中华实验外科杂志
Chinese Journal of Experimental Surgery 중화실험외과잡지
- 主管单位： 中国科学技术协会
- 主办单位： 中华医学会
- 影响因子： 0.75
- 审稿时间： 1-3个月
- 国际刊号： 1001-9030
- 国内刊号： 42-1213/R
- 论文标题 期刊级别 审稿状态
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微小RNA let-7c通过靶定细胞周期蛋白依赖激酶6抑制肝癌细胞增殖
目的 观察微小RNA(miRNA,miR) let-7c对肝癌细胞增殖的影响并验证其靶基因.方法 实时定量聚合酶链反应(Real-time PCR)检测人肝癌细胞MHCC-97L、HepG2、HCCLM3、SMMC-7721及人肝细胞L02中let-7c的表达.使用LipofectamineTM 2000脂质体将miRNA转染入HCCLM3细胞,设转染let-7c的细胞为let-7c组,转染阴性对照miRNA的细胞为对照组,空白组未进行转染,细胞计数试剂盒(CCK-8)法检测let-7c对细胞增殖的影响,流式细胞术检验各组细胞周期的差异,Western blot检测转染后细胞周期蛋白依赖激酶6(CDK6)的蛋白表达情况.将CDK6的3'端非编码区(3'-UTR)连接入pMIR-REPORT荧光素酶载体,建成荧光素酶报告基因.将miRNA、荧光素酶报告基因、海肾荧光素酶质粒共转染入293T细胞,检测转染后荧光素酶的活性,验证1et-7c对3'-UTR的结合作用.结果 肝癌细胞MHCC-97L、HepG2、HCCLM3、SMMC-7721中的let-7c表达量均低于L02,表达量分别为(3.22±0.08) ×10-4、(2.34±0.11)×10-4、(1.85 ±0.03) ×10-4、(3.03±0.11) ×10-4及(4.37 ±0.09)×10-4(P ＜0.05).let-7c组细胞在转染后48、72、96 h的吸光度值均低于对照组及空白组(P＜0.05),而对照组与空白组比较差异无统计学意义(P＞0.05).转染后72 h,let-7c组细胞处于G1期的比例为(56.95 ±2.40)％,均高于另外两组(P＜0.05),而另外两组比较差异无统计学意义(P＞0.05).转染后48 h,let-7c组CDK6蛋白的表达量均低于另外两组(P＜0.05),而另外两组比较差异无统计学意义(P＞0.05).双荧光素酶报告基因检测发现let-7c与对照miRNA比较,能抑制荧光素酶的活性(P＜0.05).结论 let-7c在肝癌细胞中的表达低于正常肝细胞,let-7c能抑制肝癌细胞的增殖,并使细胞阻滞于G1期,CDK6是其调控的靶基因.
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不同羊水温度下阻断胎羊肺动脉对胎羊心脏的影响
目的 比较不同温度下阻断胎羊肺动脉对胎羊心脏功能的影响.方法 18头孕羊(孕120 ～ 140 d),随机分为常温组(n=6)、低温组(n=6)和对照组(n=6).常温组:使宫内羊水始终保持初始温度(39℃),阻断肺动脉30 min,30 min后放开阻断钳;低温组:通过宫内的变温管使羊水降温,当胎羊鼻咽温32℃时阻断胎羊的肺动脉主干;30 min时后松开阻断钳,并使宫内羊水复温,并维持羊水温度39℃;分别在以下时间点测量孕羊和胎羊的心率和血压,检测胎羊血的肌酸激酶Mb同工酶(CK-Mb)和肌钙蛋白(cTnI):(1)开胸前(T1);(2)阻断30 rin时(rT2);(3)开放后1h(T3);(4)开放后2 h(T4).对照组则是使宫内羊水始终保持初始温度(39℃),胎羊同样进行穿刺监测和开胸,但不阻断肺动脉.结果 所有动物到实验结束时均存活.实验过程中3组孕羊的心率为T1:(141.3±24.8)次/分,T2:(155.8±21.9)次/分,T3:(150.81±8.3)次/分,T4:(151.8±25.6)次/分,血压分别为T1:(128.0±11.2) mmHg(1 mmHg=0.133 kPa),rT2:(134.2±12.3)mmHg,T3:(140.3±22.9)mmHg,T4:(137.8±26.1)mmHg.3组胎羊的CKMB分别为:T1:(94.4±56.7) U/L,T2:(230.6±78.7)U/L,T3:(290.8±90.3)U/L,T4:(356.1±140.9)U/L.3组之间的胎羊cTnI分别为:T1:(0.088±0.046) ng/ml,T2:(0.305±0.178) ng/ml,T3:(0.513±0.351) ng/ml,T4:(0.762±0.358) ng/ml.结论 胎羊阻断肺动脉模型对胎羊的心脏有较明显的影响,宫内羊水转流降温可以减轻胎羊心脏操作对胎心的损害.
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公兔骶髓运动诱发电位在骶髓缺血损伤急性期的变化
目的 探讨公兔骶髓运动诱发电位(SMEP)在不同程度骶髓缺血损伤动物模型急性期的变化特点及与骶髓病理损害的相关性.方法 30只公兔随机分为对照组(仅分离腰动脉,n=5),实验组5组(结扎不同数量腰动脉,n=5),术后连续记录SMEP 2 h,分析SMEP波形变化特点以及与脊髓病理损害程度的相关性.结果 1根组与对照组和结扎前比较,差异无统计学意义(P＞0.05);结扎2、3、4、5根组SMEP即刻出现潜伏期延长和波幅降低,分别经过(0.2±0.2)、(0.4±0.3)、(0.3±0.2)和(0.4±0.2) min波平稳;波幅与基线波幅百分比分别稳定在(94.5±5.9)％、(51.6±30.6)％、(9.6±11.0)％、(0.0±0.0)％(P＜0.05);2根组、3根组、4根组和5根组与对照组和结扎前潜伏期比较,差异有统计学意义(P ＜0.05);SMEP的波幅变化与术后2d脊髓病理损害程度均呈正相关(r =0.939,P＜0.01).结论 公兔SMEP波对骶髓缺血性损伤敏感,波幅变化能够反映骶髓病理损害程度.
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微小RNA-32通过抑制Kruppel样因子4表达促进胃癌细胞的增殖与侵袭
目的 观察微小RNA(miRNA,miR)-32对胃癌细胞增殖及侵袭的影响,探讨其调控机制.方法 通过实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)测定miR组、lent-shmiR-32组和lent-vector组,采用Lipofectamine 2000和慢病毒分别转染miR-32 mimics、scramble、lent-shmiR-32和lent-vector,通过xCELLigence实时细胞分析系统测定4组细胞增殖能力,通过Transwell实验测定4组细胞的侵袭能力,通过Western blot测定Kruppel样因子4(KLF4)的表达.结果 FQ-PCR结果显示,miR-32的表达量在5种胃癌细胞株(AGS、KATO-Ⅲ、MGC8-03、NCI-N87、SGC-7901)中均显著高表达于胃正常组织细胞株GES-1,分别为0.18±0.03比12.40±1.40、0.18 ±0.03比35.80±2.10、0.18±0.03比27.10±3.60、0.18 ±0.03比6.20±1.60、0.18±0.03比8.50±3.50,P＜0.01;与scramble组比较,miR-32过表达组的细胞数在48、72 h培养后出现显著增加,48 h时,miR-32过表达组与scramble组相对细胞数为(160.3±5.4)％比(104.2±3.8)％,P＜0.01;72 h时,miR-32过表达组与scramble组相对细胞数为(310.2±5.4)％比(107.2±2.9)％,P＜0.01;miR-32过表达组侵袭细胞数显著多于scramble组,(327±18)个比(113 ±10)个,P＜0.01.与lent-vector组比较,lent-shmiR-32组的细胞数在48、72 h培养后出现显著减少,48 h时,lent-shmiR-32组与lent-vector组相对细胞数为(46.5±3.9)％比(102.3±2.9)％,P＜0.01;72 h时,lent-shmiR-32组与lent-vcctor组相对细胞数为(32.6±1.9)％比(104.2±3.7)％,P＜0.01;lent-shmiR-32组侵袭细胞数显著低于lent-vector组[(41±9)个比(99±13)个,P＜0.01].与lent-vector组比较,lent-shmiR-32组KLF4基因的mRNA水平显著上升(10.3±1.9比1.8 ±0.3,P＜ 0.01);Western blot显示,与lent-vector组比较,lent-shmiR-32组的MGC8-03细胞中,KLF4蛋白表达量显著升高(3.79±0.54比1.35±0.21,P＜0.01).miR-32过表达组KLF4的mRNA及蛋白表达水平均显著低于scramble组,分别为0.27±0.05比1.00±0.14,P＜0.01;1.16±0.13比3.26±0.65,P＜0.01.结论 miR-32通过下调KLF4基因表达而促进胃癌细胞增殖与侵袭.
