP)、白细胞介素(IL)-18基冈修饰树突状细胞(DC)较以往AFP基因修饰DC作为肝癌免疫治疗瘤苗是否更具优势.方法 分离外周血单个核细胞定向诱导为DC,以Ad-IL-18和Ad-AFP共感染DC,感染后细胞通过噻唑蓝(MTT)比色法检测其激活的T细胞对HepG2的杀伤活性.结果 检测结果显示目的 基因能够表达于DC细胞中.流氏细胞仪(FCM)结果显示共感染的DC细胞均高表达CD1a(73.4%)、CD11c(84.3%)、CD80(89.5%)、CD86(87.9%)和HLA-DR(91.7%).CTL结果显示IL-18/AFP-DC-T对HepG2的杀伤率(67.49±3.24)%明显高于对SMMC7721细胞(27.32±1.75)%和K562细胞(17.31±1.56)%的杀伤率,另外共感染IL-18/AFP-DC-T组对HepG2的杀伤率与AFP-DC-T、IL-18-DC-T组比较,其差异有统计学意义.结论 AFP和IL-18基因修饰DC,能够在体外诱导特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)效应,而_且对HepG2细胞杀伤率大于AFP转染DC组.
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去铁胺在大鼠自体肝移植术后余肝细胞凋亡中的作用
目的 探讨去铁胺预处理对大鼠自体肝移植余肝细胞凋亡的作用及机制.方法 建立大鼠自体肝移植模型,将96只健康雄性SD大鼠随机分为去铁胺预处理(D组)32只,注射用水对照组(C组)32只和假手术模型(S组)32只.分别于术后0.5、2、6、24 h各时间点处死大鼠,检测血清ALT和AST水平;做病理组织学检查,免疫组织化学检测缺氧诱导因子(HIF)-1α、肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-1及bcl-2蛋白的表达,TUNEL测定细胞凋亡.结果 在各个时间点,D组血清ALT及AST水平及IL-1、TNF-α蛋白表达量和凋亡指数明显低于C组(P<0.01),而HIF-1α和bcl-2蛋白表达量明显高于C组(P<0.01).结论 去铁胺预处理对大鼠自体肝移植余肝细胞凋亡具有保护作用,其作用机制部分可能与促进HIF-1α表达上调,从而降低炎性因子水平,促进bcl-2表达达到抑制细胞凋亡的作用.
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KLF8在不同肝癌细胞株及肝癌组织中的表达及其意义
目的 观察不同肝癌细胞株及肝癌组织中Krappel样因子8(KLF8)的表达,并探讨其意义.方法 用逆转录.聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blot、免疫化学方法分别检测不同肝癌细胞株及肝(癌)组织中KLF8的mRNA和蛋白质水平.结果 KLF8的mRNA及蛋白质水平随肝癌细胞株侵袭转移潜能的增强而明显升高(P<0.05);正常肝组织(6例)、无转移肝癌组织(17例)、有转移肝癌组织(6例)中KLF8 mRNA的相对表达量分别为0.2377±0.0658、0.4683±0.2073、0.6669±0.0239(P<0.05);在正常肝组织和肝硬化组织中KLF8蛋白表达的阳性率分别为16.7%(1/6)和33.3%(2/6),均为弱阳性,在肝癌组织中强阳性率为81.8%(27/33),肝癌转移灶中强阳性率为83.3%(5/6)(P<0.01).结论 KLF8可能参与肝癌的发生和侵袭转移.
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三氧化二砷对肝癌细胞CD44v6、Ezrin基因表达的影响
目的 观察肝癌HepG2细胞转移相关基因CD44v6、Ezrin mRNA表达及三氧化二砷(As2O3)对其表达的影响.方法 以逆转录一聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测HepG2细胞中CIM4v6、Ezrin基因mRNA的表达及As2O3作用后其表达水平的变化.结果 HepG2细胞CD44v6及Ezrin mRNA均有表达.CD44v6-mRNA表达水平为1.57±0.47;经0.25 mg/L As2O3作用4、6、8 d后其表达水平分别下降到0.95±0.25、0.90±0.24和0.63±0.19(P<0.05),下降水平呈时间依赖;Ezrin-mRNA表达水平为0.70±0.18,加入0.25 mg/L的As2O3 4、6、8 d后,表达水平分别为0.70±0.21、0.75±0.22和0.71±0.20,各时间段Ezrin-mRNA的表达水平无明显变化(P>0.05).结论 As2O3可显著下调HepG2细胞CD44v6-mRNA的表达,对Ezrin-mRNA的表达可能无直接调节作用.
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青蒿素联合全转铁蛋白对肝癌的选择性抑制作用
目的 观察青蒿素联合全转铁蛋白在体外对人肝癌SMMC-7721细胞的选择性抑制作用.方法 采用嚷唑蓝(MTT)着色细胞计数及锥虫蓝染色计数检测青蒿素联合全转铁蛋白对人肝癌SMMC-7721细胞的细胞生长、增殖和细胞活力的影响.结果 青蒿素在各种浓度显著地抑制SMMC-7721细胞的生长、集落形成以及细胞活力(P<0.05).青蒿素导致所有实验细胞株的肿瘤细胞死亡,但是敏感性有所变化,在加入全转铁蛋白后,青蒿素对人肝癌SMMC-7721细胞的选择性毒性作用明显增强(P<0.01).结论 青蒿素联合全转铁蛋白能有效地抑制人肝癌SMMC-7721细胞的生长、细胞增殖和细胞活力.
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含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸肽白细胞介素-24突变体蛋白对肝癌细胞抑制作用
目的 观察含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)肽模体的白细胞介素(IL)-24突变体蛋白(RGD-IL-24)对肝癌细胞的抑制作用.方法 肝癌HepG2细胞分别加入各10μl的RGD-IL-24(8 mg/L)、IL-24(8 mg/L)和磷酸盐缓冲液(PBS),噻唑蓝(MTT)比色法检测HepG2细胞生长抑制作用;DAPI染色检测HepG2细胞凋亡;免疫印迹法检测HepG2细胞bax、bcl-2及Caspase-3蛋白表达;黏附实验检测与HepG2细胞的靶向黏附.结果 RGD-IL-24、IL-24治疗4 d后HepG2细胞存活率分别为(0.219±0.015)、(0.397±0.009),与对照组(0.823±0.013)比较差异有统计学意义(P<0.01).RGD-IL-24、IL-24治疗组细胞凋亡率分别为(0.631±0.027)、(0.472±0.031),与对照组(0.082±0.013)比较差异有统计学意义(P<0.01).RGD-IL-24抑制HepG2细胞生长、诱导凋亡效果均比IL-24显著增强(P<0.05).与IL-24治疗组比较,RGD-IL-24治疗组HepG2细胞促凋亡蛋白bax增加、抗凋亡蛋白bcl-2减少、活化Caspase-3蛋白量增加.黏附实验证实RGD-IL-24与HepG2细胞的靶向结合作用增强.结论 含RGD肽模体的IL-24蛋白能通过与肝癌HepG2细胞的靶向结合增强其凋亡诱导作用.