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微小RNA-34b在胶质瘤组织的表达及其对人胶质瘤细胞株A172增殖、凋亡和侵袭力的影响
目的 观察微小RNA(miRRNA,miR)-34b在胶质瘤组织中表达及对人胶质瘤细胞株A172增殖、凋亡和侵袭力的影响.方法 选取择期行手术治疗的胶质瘤患者73例,同期留取行颅脑创伤颅内减压术患者正常脑组织标本30例作为对照组,培养人胶质瘤细胞株A172,根据转染物不同分为:miR-46b转染组、阴性对照组和空白对照组.利用实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)技术检测胶质瘤和对照组组织及不同转染组细胞中miR-34b表达,噻唑蓝(MTT)法检测各转染组细胞增殖能力,利用流式细胞技术检测各转染组细胞凋亡率,Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力.结果 胶质瘤组织巾miR-34b相对表达量为1.26±0.11,显著低于对照组的1.73±0.14,差异有统计学意义(t=19.527,P＜0.01);胶质瘤组织中miR-34b相对表达量与世界卫生组织(WHO)分级和Karnofsky功能状态评分明显相关(P＜0.05);miR-46b转染组细胞中miR-34b相对表达量为0.91±0.11,高于阴性对照组和空白对照组,分别为0.62±0.09和0.64±0.10,差异均有统计学意义(F=147.399,P＜0.01);与阴性对照组和空白对照组比较,miR46b转染组细胞增殖能力被显著抑制(P＜0.05);miR-46b转染组细胞凋亡率为(22.4±5.1)％,高于阴性对照组和空白对照组,分别为(10.6±3.2)％和(10.1±3.6)％,差异均有统计学意义(F=131.894,P＜0.01);miR-34b转染组细胞迁移细胞数和侵袭细胞数均少于阴性对照组和空白对照组,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 miR-34b在胶质瘤组织中呈低表达,上调miR-34b表达可加速胶质瘤细胞凋亡发生,抑制细胞增殖、迁移和侵袭能力.
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小剂量衣霉素诱导的内质网应激预处理对大鼠缺血再灌注心肌局部炎症的影响
目的 观察小剂量衣霉素诱导内质网应激预处理对缺血再灌注损伤(I/R)大鼠心肌局部炎症的影响.方法 40只成年雄性SD大鼠,随机分为假手术组(Sham组)、I/R组、单纯衣霉素处理组(TM组)及衣霉素+I/R组(TM+ I/R组),每组各10只.I/R组及TM+ I/R组通过结扎左冠状动脉前降支并再灌注的方法建立I/R模型,TM组及TM +I/R组模型建立前30 min腹腔注射衣霉素0.6 mg/kg,分别于开胸后和再灌注2h取颈动脉血,使用比色法检测血清肌酸激酶同工酶(CK-MB)及乳酸脱氢酶(LDH)活性.再灌注2h后处死大鼠摘取心脏,使用原位缺口末端标记法(TUNEL)法观察心肌细胞凋亡,Western blot法检测心肌半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶(Caspase)-12、核因子(NF)-κB p65蛋白的表达.结果 Sham组、TM组CK-MB、LDH活性再灌注2h时与开胸后比较变化差异无统计学意义(P＞0.05),I/R组及TM+ I/R组CK-MB、LDH活性均较开胸后上升,两组间比较,I/R组高于TM+ I/R组(P ＜0.05);Sham组、TM组、I/R组和TM+ I/R 组细胞凋亡指数依次为(2.4±0.3)％、(7.7±0.6)％、(29.4±3.1)％和(12.8±1.9)％.I/R组、TM+ I/R组与Sham组比较,细胞凋亡指数较高,差异有统计意义(P＜0.05),I/R组与TM+ I/R组比较更为显著(P＜0.05);再灌注2h后Sham组心肌组织Caspase-12、NF-κB p65蛋白呈低表达,I/R组、TM组和TM+ I/R组中均呈高表达,与Sham组比较差异有统计学意义(P＜0.05),其中TM组和TM+ I/R组均低于I/R组,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 小剂量衣霉素诱导内质网预处理可能通过减轻缺血再灌注心肌的内质网应激,降低NF-κB通路激活,减轻心肌局部炎症,从而产生一定的心肌保护效果.
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动脉粥样斑块内微小核糖核酸-199a抑制单核细胞炎性反应
目的 探讨动脉粥样硬化斑块中巨噬细胞高表达的微小RNA(miRNA,miR)-199a-3p对外周血单核细胞趋化及炎性因子表达的影响及其机制.方法 运用免疫组织荧光和原位杂交技术分析下肢动脉粥样硬化斑块表达及分布;收集并提取动脉粥样硬化患者外周血中外泌体,透射电镜观察其形态并确定所携带的miR-199a-3p水平;miR-199a-3p mimics转染刺激单核细胞,反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测并分析其受体极迟抗原(VLA-4)、淋巴细胞功能相关抗原(LFA)-1及炎性因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-6的表达.结果 斑块内巨噬细胞miR-199a-3p表达上调[阳性细胞比例:对照组(2.343 0±0.282 1)％,实验组(6.968 0±0.590 1)％,P＜0.01],并以外泌体形式分泌到外周血中,抑制单核细胞趋化因子受体和炎性因子表达.结论 动脉粥样斑块内的巨噬细胞通过miR-199a-3p外泌体抑制外周血中单核细胞趋化和炎性因子释放,减少巨噬细胞浸润和泡沫细胞的形成.
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白藜芦醇对瘢痕疙瘩成纤维细胞自噬的影响
目的 观察白藜芦醇(Res)对瘢痕疙瘩成纤维细胞自噬的影响,探讨Res抗瘢痕疙瘩增生机制.方法 取手术切除瘢痕疙瘩组织成纤维细胞原代培养,将瘢痕疙瘩成纤维细胞分为空白对照组和用含不同浓度(20、40、80、160 μmol/L)Res实验组,给药24、48 h后噻唑蓝(MTF)法检测细胞活性,实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)检测微管相关蛋白1轻链3(LC3)-Ⅱ及Beclin1mRNA表达,酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测不同浓度Res对瘢痕疙瘩成纤维细胞自噬相关蛋白LC3-Ⅱ及Beclin1合成的影响.结果 Res显著抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖,且存在一定的时间和浓度依赖性,随着浓度升高和时间延长,其抑制率由4.9％增至43.7％;Res作用后瘢痕疙瘩成纤维细胞自噬相关蛋白LC3-Ⅱ及Beclin1 mRNA相对表达量增加,分别从(1.367±0.141)升至(4.562±0.371)倍,(1.232±0.189)升至(3.603 ±0.297)倍.自噬相关蛋白LC3-Ⅱ及Beclin1的吸光度(A)值分别从0.211 ±0.017升至0.872±0.052,0.171±0.021升至0.544±0.028.结论 Res有效促进自噬相关蛋白LC3-Ⅱ及Beclin1 mRNA及蛋白表达,提高瘢痕疙瘩成纤维细胞自噬水平,抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖.
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神经肽基因转染干细胞联合骨移植治疗兔股骨头坏死的生物力学变化
目的 观察人降钙素基因相关肽α(hCGRPα)转染骨髓间充质干细胞(BMSCs)联合自体骨移植治疗模型兔股骨头坏死(ONFH)的生物力学变化.方法 采用液氮冷冻法成功制作出家兔股骨头坏死动物模型.将48只ONFH模型动物随机分为3组.hCGRPα基因转染BMSCs组(A组):将hCGRPα基因转染BMSCs联合自体骨移植于股骨头内.BMSCs组(B组):植入BMSCs(空质粒)联合自体骨移植.无关序列组(C组):植入干细胞为无关基因BMSCs并联合自体骨移植.于实验第3、6个月末分批处死兔,观察兔股骨头的生物力学变化.结果 治疗术后3个月时,A、B、C组巾手术治疗侧股骨头软骨下骨的大压缩强度与弹性模量分别为(29.13±1.95)与(59.61±2.18)、(24.63±1.35)与(48.87±2.15)、(25.05±1.34)与(50.13±2.28) mPa,股骨头松质骨的大压缩强度与弹性模量分别为(16.41±1.13)与(24.11±2.32)、(11.43±1.55)与(17.63±2.45)、(12.51±1.85)与(18.22±2.32) mPa,A组均高于B、C组(P＜0.05).A组的股骨头生物力学强度恢复好,与正常侧比较差异无统计学意义(P＞0.05),而B、C组与正常侧比较差异有统计学意义(P＜0.05).术后6个月时,B、C组与A组股骨头生物力学数据恢复水平趋于相同,组间差异无统计学意义(P＞0.05).结论 hCGRPα转染BMSCs联合自体骨移植治疗模型兔股骨头坏死,能够显著促进成骨和骨组织重建,有效恢复股骨头的正常生物力学性能.
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上调叉头框转录因子M1基因对人肿瘤细胞迁移侵袭及上皮-间充质转化的影响
目的 探讨上调叉头框转录因子M1(FoxM1)基因对人卵巢癌细胞迁移侵袭的影响及其分子机制.方法 构建FoxM1过表达慢病毒载体.HO-8910细胞分为3组,空白对照组、空载对照组和FoxM1慢病毒过表达组.转染HO-8910细胞后,采用Western blot方法观察FoxM1蛋白表达,采用划痕修复试验检测癌细胞迁移能力,采用Transwell方法检测癌细胞侵袭能力,采用Western blot法检测癌细胞E-钙黏蛋白和N-钙黏蛋白水平.结果 与空白对照组和空载对照组比较,FoxM1过表达组FoxM1蛋白明显升高.划痕修复试验结果显示,空白对照组、空载对照组和FoxM1过表达迁移细胞迁移距离分别为(156.80 ±2.26)、(161.60±1.81)和(278.60±2.62) μm.统计学分析发现,与空白对照组比较,P ＜0.01;Transwell侵袭试验显示,空白对照组、空载对照组和FoxM1过表达迁移细胞数分别为(68.56±1.69)、(67.27±1.36)和(126.38 ±1.56)个.统计学分析发现,与空白对照组比较,P＜0.01.Western blot结果显示,与空白对照组比较,FoxM1过表达细胞组E-钙黏蛋白表达降低,而N-钙黏蛋白表达增高.结论 FoxM1过表达可促进人卵巢癌细胞迁移和侵袭能力,其机制可能与促进上皮-间充质转化有关.
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干扰Yes相关蛋白1表达抑制U87MG胶质瘤细胞的迁移
目的 观察Hippo信号通路下游关键因子Yes相关蛋白1(YAP1)对胶质瘤细胞株U87MG细胞迁移的影响.方法 用YAP特异性小干扰RNA(siRNA)敲低U87MG胶质瘤细胞株YAP的表达,实时定量反转录聚合酶链反应(RT-qPCR)鉴定U87MG胶质瘤细胞中YAP1被敲低,通过Blank、NC、YAP1干扰组3组对比,通过细胞划痕实验验证YAP1在胶质瘤细胞迁移中的作用.结果 对照发现所选YAP1 siRNA寡核苷酸序列对YAP1干扰效果显著,干扰效率超过90％.利用siRNA干扰YAP1表达后胶质瘤细胞的迁移明显下降,定量分析显示YAP1干扰表达的U87MG细胞迁移率相对于对照细胞差异明显.结论 YAP1参于U87MG胶质瘤细胞的调控,干扰YAP1表达抑制U87MG胶质瘤细胞的迁移.
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胰岛素样生长因子-1受体对非小细胞肺癌A549和H292细胞紫杉醇耐药性影响
目的 观察胰岛素样生长因子-1受体(IGF-1R)对非小细胞肺癌(NSCLC)细胞A549和H292细胞紫杉醇耐药性影响.方法 噻唑蓝(MTT)法检测紫杉醇(PTX)对A549和H292细胞毒性作用及IGF-1R酪酸激酶抑制剂对A549和H292细胞耐药性影响,反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测A549和H292细胞中IGF-1 R mRNA的表达,Western blot检测IGF-1R蛋白的表达水平.结果 MTT实验表明NVP-ADW742和PTX联合处理A549细胞半数抑制剂量(IC50)值为7.83,显著低于单独用PTX处理细胞的IC50值12.37.NVP-ADW742和PTX联合处理H292细胞IC50值为4.89 μmol/L,显著低于单独用PTX处理H292细胞的IC50值20.06 μmol/L.紫杉醇药物联合IGF-1R抑制剂作用下,A549细胞和H292细胞对紫杉醇敏感性提升,紫杉醇的抑制增殖作用明显增强.结论 IGF-1R蛋白的抑制能明显增强紫杉醇对NSCLC细胞A549和H292的抑制增殖作用,表明IGR-1R是NSCLC患者治疗的重要靶点,化疗药物联合IGF-1R激酶抑制剂治疗NSCLC有一定的应用前景.
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人退变椎间盘内3种干细胞的生物学特性比较
目的 比较来源于同一人退变椎间盘内髓核干细胞(NPSCs)、纤维环干细胞(AFSCs)及软骨终板干细胞(CESCs)的生物学特性.方法 收集7例经X线、核磁共振成像(MRI)确诊为椎间盘突出症患者,将取出的椎间盘仔细分离并进行酶消化、滤网过滤后获得NPSCs、AFSCs及CESCs.培养至第3代时,采用细胞计数试剂盒(CCK-8)检测3种干细胞的生长活性,并进行成脂、成骨及成软骨诱导分化.诱导21d后分别应用油红O染色检测细胞成脂能力,茜素红染色检测细胞成骨能力,甲苯胺蓝染色检测细胞成软骨能力.提取第3代细胞总RNA,分别行反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测成脂、成骨及成软骨相关基因的表达情况.结果 来自于同一患者的NPSCs、AFSCs与CESCs形态上相似,差异无统计学意义(P＞0.05).生长曲线显示CESCs[第1、3、5、7、9、11、13、15天吸光度(A)值分别为0.35 ±0.01、0.52 ±0.02、0.64 ±0.08、0.80 ±0.19、0.79 ±0.20、1.06±0.11、1.37 ±0.09、1.31±0.41]与AFSCs(第1、3、5、7、9、11、13、15天A值分别为0.38±0.01、0.50±0.03、0.72 ±0.06、0.82 ±0.13、0.87±0.08、0.87±0.09、1.20 ±0.05、1.43±0.05)增殖能力要比NPSCs(第1、3、5、7、9、11、13、15天A值分别为0.32±0.02、0.42 ±0.04、0.59±0.01、0.64±0.17、0.65 ±0.19、0.68 ±0.21、0.67 ±0.12、0.59±0.12)活跃.油红O染色、茜素红染色及甲苯胺蓝染色分别证实3种干细胞均可向脂肪、骨及软骨三系诱导分化.RT-PCR检测结果显示AFSCs在成脂[过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ):6.85 ±0.32,脂蛋白脂肪酶(LPL):13.72±0.37]、及成软骨[Ⅱ型胶原(COL-2):10.45±1.10,性别决定因子相关基因-9(SOX-9):14.39±1.22]基因表达方面比NPSCs(PPARγ:6.63±0.50,LPL:8.41±0.42,COL-2:3.53±0.62,SOX-9:7.66 ±0.68)与CESCs(PPARγ:7.21±0.21,LPL:10.62±0.37;COL-2:8.26±0.49,SOX-9:13.70±1.10)略强;而成骨能力方面,CESCs强[Runt相关转录因子2(RUNX-2):7.30±1.1,COL-2:8.22±0.84],AFSCs(RUNX-2:6.20 ±0.92,COL-2:4.94±0.90)与NPSCs相当(RUNX-2:2.61 ±0.06,COL-2:7.05 ±0.82);NPSCs的成脂基因尤其LPL基因表达较低.结论 NPSCs、AFSCs及CESCs在体外培养中细胞形态相似,但生物学特性方面存在差异.体外诱导分化及RT-PCR检测结果均提示AFSCs比其他两种干细胞在椎间盘组织工程领域中更加具有优越性.
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CXC趋化因子配体12/CXC趋化因子受体4生物轴在吉西他滨影响胆管癌细胞上皮-间充质转化及侵袭转移能力中的作用
目的 探讨CXC趋化因子配体12(CXCL12)/CXC趋化因子受体4(CXCR4)生物轴在吉西他滨(GEM)对胆管癌细胞上皮-间充质转化(EMT)及侵袭转移影响中的作用机制.方法 利用基质细胞源性因子-1α(SDF-1α,100 ng/ml)激活高表达CXCR4的胆管癌细胞的CXCL12/CXCR4生物轴建立体外模型,将胆管癌RBE细胞随机分为正常对照组和吉西他滨组.应用噻唑蓝(MTT)的方法检测增殖率,应用Transwell小室观察细胞的侵袭转移.应用实时定量聚合酶链反应(Real-time PCR)和Western blot检测不同浓度GEM对CXCR4 mRNA及蛋白表达的影响,应用Western blot检测侵袭转移相关因子血管内皮生长因子-C(VEGF-C)、基质金属蛋白酶(MMP)-9,以及EMT相关N-钙黏蛋白(N-cadherin)、E-钙黏蛋白(E-cadherin)蛋白表达变化.结果 吉西他滨组细胞生存率分别为76.65％、71.40％、52.25％,生存率明显下降;吉西他滨组[(282.00 ±3.45)个/视野]细胞侵袭转移大于对照组[(168.00±2.49)个/视野];吉西他滨组CXCR4蛋白(0.965±0.163、1.895±0.191、3.975±0.120、3.355±0.163、3.572±0.198、6.154 ±0.113)及mRNA(1.021±0.210、2.442±0.556、2.774±0.146、2.961±0.275、3.279±0.228、5.010±0.826)随浓度提高表达上调;吉两他滨组与对照组比较,CXCR4、VEGF-C、MMP-9(1.565±0.148比1.014±0.156、3.250±0.212比1.025±0.318、1.980±0.212比1.025 ±0.318)表达上调,EMT相关N-cadherin蛋白(2.162±0.254比1.025±0.318)表达上调,E-cadherin蛋白(0.430±0.154比1.025±0.318)表达下调.结论 吉西他滨能够显著抑制胆管癌RBE细胞的生长,促进EMT的发生,促进侵袭转移,其机制可能是通过激活CXCL12/CXCR4轴及下游相关因子实现的.
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7次跨膜超蛋白家族成员4基因对乳腺癌细胞生物学行为的影响
目的 观察7次跨膜超蛋白家族成员4(TM7SF4)基因表达水平对乳腺癌细胞生物学行为的影响.方法 构建TM7SF4慢病毒表达载体,转染MCF-7人乳腺癌细胞株,下调TM7SF4基因的表达,运用Cellomics、流式细胞术、碘化丙锭-荧光活化细胞分类计(PI-FACS)法及克隆形成实验,研究TM7SF4基因对MCF-7细胞的增殖、凋亡、细胞周期及克隆形成能力的影响.结果 (1)对MCF-7细胞增殖能力的影响:MCF-7细胞连续培养5d后,实验组细胞数为:(239.1±37.7)、(508.4±52.8)、(282.2 ±84.0)、(308.0±167.1)、(131.6±82.6)个/孔;而空白细胞组细胞数为:(382.8 ±38.0)、(1 115.0±155.9)、(1426.2±192.4)、(2468.4±232.6)、(2903.0±165.7)个/孔,空质粒组细胞数为:(380.8±39.0)、(1 090.0±145.9)、(1 426.0±180.3)、(2379.0±228.6)、(2 855.0±156.6)个/孔,结果显示实验组细胞生长及细胞增殖倍数明显受到抑制,与空白对照组及空质粒组比较差异有统计学意义(P＜0.05);(2)对细胞周期的影响:实验组MCF-7细胞处于G0/G1期、S期、G2/M期的细胞数为(61.87±0.27)、(20.31±0.11)、(17.83±0.35)个/孔;而空白对照组处于G0/G1期、S期、G2/M期的细胞数为(57.46±1.40)、(30.42±0.36)、(12.83±0.55)个/孔;空质粒组处于G0/G1期、S期、G2/M期的细胞数为(57.78±1.23)、(30.11±0.47)、(13.30±0.79)个/孔.实验组与空白对照组、实验组与空质粒组比较差异有统计学意义(P＜0.05);(3)对细胞凋亡的影响:实验组散点图MCF-7细胞的凋亡率为(9.94±0.57)％,峰型图MCF-7细胞的凋亡率为(27.37±1.11)％;空白对照组散点图MCF-7细胞的凋亡率为(5.88±0.23)％,峰型图MCF-7细胞的凋亡率为(23.34 ±0.50)％;空质粒组散点图MCF-7细胞的凋亡率为(5.80±0.24)％,峰型图的凋亡率为(23.37±0.46)％,实验组与空白细胞对照组及实验组与空质粒组比较差异有统计学意义(P＜0.05);(4)对细胞克隆形成的影响:实验组形成细胞克隆集落数目为(11±3)个,空白细胞对照组为(34±2)个,空质粒组为(29±1)个.实验组与空白细胞组及空质粒组比较差异有统计学意义(P＜0.05).结论 TM7SF4基因具有促进MCF-7乳腺癌细胞增殖、克隆形成的能力,同时抑制细胞凋亡及细胞周期进展.TM7SF4基因通过影响乳腺癌细胞生物学行为发挥促癌发生发展的作用.