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巨噬细胞移动抑制因子小干扰RNA对肝癌细胞表达血管内皮生长因子的抑制效应
目的 观察巨噬细胞移动抑制因子(MIF)小干扰RNA(siRNA)对肝癌细胞表达血管内皮生长因子(VEGF)的影响.方法 Western blot检测MIF和VEGF在肝癌和癌旁组织的表达情况;人工化学合成MIF siRNA和对照siRNA,将其转染PLC、HepG2肝癌细胞株,定量聚合酶链反应(PCR)和Western blot检测MIF和VEGF mRNA及其蛋白的表达.结果 MIF、VEGF mRNA和蛋白在肝癌组织中高表达.MIF siRNA(50、100 nmol/L)转染肝癌细胞株后,PLC细胞MIF和VEGFmRNA水平分别下调(78.8±7.2)%、(90.4±2.9)%和(60.6±2.6)%、(79.8±1.2)%;HepG2细胞MIF和VEGF mRNA水平分别下调(74.3±8.9)%、(88.4±4.6)%和(65.6±4.6)%、(80.7 ±2.2)%.MIF蛋白分别下调(57.3±3.4)%、(78.7±1.2)%和(54.8±6.8)%、(77.9±2.3)%,并呈剂量依赖关系;伴随MIF mRNA和蛋白的表达下调VEGF蛋白分别下调(52.6±12.9)%、(87.4±2.3)%和(52.4±11.1)%、(68.5±2.8)%,亦呈剂量依赖关系,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01),两干预组间的差异也有统计学意义(P<0.05).结论 MIF siRNA能特异性阻断PLC及HepG2细胞MIF mRNA和MIF蛋白的表达,并且同时有效下调VEGF mRNA及其蛋白的表达,MIF可能通过调控VEGF基因和蛋白的表达,参与肿瘤血管的生成和促进肿瘤细胞的转移.
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细胞外信号调节蛋白激酶、c-Jun氨基末端蛋白激酶在人肝硬化肝癌组织中的表达
目的 观察人肝硬化肝癌组织中丝裂原活化蛋白激酶家族两种主要亚型细胞外信号调节蛋白激酶(ERK)、c-Jun氨基末端蛋白激酶(JNK)的表达.方法 应用半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测10例人中晚期肝硬化肝癌及其癌旁正常组织中ERK、JNK mRNA的相对表达量,并采用Western blot检测上述组织中ERK、JNK蛋白产物表达.结果 90%(9/10)的肝癌组织中ERK、JNK mRNA和蛋白表达增强,而癌旁组织中80%(8/10)该基因表达缺失和蛋白表达减少,两者差异有统计学意义(P<0.05).结论 肝硬化肝癌组织中ERK、JNK表达处于活化状态,可能在肝硬化肝癌的发生、发展过程中发挥重要作用.
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肝动脉结扎对转移性人肝癌裸鼠原位移植瘤乏氧的影响
目的 观察肝动脉结扎(HAL)对转移性人肝癌裸鼠原位移植瘤乏氧的影响.方法 采用24只BALB/C-nu/nu裸鼠,建立转移性人肝癌裸鼠原位移植模型;随机分为2组,A组于移植瘤术后2周进行HAL(n=12),B组假手术(Sham)作为对照(n=12).分别于干预术后2 d和4周各随机处死每组中6只荷瘤裸鼠,利用免疫组织化学显色(SP法)和Western blot检测移植瘤内哌莫硝唑(Pimonidazole)和缺氧诱导因子(HIF)-1α的阳性表达和染色强度,以及血管内皮生长因子(VEGF)蛋白水平和肿瘤组织微血管密度(MVD),并用肺连续切片法计数4周时荷瘤裸鼠肺转移灶.结果 与Sham组比较,HAL组移植瘤内Pimonidazole阳性细胞及HIF-1α表达水平在术后2 d显著增加(P<0.05),并且肿瘤组织和血清内VEGF水平[(922.5±59.3)比(349.6±46.5)ng/L,P<0.01]明显增加.术后4周,荷瘤裸鼠肺转移率较对照组增加(6/6比1/6,P<0.05),但此时乏氧细胞,VEGF表达和MVD则与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05).结论 HAL促进转移性人肝癌裸鼠原位移植瘤短期乏氧及VEGF表达,但不影响移植瘤长期乏氧效应.
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人TRPC1基因真核表达载体的构建及肝细胞表达
目的 构建人TRPC1基因真核表达载体,并观察其在人肝细胞株(HL-7702)中的表达.方法 提取细胞总RNA,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)得到TRPC1基因的编码序列,经纯化回收后克隆入表达载体pGM-T中,酶切及琼脂糖凝胶电泳分析鉴定,后转染HL-7702细胞,通过电泳和噻唑蓝(MTY)比色法检测基因表达与细胞生长.结果 扩增片段长度为455 bp,重组质粒pGM-T-TRPC1经酶切鉴定条带位置正确,证明表达载体成功构建.电泳结果显示转染重组质粒后的HL-7702细胞表达TRPC1增强.MTF检测发现转染前后肝细胞生长未受到明显影响(t值分别为0.43、-0.40、-2.01、-1.60、-0.41和-0.72,P值均0.05).结论 成功构建人TRPC1基因的真核表达载体pGM-T-TRPC1,并在人肝细胞株HL-7702中稳定表达.
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重组人肝细胞生长因子在Celisor液中对无心跳供肝的保护作用及其机制
目的 探讨Celsior(CS)液中添加重组人肝细胞生长因子(rhHGF)对无心跳供肝(NHBD)的保护作用及其可能机制.方法 利用大鼠肝移植模型,比较添加rhHGF(10μg/L)的CS液(实验组)与添加等量生理盐水的CS液(对照组)两组门静脉再通后胆汁产生量、肝组织含水量及肝酶水平,观察生存率,TUNEL法检测肝细胞凋亡及常规病理组织学检查.结果 与对照组比较,试验组NHBD供肝移植后在门静脉再通1 h,3 h及6 h胆汁产生量明显增多(P<0.05),ALT与AST水平明显降低(P<0.05);在门静脉再通1 h肝组织含水量及肝细胞凋亡指数明显下降(P<0.05);7 d大鼠生存率明显升高(P<0.05),病理组织学提示肝细胞水肿变性明显减轻,无肝细胞坏死及肝窦淤血.结论 CS灌注保存液中添加外源性rhHGF可明显改善其对NHBD供肝的保存效果,这可能与其减少肝细胞凋亡有关.
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微RNA-21在肝细胞癌中的表达及其靶基因研究
目的 探讨微RNA(miRNA)-21在肝细胞癌中的表达特征及其功能,筛选并鉴定miRNA-21可能调控的靶基因.方法 用PAGE/Northern blot方法分析miRNA-21在10例肝细胞癌患者组织标本中的表达特征,并在3种肝癌细胞株中加以验证.用生物信息学分析预测miRNA-21可能的靶基因,通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法克隆靶基因的调控区序列,利用荧光素酶双报告基因系统筛选,并通过Western blot、流式细胞仪在蛋白质水平进行分析验证.用体外细胞侵袭实验分析miRNA-21与肝癌细胞侵袭能力的关系.结果 miRNA-21在10例肝细胞癌患者中均表达上调,与癌旁组织比较,表达量增加10倍以上.在3种肝癌细胞株中也得到相似的结果.筛选并确认了RECK为miRNA-21的调控靶基因之一.抑制miRNA-21的表达可明显降低肝癌细胞的侵袭.结论 miRNA-21在肝细胞癌中表达失控,通过抑制RECK表达促进肿瘤细胞侵袭.
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肝癌上皮-间叶样表型转化与Caveolin-1表达之间的关系
目的 探讨肝细胞癌中Caveolin-1表达与上皮-间叶样表型转化(EMT)之间的关系.方法 应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blot和免疫组织化学技术检测人肝癌细胞株和肝细胞癌组织标本中Caveolin-1和EMT指标mRNA和蛋白的表达.结果 RT-PCR和Westernblot结果显示,在HepG2、SMMC7721细胞株中,Caveolin-1 mRNA表达量(0.03±0.01、26.63±0.49)和蛋白表达量(0.00 ±0.00、1.56 ±0.17)均与上皮细胞标志物E-cadherin(14.97 ±0.03、0.06±0.00)、(1.04±0.06、0.00±0.00)负相关,与间叶细胞标志物N-cadherin(2.03±0.07、9.54 ±0.05、0.68 ±0.09、0.95±0.05)、Vimentin(0.13±0.06、6.13±0.68、0.00±0.00、1.09±0.15)正相关.免疫组织化学结果显示,在82例肝细胞癌组织标本中,转移组癌组织中Caveolin-1表达明显低于癌旁组织(P<0.05),且与上皮细胞标志物ZO-1、E-cadherin负相关,与间叶细胞标志物N-cadherin正相关.结论 肝细胞癌中Caveolin-1表达升高与转移和EMT有关.