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肝细胞核因子4在肝癌细胞干细胞特性及上皮-间充质转化中的作用
目的 观察肝细胞核因子4(HNF4)在肝癌细胞SMMC7721中对干细胞特性及上皮-间充质转化的影响.方法 分别利用烟酸己可碱33342(Hoechst33342)染色及CD133流式细胞术分选肝癌细胞SMMC7721,通过Western blot检测侧群细胞及CD133+细胞中HNF4的表达水平,转染HNF4特异性siRNA沉默HNF4的表达,通过Western blot检测细胞中上皮-间充质转化相应标志蛋白的变化;后通过流式细胞术及体外细胞球体形成实验检测沉默HNF4对干细胞特性的影响.结果 Hoechst33342阴性的侧群细胞占细胞总数的比例为(8.77±0.59)％,而CD133+细胞占细胞总数比例为(4.19±-0.26)％,侧群细胞及CD133+细胞中HNF4的表达水平分别较Hoechst33342阳性及CD133-细胞明显降低,而沉默HNF4可促进细胞上皮性标志蛋白的下降,伴随间质性标志蛋白升高;沉默HNF4后可升高肝癌细胞中的侧群细胞比例(NC比si-HNF4=7.73±0.57比22.38±2.56)及CD133+细胞比例(NC比si-HNF4=4.67±0.56比17.31 ±1.77),同时促进SMMC7721细胞成球(NC比si-HNF4=1.67±0.62比5.33±1.52).结论 HNF4在维持肝癌细胞干细胞特性发挥重要作用,沉默其表达可促进肝癌细胞上皮-间充质转化,并增强肝癌细胞的干细胞特性.
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体外肿瘤神经周侵袭模型的建立
目的 肿瘤的神经周侵袭是肿瘤预后的重要影响因素,目前没有一个有效的模型来进行研究,本实验通过建立体外肿瘤-神经侵袭模型,为研究肿瘤细胞的神经周侵袭提供研究方法.方法 取小鼠的背根神经节种植于基质胶中,固定后,加入培养液,培养于细胞孵育箱中.观察背根神经节发出的神经突,检测培养液中神经突分泌的细胞因子;建立体外肿瘤-神经侵袭模型,观察肿瘤细胞神经周侵袭情况.结果 背根神经节种植于基质胶中后,3d后就可见到背根神经节发出神经突,10d神经突达到高峰,15 d左右神经突逐渐老化坏死;背根神经节培养液中通过Westernblot可检测出神经细胞释放的细胞因子,如胶质细胞源性神经营养因子受体α1(GFRα1);可以观察大量的嗜神经肿瘤细胞MiaPaCa-2沿着神经突方向侵袭,神经释放的某些细胞因子,如GFRα1对肿瘤细胞具有明显的嗜神经性.结论 体外肿瘤-神经侵袭模型是研究肿瘤细胞神经侵袭的良好模型.
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共刺激分子B7-H1在食管癌细胞株中的表达及生物学功能
目的 观察负性共刺激分子B7-H1在食管癌细胞株Eca-109中下调表达后对细胞生物学行为的影响.方法 选取B7-H1阳性的食管癌细胞株Eca-109,通过RNA干扰技术下调B7-H1分子的表达并使用流式细胞术和Western blot对其进行鉴定,采用细胞增殖实验、划痕实验和Transwell侵袭实验探讨B7-H1对食管癌细胞增殖、迁移及侵袭生物学行为的影响.结果 通过RNA干扰技术成功构建B7-H1下调表达的食管癌细胞株Eca109-B7-H1-小干扰RNA(siRNA)及对照组Eca109-NC.细胞计数试剂盒(CCK-8)检测细胞增殖实验结果显示在培养的6、7、8d,Eca109-B7-H1-siRNA细胞相对增殖水平(0.61 ±0.03、0.78 ±0.04、0.89 ±0.04)显著低于Eca109-NC组(0.80±0.01、1.00±0.04、1.07 ±0.09),差异有统计学意义(P＜0.01),Eca109-NC组细胞与Eca-109组细胞间差异无统计学意义(P＞0.05);划痕实验结果表明,划痕后24h,RNA干扰组细胞相对迁移距离(126.00±22.63) μm显著短于对照组(339.00±22.11) μm,差异有统计学意义(P＜0.05),且对照组与Eca-109细胞组间差异无统计学意义(P＞0.05);Transwell侵袭实验结果表明,细胞接种24 h后,干扰组的相对侵袭细胞数量[(20.60±4.61)个]显著少于对照组[(60.40±12.50)个],差异有统计学意义(P＜0.01).结论 B7-H1在食管癌细胞株Eca-109中的下调表达可显著抑制细胞增殖、迁移及侵袭能力,食管癌细胞异常表达B7-H1参与调节其肿瘤生物学行为.
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肢体骨折合并脑外伤神经元特异性烯醇化酶与骨痂生长的关系
目的 探讨脑外伤伴肢体骨折血清神经元特异性烯醇化酶(NSE)与骨痂生长的关系.方法 将50只SD大鼠随机分成3组:股骨骨折组(A组)20只、股骨骨折合并脑外伤组(B组)20只、正常对照组(C组)10只,模型制作后21 d检测3组大鼠血清中NSE浓度及股骨骨折部位骨痂密度和骨外膜平均厚度.结果 股骨骨折合并脑外伤组血清NSE浓度为(21.6 ±9.7) ng,/ml,较股骨骨折组的(9.2 ±2.5)ng/ml明显增高(P＜0.05),股骨骨折合并脑外伤组骨折部位骨痂密度(1.53)和骨外膜厚度(3.37 mm)均较股骨骨折组骨痂密度(1.00)和骨外膜厚度(1.47 mm)明显增加(P＜0.05).结论 脑外伤后血清中的NSE浓度明显增高,肢体骨折部位骨痂生长速度增快,NSE可能是脑外伤后骨折愈合加速的因素之一.
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透明质酸与兔滑膜间充质干细胞联合作用促进膝关节软骨损伤修复
目的 探讨透明质酸(HA)与兔滑膜间充质干细胞(SMSCs)联合作用对膝关节软骨损伤的修复作用及机制.方法 制备兔滑膜SMSCs细胞,构建兔膝关节软骨损伤模型,随机分为4组:对照组(向关节腔内注射0.5ml生理盐水);HA组(注射0.5 ml HA溶液);SMSCs组(注射0.5ml2×10 7个SMSCs细胞);HA+ SMSCs组(注射0.5 ml 2×10 7个SMSCs细胞的HA溶液).术后8周进行苏木素-伊红(HE)染色组织学观察及组织学评分;原位缺口末端标记法(TUNEL)检测细胞凋亡;酶联免疫吸附试验(ELISA)测定各组关节液中Ⅱ型胶原、黏多糖(GAG)、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的含量.结果 HE染色及组织学评分结果显示HA+ SMSCs组对软骨损伤修复效果优于单独HA组、单独SMSCs组,HA+ SMSCs组对软骨损伤修复组织学总评分[(23.20±3.20)分]显著高于单独HA组[(12.80±3.50)分]和单独SMSCs组[(15.00±3.30)分],且差异有统计学意义(P＜0.05);ELISA结果显示HA+ SMSCs组Ⅱ型胶原、GAG含量[(22.10±3.16)、(25.21±3.58) μg/L]显著高于单独HA组[(16.38±2.12)、(18.22±2.22) μg/L]和单独SMSCs组[(12.40±1.54)、(12.20±1.37) μg/L],且差异有统计学意义(P＜0.05);TUNEL染色和ELISA结果显示HA+ SMSCs组细胞凋亡数、IL-6和TNF-α含量[(15.34±4.76)、(213.75 ±51.80)、(41.57±5.63) ng/L]显著低于单独HA组[(65.85±8.45)、(532.55±87.36)、(59.38±8.24) ng/L]和单独SMSCs组[(52.72 ±7.24)、(498.53±91.35)、(57.20±5.72) ng/L],差异有统计学意义(P＜0.05).结论 HA和SMSCs两者联合作用能更佳促进软骨损伤修复,其机制可能通过抑制软骨细胞凋亡和炎性反应发挥作用.
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短发夹RNA靶向沉默胰岛素样生长因子结合蛋白-3基因对骨髓间充质干细胞增殖的影响
胰岛素样生长因子结合蛋白-3(IGFBP-3)通过限制胰岛素样生长因子-1(IGF-1)进入靶细胞而调节IGF-1的有效性.我们的前期实验已经证实IGF-1具有治疗勃起功能障碍(ED)的作用[1].基于前期研究结果,探索RNA干扰IGFBP-3基因对体外培养的骨髓间充质干细胞(BMSCs)增殖和分泌IGF-1含量的影响.