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甲胎蛋白增强子调控的小干扰RNA质粒载体的构建
目的 构建AFP增强子调控的小干扰RNA质粒载体.方法 从HePG2细胞中提取AFP基因.采用定向克隆的方法,构建质粒pGenesil-AFP.pGenesil-AFP质粒DNA扩增、提取后转化到DH5感受态细胞.针对目的 基因Survivin的序列,构建pGenesil-AFP-shRNA.结果 pGen-esil-AFP-shRNA质粒经XbaI和Hind Ⅲ双酶切鉴定,获得一856 bp大小和4506 bp大小的片段,通过基因测序分析,证明质粒载体构建正确,用紫外分光光度计测得质粒的浓度为1.3 g/L,A值为1.94,说明制备的质粒纯度较高.结论 成功构建AFP增强子调控的Survivin shRNA融合质粒.
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载脂蛋白M在肝癌组织中的表达
目的 分析肝细胞肝癌患者血浆中载脂蛋白M(ApoM)的水平,观察ApoM mRNA水平在肝癌癌组织与癌旁组织中的表达.方法 使用Dot-blot技术检测36例肝癌患者及64例正常人血浆中APOM的水平,应用实时逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测ApoM mRNA在肝癌癌组织与癌旁组织中的水平,并采用Elivision TMplus免疫组织化学染色法对肝癌癌组织与癌旁组织ApoM组织学分析.结果 肝癌患者血浆中ApoM的水平为(0.61±0.30)ODu·mm-2,明显高于正常人(0.37±0.07)ODu·mm-2,两者差异有统计学意义(P<0.01).肝癌组织APOM mRNA表达明显低于肝癌癌旁组织水平(P<0.05),免疫组织化学染色进一步证实了肝癌组织ApoM阳性显色低于癌旁癌组织.结论 肝癌癌组织APOM mRNA水平明显低于肝癌癌旁组织,而血浆中ApoM的水平明显高于正常人.
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Smad4小分子干扰RNA对转化生长因子-β诱导的纤溶酶原激活物抑制剂-1表达的影响
目的 探讨Smad4小分子干扰RNA(siRNA)对转化生长因子(TGF)-β诱导纤溶酶原激活物抑制剂(PAI)-1的表达的影响及作用机制.方法 将Smad4 siRNA转染入肝星状细胞24h后行TGF-β(1μg/L)刺激,24、48 h后收集细胞.利用萤光素酶报告基因法测定Smad结合转写因子的活性;Northern印迹分析技术检测PAI-1 mRNA表达的变化;Western印迹分析观察Smad4蛋白、PAI-1蛋白的变化.结果 Smad4 siRNA能抑制Smad4蛋白(3.0±0.1比16.0±0.5)表达;Smad4 siRNA抑制TGF-β1和ALK5激活的4×SBE荧光素酶报告基因活性;TGF-β时间依赖性促进PAI-1 mRNA表达,24 h达高峰;Smad4 siRNA从mRNA(1.3±0.1比6.5±0.2)和蛋白(1.50±0.15比5.52±0.36)水平抑制TGF-β激活的PAL-1的表达.结论 Smad4 siRNA能够有效地阻断TGF-β诱导的PAI-1表达.