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微小RNA-34a靶向Snail基因调控膀胱癌T24细胞上皮-间充质转化
本研究旨在探讨微小RNA(miR)-34a是否通过靶向调控Snail基因的表达而影响T24细胞的上皮-间充质转化(EMT),现报道如下.一、材料与方法1.靶基因预测及报告基因实验验证miR-34a与其靶基因Snail的关系:通过miRDB软件在线分析预测出miR-34a特异性靶向基因,推测在膀胱癌中miR-34a可能调节的一个靶基因为Snail基因.按双荧光素酶报告基因检测试剂盒说明书进行荧光素酶实验.实验重复3次.
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依托咪酯持续输注对失血性休克犬肾上腺皮质功能的影响
我们建立失血性休克犬模型[1],评价持续输注依托咪酯对失血性休克犬肾上腺皮质功能的影响.一、材料与方法1.失血性休克犬模型的制备:雄性健康成年犬24条,10 ～12个月龄,体重(12.5±2.5)kg,由遵义医学院动物实验中心提供.实验前禁食10～12 h,于每日8:30时腹腔注射2.5％异戊巴比妥钠25 mg/kg基础麻醉,气管插管后行右股静脉、动脉穿刺置管,监测平均动脉压和中心静脉压;肝素钠3 mg/kg,制备失血性休克犬模型,平均动脉压(MAP)维持在40 ～ 50 mmHg(1 mmHg =0.133 kPa).
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长链非编码RNA-ENST00000452578在甲状腺乳头状癌中的表达及临床意义
本研究旨在探讨长链非编码RNA(lncRNA)ENST00000452578在甲状腺乳头状癌(PTC)中的表达差异,并分析其临床意义.一、资料与方法1.研究对象:选取2013年6月至2014年3月在我院手术的15例甲状腺组织标本(10例PTC,3例结节性甲状腺肿,2例甲状腺腺瘤)进行芯片检测,其中男3例,女12例,平均46岁.再选同期45例PTC组织与癌旁组织经实时定量反转录聚合酶链反应(RT-qPCR)验证,其中男6例,女39例,平均45岁.所有病例无甲状腺外其他肿瘤病史.
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小干扰铁调素对前列腺癌细胞表达变化的影响及意义
我们通过小干扰调控前列腺癌细胞Hepcidin,研究对细胞生物学的影响.一、材料与方法1.细胞培养、RNA的提取和反转录:前列腺癌细胞PC3、DU145和前列腺细胞P69在含有10％胎牛血清的RPMI 1640培养基中培养,收集5×106个细胞提取总RNA及反转录.2.实时定量聚合酶链反应(Real-time PCR)和Western blot:SYBR-Green法和二喹啉甲酸(BCA)法测定.
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沉默信息调节因子1在胰腺癌患者外周血中的表达及其临床意义
我们采用实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)技术检测沉默信息调节因子1(SIRTl)在胰腺癌患者外周血相对表达水平,分析SIRT1的表达水平与临床特征的关系.一、材料与方法1.一般资料:2014年3月至2015年6月53例经病理确诊为胰腺导管腺癌患者为实验组(男29例,女24例,中位年龄50岁),TNM分期为Ⅰ期10例、Ⅱ期11例、Ⅲ期17例及Ⅳ期15例.47例体检健康者为对照组(男25例,女22例,中位年龄49岁).两组年龄、性别差异无统计学意义(P＞0.05).
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微小RNA-146b-5p在恶性胶质瘤细胞中的表达及抑瘤效应的研究
微小RNA(miRNA,miR)是一类由17～ 27个核苷酸构成的RNA分子,在转录后水平调节基因表达[1].信号转导转录活化因子3(STAT3)在多种肿瘤中有促进细胞增殖、侵袭和抗凋亡作用,且有研究报道STAT3能抑制miR-146b-Sp表达[2],本研究旨在探讨miR-146b-5p对STAT3的作用.
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血浆脑钠肽原与心力衰竭住院患者静脉血栓栓塞的相关性
充血性心力衰竭(以下简称心衰)患者,易发生深静脉血栓,尽管目前指南推荐对高危患者应采用抗凝治疗,但由于出血并发症等顾虑,抗凝治疗在心衰患者中应用仍不普遍.对于心衰患者的治疗来说,如何预测深静脉血栓(VTE)是目前研究的方向之一,心衰患者VTE多种预测因子被报道,但对VTE形成和预后价值仍不清楚[1].脑钠肽原(NT-proBNP)和心衰的严重程度密切相关,但和VTE的关系如何,却不清楚,本研究旨在探讨心衰住院患者VTE发生率及和NT-proBNP的关系.
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磁共振显像检测荷人前列腺癌严重联合免疫缺陷小鼠移植瘤远处转移的研究
本研究旨在探讨应用磁共振显像(MRI)技术检测荷人前列腺癌重症联合免疫缺陷(SCID)小鼠移植瘤和远处转移的可行性.一、材料与方法1.造模方法:取5×107/ml的PC-3M细胞悬液0.1ml接种于15只小鼠右侧腋皮下,在3只小鼠同侧取等量磷酸盐缓冲液(PBS)进行接种,记录成瘤时间.
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三种介入手术治疗兔肝VX2肿瘤病理对比
我们分别采用肝动脉化疗栓塞(TACE)、射频消融(RFA)和微波消融(MWA)治疗兔VX2肝肿瘤,分析其组织学改变并提供病理依据.一、材料与方法将建模成功的18只荷瘤兔随机平分为3组:TACE组(A组)、RFA组(B组)和WMA组(C组).分别行肿瘤供血动脉注入碘油与阿霉素混悬液至门脉碘油沉积;射频参数功率为25 W,时间4 min[1];微波参数功率40W,时间120 s.术后7d观察其病理改变[2].
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色素上皮衍生因子、钙黏蛋白、波形蛋白在乳腺浸润性导管癌中的表达及临床意义
肿瘤细胞的浸润转移是肿瘤患者病死率较高的一个重要原因,上皮-间充质转化(EMT)和癌细胞脱离原发部位在浸润转移过程中起重要作用.色素上皮衍生因子(PEDF)是一个能有效抑制新生血管形成的蛋白,我们通过免疫组织化学方法分析PEDF、上皮细胞钙黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)的表达,探讨在乳腺癌中表达的相关性及意义.
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B7-H3在肾透明细胞癌中的表达及临床意义
B7-H3分子同时存在膜型及可溶型(sB7-H3)两种形式,目前国内外尚没有针对肾癌的血清sB7-H3资料.我们从临床收集病例,对肾癌患者的血清及肿瘤标本进行可溶型及膜型B7-H3检测,结合肿瘤的分期,观察其可能存在的临床价值.
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脊髓损伤后胃肠动力障碍大鼠诱导型一氧化氮合酶的改变
脊髓损伤(SCI)后存在胃肠动力障碍[1].一氧化氮(N0)为抑制消化道平滑肌的神经递质,诱导型一氧化氮合酶(iNOS)是NO合成的限速酶,其改变会导致胃肠动力障碍.一、材料与方法SD大鼠分为对照组和模型组,模型组采用重物坠落法建立脊髓损伤(SCI)模型.检测两组的胃内残留率和小肠推进比;链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶法检测胃肠组织iNOS蛋白的表达;反转录-聚合酶链反应检测胃窦和小肠组织iNOS mRNA的表达.
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术后静脉残端中肿瘤细胞残留的观察
我们制作兔胃肿瘤模型并观察肿瘤切除部位及周边组织中残端静脉的病理改变,现报道如下.一、材料与方法1.肿瘤模型制备:将胃癌肿瘤细胞悬液(取自邢台医学高等专科学校第二附属医院病理科,病理号20130836)注入荷兰兔(购自河北医科大学实验动物中心)胃黏膜下,饲养1个月后,剖腹探查有肿瘤生成定义为制模成功.
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不同时间炎性因子白细胞介素-1β、肿瘤坏死因子-α表达与脑出血患者神经细胞凋亡的关系
目的 探讨脑出血患者炎性因子表达与细胞凋亡的关系.方法 选取脑出血患者48例,登记临床资料并检测血肿周围脑组织白细胞介素(IL)-1β、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的不同时间段的表达.测定IL-1β、TNF-α表达:(1)反转录-聚合酶链反应(RT-PCR);(2)Western blot法;(3)免疫组织化学法.测定细胞凋亡:原位缺口末端标记法(TUNEL)法.结果 IL-1β、TNF-α的表达高峰期分别为0 ～24 h(0.819±0.109)、13 ～48 h(0.529 ±0.083),Western blot法及免疫组织化学法测定结果一致.TUNEL法测定神经细胞凋亡高峰期为13 ～48 h(68.3 ± 13.6),表明脑出血后神经细胞凋亡与TNF-α的表达高峰完全一致,与IL-1β表达高峰也有大部分重叠,均存在时间变化规律一致性.以凋亡细胞数为纵轴、IL-1β、TNF-α表达阳性细胞数为横轴分别制作散点图.胞质IL-1β阳性细胞数与凋亡细胞数相关系数R为0.376为中度正相关,胞质TNF-α阳性细胞数与凋亡细胞数相关系数R为0.954为高度正相关,均提示有明显正相关.结论 脑出血患者血肿周围脑组织IL-1β、TNF-α表达水平与神经细胞凋亡数一致.
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股骨小转子未固定的抗旋髓内钉治疗Evans-Jensen Ⅲ型转子间骨折的有限元分析
目的 通过有限元分析股骨小转子未固定的抗旋髓内钉(PFNA)治疗Evans-Jensen Ⅲ型转子间骨折的稳定性,并探讨其临床疗效.方法 分别建立小转子不固定及固定的Evans-Jensen Ⅲ型转子间骨折PFNA内固定的三维有限元模型,对比研究PFNA内固定下预设关键点的Von Mises应力变化,分析股骨转子间骨折块的生物力学稳定性.115例Evans-Jensen Ⅲ型转子间骨折接受不固定小转子的闭合复位PFNA内固定治疗,术后影像学分析患者的骨折及内固定情况,并跟据Harris评分标准进行患髋功能评价.结果 无论股骨小转子是否固定,PFNA固定时股骨侧大应力均位于内固定远端股骨内侧,而内固定大应力点位于螺旋刀片或联合钉与主钉交叉处内侧,但不固定小转子的应力峰值要小于固定小转子的应力峰值.115例获得平均32个月随访,影像学结果显示骨折平均3个月愈合,2例早期负重出现髋内翻畸形.按Harris功能评分:优91例、良15例,可7例、差2例.结论 PFNA内固定能有效维持小转子未固定的Evans-JensenⅢ型转子间骨折的稳定性,临床使用简单、安全且疗效满意.
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微小RNA-126-3p在不同免疫表型乳腺癌组织的表达及临床意义
目的 探讨在4种不同免疫表型的乳腺癌中微小RNA(miRNA,miR)-126-3p在组织的表达,并分析其临床意义.方法 应用实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)方法检测67例乳腺癌组织及其癌旁组织中miR-126-3p表达量,进一步应用组织芯片-原位杂交方法检测140例乳腺癌组织中miR-126-3p的表达量.结果 FQ-PCR显示miR-126-3p在癌组织中表达量低于癌旁组织,且在三阴性乳腺癌中表达量低,但是差异无统计学意义.组织芯片-原位杂交方法可见miR-126-3p主要在肿瘤组织基质中表达,高于良性纤维瘤(x2=21.48,P＜0.01).miR-126-3p在三阴性乳腺癌基质中表达量低(高表达率60％),人表皮生长因子受体-2(Her-2)过表达组中表达量高(高表达率91.3％),且两组差异有统计学意义(x2=6.26;P＜0.05).组织病理学证据也表明Her-2蛋白的表达量与miR-126-3p的表达呈正相关(x2=5.73,P＜0.05).结论 miR-126-3p在肿瘤基质中的表达量在不同免疫表型之间差异有统计学意义,能为乳腺癌的个体化诊断和治疗提供潜在靶点.
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诱导痰Runt相关基因3基因CpG岛甲基化在肺腺癌病情及预后评估中的价值
目的 探讨诱导痰Runt相关基因(Runx)3基因CpG岛甲基化在肺腺癌病情及预后评估中的价值.方法 选择肺腺癌患者(LAC组)和非肿瘤患者(CON组)为研究对象,采用甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)检测LAC组和CON组患者诱导痰Runx3基因CpG岛甲基化并比较其差异,比较LAC组肺腺癌患者不同临床病理特征中Runx3基因CpG岛甲基化的差异.比较LAC组患者诱导痰Runx3基因CpG岛甲基化与未甲基化患者R0切除率、无病生存期和3年生存率的差异.结果 LAC组肺腺癌患者诱导痰Runx3基因CpG岛甲基化率显著高于CON组非肿瘤患者(62.5％比2.5％,P＜0.05).LAC组肺腺癌患者在胸腔积液、分化程度、肿瘤大径、淋巴结转移、远处转移和cTNM分期中的差异有统计学意义(x2分别为5.861、4.417、5.273、4.110、10.240、10.559,均P＜0.05).LAC组肺腺癌患者中Runx3基因CpG岛甲基化者R0切除率(72.0％比93.3％)、无病生存期[(1.7±0.4)年比(2.4±0.6)年]和3年生存率(40.0％比66.7％)均显著低于Runx3基因CpG岛未甲基化患者(x2=4.083、=6.261;x2=4.320,P＜0.05).结论 肺腺癌患者诱导痰Runx3基因CpG岛甲基化与病情及预后相关.
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多孔胸管联合负压吸引在肺大疱切除手术中的应用
目的 探讨多孔胸管联合水封瓶负压吸引在肺大疱切除手术中的应用价值.方法 将122例实施胸腔镜肺大疱切除手术的患者随机分为两组,实验组(A组)65例,对照组(B组)57例;实验组术后采用水封瓶负压吸引的方式进行膨肺,而对照组采用传统的手控正压通气方式膨肺,比较两组患者术后肺不张、复张性肺水肿、非手术侧气胸的发生,以及两组患者的胸管拔除时间.结果 两组术后肺不张、复张性肺水肿、非手术侧气胸的发生比较差异无统计学意义(P＞0.05);对于拔管时间≤7 d者,A组58例,拔管时间(3.71 ±1.20)d,B组48例,拔管时间(4.58±1.27)d,两组比较差异有统计学意义(P＜0.O1);而对于拔管时间＞7d者,A组7例,B组9例,两组比较差异无统计学意义(P＞0.05).结论 与传统的手控正压膨肺比较,多孔胸管联合水封瓶负压吸引安全有效,有助于肺大疱切除术后患者早期肺膨胀,缩短术后拔管时间;但是该方法对于减少术后并发症、改善肺组织的长时间漏气并无益处.
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微小RNA-425在胃癌组织的表达及对胃癌细胞株BGC-823凋亡、自噬的影响
目的 观察微小RNA(miRNA,miR)-425在胃癌组织和细胞株的表达,并探讨miR-425对胃癌BGC823细胞凋亡、自噬的影响.方法 采用实时定量聚合酶链反应(Real-time PCR)检测60例胃癌组织和癌旁组织miR-425表达,分析其与临床病理参数的关系,并检测miR-425在7种胃癌细胞株(HGC-27、BGC-803、MKN-45、MGC-823、SGC-7901、NCL-N87、AGS)及正常胃黏膜细胞GES-1的表达.选取miR-425表达水平高的胃癌细胞瞬时转染miR-425 inhibitors.Real-time PCR检测miR-425 mRNA表达.流式细胞仪检测细胞周期、凋亡率及线粒体膜电位.Western blot检测凋亡、自噬相关蛋白表达.结果 胃癌组织miR-425相对表达水平为0.80 ±0.13,较癌旁组织(0.28±0.04)显著升高(P＜0.05),且其表达与TNM分期、细胞分化程度、肿瘤浸润深度及有无淋巴结转移密切相关(P＜0.05).BGC-803细胞中miR-425表达水平明显高于HGC-27、MKN-45、MGC-823、SGC-7901、NCL-N87、AGS及GES-1细胞(P＜0.05).与对照组和空白转染组比较,转染miR-425 inhibitors能够明显诱导BGC-803细胞凋亡并出现G1期阻滞,同时线粒体膜电位明显降低(P＜0.05);且B细胞淋巴瘤/白血病-2(bcl-2)、p62蛋白表达明显下调,B细胞淋巴瘤/白血病-2相关X蛋白(bax)、半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶(Caspase)-9、微管相关蛋白1轻链3(LC3)、Beclin1蛋白表达明显上调(P＜0.05).结论 miR-425在胃癌组织和细胞株呈过表达,下调miR-425表达能够通过线粒体途径诱导胃癌BGC-803细胞凋亡和自噬.
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富血小板血浆用于膝关节骨关节炎的临床研究
目的 探讨自体富血小板血浆(PRP)用于骨关节炎的临床疗效.方法 我院收治的确诊为双膝骨关节炎的患者58例作为研究对象,在所有患者的双膝关节腔中都注射PRP进行治疗,每周1次,每次注射5 ml,共注射3次.治疗后定期随访,通过国际通用吕斯霍尔姆(Lysholm)评分膝关节功能评价系统对患者治疗后的膝关节功能进行评分.结果 58例患者116个膝关节骨关节炎,其中在PRP注射第1次后,症状缓解者有5例10个关节,注射第2次后缓解者共25例50个关节,注射3次后缓解者共45例90个关节,3次注射完后6个月内有明显缓解的共55例110个膝关节,6个月后无明显效果者3例6个关节,本组的治疗有效率达94.8％.结论 膝关节腔内注射PRP的方法能有效治疗膝关节骨关节炎,并在短期内取得良好的效果,且对于年龄较小或者膝关节退变较轻者治疗效果更明显.
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微小RNA-196a-1在胃癌组织的表达及其临床意义
目的 探讨微小RNA(miRNA,miR)-196a-1在胃癌组织中的表达及其临床意义.方法 采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测miR-196a-1在胃癌组织和胃癌细胞株中的表达水平,并分析其与临床病理特征关系.结果 RT-PCR结果显示,riR-196a-1在胃癌组织标本的表达量较对照组增加4倍,差异有统计学意义(P＜0.05);相对于正常胃黏膜上皮细胞株GES-1,胃癌细胞株SGC-7901、AGS、MKN28中的miR-196a-1均高表达,相对表达量分别为:SGC-7901:4.24 ±0.15(P＜0.05),MKN28:3.17±0.11 (P ＜0.05),AGS:3.32±0.07(P＜0.05).胃癌组织miR-196a-1的高表达与患者的肿瘤TNM分期(P＜0.05)、淋巴结转移(P＜0.05)、组织分化程度(P＜0.05)有关,与患者的年龄、性别无关(P＞0.05).结论 miR-196a-1在胃癌组织和胃癌细胞中表达均上调,与胃癌的发生发展明显相关.
关键词： 微小RNA-196a-1 胃癌 -
长链非编码RNA牛磺酸上调基因1在人胃癌组织的表达及临床意义
目的 探讨长链非编码RNA牛磺酸上调基因1(TUG1)在人胃癌组织表达及临床意义.方法 收集人胃癌和配对正常胃黏膜组织,采用荧光实时定量聚合酶链反应(FQ-PCR)方法检测组织中TUG1表达水平,分析其表达与患者性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤直径、Lauren分型、组织分化程度、肿瘤浸润深度、淋巴结转移、远处转移、TNM分期、是否印戒细胞以及脉管内有无癌栓等临床病理因素的关系,并作统计学分析.结果 结果显示TUG1表达与患者性别、年龄、肿瘤位置、肿瘤直径、Lanren分型、组织分化程度、是否印戒细胞均无明显相关,但与肿瘤浸润深度(P＜0.01)、淋巴结转移(P＜0.05)、远处转移(P＜0.05)、TNM分期(P＜0.05)以及脉管内有无癌栓(P＜0.01)均显著相关.进一步研究结果显示,TUG1表达水平为影响胃癌患者预后的重要独立危险因素之一.结论 TUG1可能是胃癌基因诊断和治疗中重要靶点之一.