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含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸肽的白细胞介素-24突变体真核表达载体的构建及其体外抗肝癌作用
目的 构建含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)肽的白细胞介素(IL)-24突变体(RGD-IL-24)真核表达质粒,观察其对肝癌细胞的抑制作用.方法 利用重叠PCR技术在IL-24cDNA中插入GGT三个碱基,获得RGD-IL-24 cDNA.将其克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+),构建pcDNA3.1/RGD-IL-24.将pcDNA3-1/RGD-IL-24及作为对照的pcDNA3.1/IL-24转染肝癌细胞HepG2,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测IL-24 mRNA表达;Western blot检测IL-24蛋白表达;噻唑蓝(MTT)检测细胞增殖;FITC-Annexin V染色检测细胞凋亡;Western blot检测bax、bcl-2表达.结果 测序证明pcDNA3.1/RGD-IL-24构建成功.RT-PCR、Western blot证实转染pcDNA3.1/RGD-IL-24的肝癌HepG2细胞表达IL-24.pcDNA3.1/RGD-IL-24、pcDNA3.1/IL-24处理组HepG2细胞存活率分别为(0.382±0.064、0.563±0.038),凋亡细胞阳性率分别为(0.346±0.049、0.163±0.087),两组差异均有统计学意义.Western blot证实pcDNA3.1/RGD-IL-24促进bax表达、抑制bcl-2表达作用强于pcDNA3.1/IL-24.结论 RGD-IL-24真核表达质粒不仅不影响IL-24表达,且能显著增强IL-24诱导肝癌细胞凋亡及抑制肿瘤生长作用.
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CXC趋化因子受体2在肝细胞癌中的表达及意义
目的 探讨CXC趋化因子受体2(CXCR2)在肝细胞癌中的表达及与肝细胞癌发生、发展的关系.方法 采用半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blot检测42例肝细胞癌组织及相应癌旁组织和23例正常肝组织中CXCR2 mRNA和蛋白表达水平,分析表达水平与肝细胞癌生物学特征的关系.结果 肝细胞癌组织、癌旁组织和正常肝组织中CXCB2 mRNA和蛋白表达分别为(1.18±0.32、0.83±0.23和0.72±0.23)和(1.78±0.20、0.98±0.13和0.90±0.18),同癌旁组织和正常肝组织比较,肝细胞癌组织中CXCR2 mRNA和蛋白表达水平明显升高(P<0.05).肝内转移、门静脉癌栓和低分化组中CXCR2 mRNA和蛋白表达水平分别为(1.37±0.26、1.45±0.34、1.31±0.28)和(1.87±0.20、1.93±0.13、1.86±0.18),无肝内转移、无门静脉癌栓和高分化组CXCR2 mRNA和蛋白表达水平分别为(1.08±0.33、1.08±0.27、1.06±0.33)和(1.73±0.18、1.73±0.20、1.71±0.19),差异有统计学意义(P<0.05).CXCR2蛋白表达与TNM分期相关,Ⅲ-Ⅳ期和Ⅰ-Ⅱ期表达水平分别为1.86±0.20和1.72±0.19,差异有统计学意义(P<0.05).结论 CXCR2在肝细胞癌组织中高表达,其高表达可能与肝细胞癌发生、侵袭和转移相关.
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肝癌单链抗体研究与导向治疗进展
近年来,随着免疫学和分子生物学的发展,肝癌单链抗体(ScFv)研究取得长足进步.ScFv具有分子小、穿透力强、廓清速度快、异源性低、易于大量生产等优点,能够中和病毒和毒素,进行细胞内免疫和作为导向载体,在肝癌诊断和治疗领域中显示出了巨大的潜力.
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实验外科与外科原始性创新
近半个世纪,尤其是近30余年,外科学在世界范围内得到迅猛的发展,新型学科以及相关技术层出不穷.回顾其发展史,从中不难发现每一个成就的背后都有实验研究的突破和支撑.
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