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“卷帘”法放置生物补片在腹腔镜疝修补术中的应用
目的 探讨“卷帘”法放置生物补片在经腹腹膜前疝修补术的可行性和优越性.方法 我科收治60例腹腔镜下经腹腹膜前疝修补术时使用生物补片患者,按照随机数字表法分为观察组及对照组,观察组为使用“卷帘”法放置生物补片,对照组为使用传统平铺法放置疝补片,对比分析两组患者的手术时间、平均住院费用、手术并发症发生率.结果 60例腹腔镜下经腹腹膜前疝修补术均成功完成,无中转开放手术.观察组和对照组总手术时间分别为(55.0±4.6)min和(70.0±7.8) min,两组差异有统计学意义(=2.48,P＜O.05).观察组和对照组的平均住院费用分别为(22 380 ±432)元和(24 340 ±624)元,两组差异有统计学意义(t=2.06,P＜O.05).观察组和对照组的并发症发生率为(3.33％,1/30)和(16.70％,5/30),两组差异有统计学意义(x2=5.93,P＜0.05).结论 在腹腔镜疝修补术中应用“卷帘”法放置生物补片,较传统放置法优势明显,术中、术后并发症较少.
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女性非小细胞肺癌患者外周血性激素水平与癌组织雌激素受体表达的关系
目的 观察女性非小细胞肺癌患者癌组织中雌激素受体(ER)表达与外周血性激素水平,探讨其相关性及其临床意义.方法 应用磁性微粒分离的免疫酶联分析检测94例绝经前和128例绝经后女性非小细胞肺癌患者外周血性激素雌二醇(E2)、卵泡生成激素(FSH)、黄体生成激素(LH)、孕酮(P)水平,术后免疫组织化学法检测肿瘤标本中雌激素受体α(ERα)和β(ERβ)表达,分析其相互关系.结果 绝经前94例女性非小细胞肺癌患者ERα无明显表达,ERβ表达阳性为36例,阳性率为38.29％;绝经后128例女性非小细胞肺癌患者ERα无明显表达,ERβ表达阳性为47例,阳性率为36.72％.绝经前女性非小细胞肺癌患者血清E2正常组79例患者中有54例ERβ无明显表达,25例等级表达;升高组15例患者中有4例ERβ无明显表达,11例等级表达.绝经前女性非小细胞肺癌患者血清E2正常组和升高组之间ERβ表达差异有统计学意义(P＜0.05);FSH、LH正常组和升高组之间ERβ表达差异无统计学意义.P正常组和降低组ER表达差异无统计学意义(P＞0.05);绝经后女性非小细胞肺癌患者血清P正常组中107例患者75例ERβ无明显表达,32例等级表达;降低组中21例患者6例ERβ无明显表达,15例等级表达.绝经后女性非小细胞肺癌患者血清P正常组和降低组ER表达差异有统计学意义(P＜0.05);血清E2、FSH、LH正常组和升高组ER表达差异无统计学意义(P＞0.05).结论 女性非小细胞肺癌患者外周血存在性激素代谢的紊乱和失衡,绝经前雌激素异常可能影响ER表达,绝经后孕激素异常可能影响ER表达.
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胃癌FOLFOX4方案化疗患者预后与血清可溶性E-钙黏蛋白表达的关系
目的 探讨血清可溶性E-钙黏蛋白(sEC)表达与胃癌患者行FOLFOX4方案化疗疗效及预后生存的关系.方法 42例患者采用FOLFOX4方案化疗3个周期,观察化疗疗效,进行生存随访.采用RNA干扰技术抑制胃癌SGC-7901细胞中E-cadherin表达.酶联免疫吸附试验(ELISA)测定胃癌患者化疗前、化疗第8周血清及细胞培养液上清中sEC表达水平.比较分析化疗前后血清sEC表达变化与临床病理参数、近期疗效、无进展生存时间(PFS)和生存时间(OS)的关系.计数资料采用x2检验,计量资料采用t检验,采用Kaplan-Meier法进行生存分析.结果 化疗前与化疗后第8周比较,血清sEC表达水平差异无统计学意义[(2.269±0.655) mg/ml比(2.231±0.638) mg/ml].化疗前后sEC表达变化与肿瘤分期、PFS和OS存在显著相关.有效组化疗后血清sEC表达水平较化疗前显著下降[(2.617±0.711) mg/ml比(1.949±0.458) mg/ml,P＜0.01,t=5.790],进展组表现为化疗后血清sEC表达水平较化疗前升高[(1.963±0.408) mg/ml比(2.612±0.779) mg/ml,P＜0.01,t=-3.665].胃癌患者化疗前血清sEC高表达水平与近期疗效、PFS和OS显著相关.E-cadherin表达干扰显著抑制了培养液上清中sEC的表达,5-氟尿嘧啶(5-Fu)可诱导其表达增加.结论 胃癌患者血清sEC可能是FOLFOX4方案化疗疗效及预后生存的独立预测因子.
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微小RNA-34a在肝癌组织的表达及其临床意义
目的 探讨微小RNA(miRNA,miR)-34a在肝癌组织中表达及其与临床病理特征的关系.方法 应用实时定量聚合酶链反应(Real-time PCR)技术检测59例肝癌及其癌旁组织中miR-34a的表达量,并分析miR-34a在不同组织中的表达差异及其与肝癌临床病理特征间的关系,探讨miR-34a在肝癌发生与进展中的重要作用.结果 肝癌组织中miR-34a的相对表达量(0.52±0.21)明显低于正常肝组织(5.57±1.48,P＜0.05),病理分级Ⅲ～Ⅳ级(0.32±0.12)和TNM分期Ⅲ～Ⅳ期(0.35±0.13)的肝癌患者组织中miR-34a的表达水平明显低于Ⅰ～Ⅱ级(0.69 ±0.22,0.72 ±0.19;P＜0.01).结论 miR-34a表达水平与肝癌发生发展及恶性程度密切相关.
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zeste基因增强子同源物2高表达与雌激素受体阳性乳腺癌不良预后相关
目的 观察表达不同水平组蛋白3第27位赖氨酸三甲基化(H3K27me3)、zeste基因增强子同源物2 (EZH2)和X染色体重复转录三十四肽(UTX)的乳腺癌是否有不同的生物学特性.方法 检测146例乳腺癌患者H3K27me3、EZH2和UTX的水平,探讨其对于乳腺癌预后判断的价值.结果 H3 K27 me3过表达见于人表皮生长因子受体-2(Her-2)阴性病例.EZH2过表达则见于淋巴结转移、肿瘤直径＞ 20 mm以及有更高肿瘤分期和肿瘤分级的患者.运用COX比例风险回归模型研究结果显示,低H3 K27 me3和高EZH2在全体病例[风险比(HR)=2.57,95％可信区间(95％CI):1.63 ～4.04,P＜0.01]以及ER阳性组(HR=2.78,95％ CI:1.52～ 5.09,P＜0.01)中均可作为独立预后因素.H3K27me3弱表达(HR=0.18,95％ CI:0.07 ～0.49,P＜0.01)和EZH2高表达(HR=3.34,95％ CI:1.20 ～9.27,P＜0.05)均与不良总生存期显著相关.UTX的表达与患者预后之间未见明显的联系,且H3 K27 me3的表达水平并不受EZH2/UTX的影响.结论 检测ER阳性患者巾,H3K27me3和EZH2的表达有助于判断乳腺癌的预后.
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核因子-κB、环氧合酶-2在结肠腺瘤性息肉及结肠癌组织的表达及其与血管生成的关系
目的 观察核因子-κB(NF-κB)、环氧合酶-2(Cox-2)在结肠腺瘤性息肉及结肠癌组织中的表达,探讨其与血管生成的关系.方法 采用免疫组织化学法检测NF-κBp65、Cox-2、CD34在35例结肠腺瘤性息肉、42例结肠癌及30例正常结肠黏膜组织中的表达,分析结肠癌组织中NF-κBp65与Cox-2表达的相关性及两者与微血管密度(MVD)、临床病理特征之间的关系.结果 NF-κBp65在正常结肠黏膜、结肠腺瘤性息肉、结肠癌组织中的阳性表达率分别为30.0％、57.1％、81.0％,呈依次升高趋势,其差异有统计学意义(P＜0.05);Cox-2在正常结肠黏膜、结肠腺瘤性息肉、结肠癌组织中的阳性表达率分别为23.3％、51.4％、73.8％,呈依次升高趋势,其差异有统计学意义(P＜0.05);NF-κB p65、Cox-2阳性表达率在年龄、性别、肿瘤大小、浸润深度、组织学分级等方面比较差异无统计学意义(P＞0.05),在淋巴结转移、肝转移及Dukes分期等方面比较差异有统计学意义(P＜0.05);结肠癌组织中NF-κBp65与Cox-2表达呈正相关(r=0.632,P＜ 0.05);NF-κBp65、Cox-2阳性表达结肠癌组织MVD(34.1±10.7、28.5±9.8)明显高于NF-κBp65、Cox-2阴性表达结肠癌组织(9.8±3.2、11.2±4.6,P＜0.05).结论 NF-κB、Cox-2在结肠癌组织异常增殖、侵袭周围正常组织及远处脏器转移等过程中发挥重要作用,且与新生血管形成密切相关.
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微小RNA在肾细胞癌治疗药物中的研究进展
微小RNA(miRNAs,miR)是一类在转录后水平调控基因表达的非编码单链RNA分子,对肾细胞癌(RCC)的发生、发展具有重要作用.新研究证实miRNAs与RCC对抗肿瘤药物治疗不敏感及耐药具有重要联系.本文就miRNAs在RCC治疗药物方面的相关文献进行综述.
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雄激素受体剪接变异体在前列腺癌去势抵抗转化中的研究进展
前列腺癌是男性常见的恶性肿瘤之一.大部分前列腺癌患者在雄激素剥夺治疗1～2年后逐渐发展为去势抵抗性前列腺癌,预后极差.去势抵抗性前列腺癌的发生机制目前仍不清楚.雄激素受体是前列腺癌发展过程中的关键因素,去势抵抗机制形成的可能之一就是雄激素受体剪接变异体在不依赖雄激素的情况下持续激活雄激素受体靶基因.现就雄激素受体剪接变异体在前列腺癌发生发展中的作用作一综述.
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Krüppel样因子17抑制肾癌786-0细胞迁移和侵袭及机制
目的 探讨Krüppel样因子17(KLF17)是否通过调控上皮-间充质转化(EMT)抑制786-0细胞的迁移侵袭能力.方法 设计并合成特异性小干扰RNA(siRNA)下调肾癌细胞株786-0中KLF17的表达,并利用划痕实验及Transwell实验检测其迁移侵袭能力的变化,通过Western blot检测EMT相关分子表达水平变化.结果 siRNA能有效下调肾癌786-0细胞株中KLF17的蛋白及mRNA的表达量.细胞划痕实验结果显示下调KLF17表达后,细胞迁移能力增强(P＜0.01);Transwell实验中阴性对照组穿膜细胞数为(18.16±2.21)个,而siRNA1组为(29.03 ±2.48)个(P＜0.01),siRNA2组为(28.93 ±3.00)个(P＜0.01).KLF17-siRNA介导的基因沉默下凋了上皮细胞表面标记E-钙黏蛋白(E-cadherin)、β-连环蛋白(β-catenin)的表达,上调了间充质干细胞表面标记N-钙黏蛋白(N-cadherin)的表达.结论 KLF17可通过调节EMT的进程影响肾癌细胞的迁移侵袭能力.
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雷帕霉素在小鼠肾脏缺血再灌注损伤中对自然杀伤T细胞的调控作用
目的 观察新型免疫抑制剂雷帕霉素在小鼠肾脏缺血再灌注损伤早期的保护作用及其对自然杀伤T(NKT)细胞募集过程的影响.方法 45只C57BL/6小鼠随机分为假手术(Sham)组、缺血再灌注损伤(IR)组和雷帕霉素给药(Rapa)组,后两组建立双侧肾脏缺血再灌注损伤模型,Rapa组给予雷帕霉素灌胃,术后1d采集标本,评价肾功能和肾组织病理学损伤,采用原位缺口末端标记法(TUNEL)测定肾实质细胞凋亡水平并采用流式细胞术检测NKT细胞在脾脏、肾脏及外周血的淋巴细胞中所占比例的变化,采用实时定量反转录聚合酶链反应(RT-qPCR)检测与NKT细胞迁移相关的趋化因子的表达水平.结果 Rapa组小鼠在肾脏缺血再灌注损伤的早期比较于IR组血清肌酐和尿素氮水平明显下降,病理损伤减轻,肾脏实质细胞凋亡减少.Rapa组的NKT细胞在脾脏总淋巴细胞中所占比例为(0.0764 ±0.007 8)％,较IR组[(0.1169 ±0.0060)％]显著下降(P＜0.05).而Rapa组小鼠的外周血中NKT细胞所占比例为(0.205 6±0.002 8)％,较IR组[(0.1320 ±0.001 2)％]显著上升(P＜0.05).Rapa组的肾脏总淋巴细胞中NKT细胞所占比例为(0.1169 ±0.0006)％,较IR组[(0.022 8 ±0.001 3)％]也显著上升(P＜0.05).Rapa组的肾脏组织中CXC趋化因子配体9(CXCL9)和CXC趋化因子配体10(CXCL10) mRNA表达水平分别0.74±0.04和0.72 ±0.01,其受体CXC趋化因子受体3(CXCR3)阳性的NKT细胞在肾脏总淋巴细胞中的比例为(1.561 0±0.062 8)％,较IR组均明显增加(P＜0.05).结论 雷帕霉素可以通过趋化因子CXCL9、CXCL10及其受体CXCR3向肾脏募集具有保护作用的NKT细胞发挥对小鼠肾脏缺血再灌注损伤的保护作用.
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量子点-前列腺干细胞抗原荧光探针对膀胱癌细胞的靶向成像研究
目的 制备量子点标记的抗人单克隆抗体前列腺干细胞抗原(PSCA)荧光探针(QDs-PSCA),观察其对膀胱癌细胞的特异性标记成像,分析活体内肿瘤非侵入性的靶向成像的可行性.方法 采用化学共价耦联的方法,制备氨基水溶性的硒化镉/硫化锌(CdSe/ZnS)发射波长为605 nm的量子点(QD605)-PSCA单抗荧光探针,测定探针的吸收光谱、发射光谱;采用直接免疫荧光法(一步法)检测QD605-PSCA荧光探针对膀胱癌EJ细胞的特异性标记能力,荧光显微镜下观察不同时间点探针对活细胞的标记情况.结果 QD605-PSCA荧光探针仍具有游离QD605的光学特性,该探针能够与膀胱癌细胞表面抗原PSCA特异性结合,活细胞标记特异性荧光主要表达在细胞膜,且荧光稳定,持续时间较长.结论 量子点标记的PSCA单抗荧光探针具有膀胱癌细胞特异性标记成像能力,且具有良好的光学稳定性.
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重组分泌型肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体腺病毒对前列腺癌细胞增殖的影响
目的 构建表达分泌型肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)基因的腺病毒载体,观察TRAIL基因对前列腺癌细胞株PC-3增殖的影响.方法 采用基因合成的方法获得含有分泌型信号肽的TRAIL基因,连接入GV315载体,在293A细胞中进行重组腺病毒的包装及扩增.以构建好的腺病毒载体感染体外培养的前列腺癌细胞株PC-3.采用间接免疫荧光法检测腺病毒感染后PC-3细胞中TRAIL表达的变化.Western blot检测半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶(Caspase)-3和Caspase-8表达的变化,通过平板克隆实验、细胞生长实验检测TRAIL对PC-3细胞增殖能力的影响.结果 成功构建重组分泌型腺病毒载体Ad-sTRAIL.PC-3细胞经Ad-sTRAIL感染后TRAIL蛋白表达水平明显增加,并且active-Caspase-3和active-Caspase-8的表达明显增加.平板克隆实验结果显示Ad-sTRAIL组克隆形成率[(30.60±2.10)％]明显低于Control组[(46.60±4.86)％,q=7.56,P＜0.01]及Ad-LacZ组[(45.90±3.56)％,q=7.19,P＜0.01].噻唑蓝(MTT)实验结果显示Ad-sTRAIL对PC-3细胞的抑制作用自48 h后(20.15％)差异有统计学意义(q=6.82,P＜0.01).结论 通过重组分泌型TRAIL腺病毒载体Ad-sTRAIL使PC-3细胞表达TRAIL基因,并可增加active-Caspase-3和active-Caspase-8的表达,从而抑制前列腺癌细胞的增殖.
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沉默DNA甲基转移酶上调N-myc下游调节基因1表达对前列腺癌DU145细胞生物学行为的影响
目的 观察小于扰RNA(siRNAs)沉默DNA甲基转移酶(DNMTs)上调N-myc下游调节基因1(NDRG1)表达对前列腺癌DU145细胞生物学行为的影响.方法 使用siRNAs分别抑制DU145细胞中DNMT1、DNMT3b及DNMT1+ DNMT3b的表达;使用Western blot、实时定量反转录聚合酶链反应(RT-qPCR)检测细胞中DNMT1、DNMT3b及NDRG1的表达改变;通过细胞计数试剂盒(CCK-8)、Muse凋亡检测仪、划痕实验和Transwell侵袭实验,检测细胞增殖、凋亡、迁移及侵袭能力的改变;筛选上述改变显著组DU145细胞,抑制细胞中NDRG1表达,再次检测上述细胞生物学行为.结果 Western blot及RT-qPCR结果显示,与对照组比较,DNMT1抑制组、DNMT3b抑制组及联合抑制组的NDRG1 mRNA(1.59±0.03,1.23±0.01,1.36±0.11比0.90±0.15,1.00±0.03)和蛋白(1.07 ±0.16,0.49 ±0.01,0.92±0.09比0.23 ±0.04,0.30±0.07)表达显著增加(P＜0.05).CCK-8结果显示,在24、48、72 h,DNMT1抑制组吸光度(A)值为0.189±0.030、0.266±0.048、0.419±0.058:DNMT3b抑制组为0.221±0.023、0.318 ±0.072、0.498±0.064;联合抑制组为0.199±0.021、0.284±0.062、0.488±0.091,与对照组比较,显著减少(P＜0.05).凋亡检测结果显示,DNMT1抑制组凋亡率为(22.40±1.36)％、DNMT3b抑制组为(14.20±0.80)％、联合抑制组为(17.60±0.74)％,与对照组比较,显著增加(P＜0.05).划痕实验结果显示,DNMT1抑制组划痕面积愈合率为(53.01±3.22)％、DNMT3b抑制组为(70.97±2.12)％、联合抑制组为(63.93±4.42)％,与对照组比较显著减少(P＜0.05).Transwell实验结果显示,DNMT1抑制组侵袭细胞数为(16±3)个、DNMT3b抑制组为(32±5)个、联合抑制组为(20±4)个,与对照组比较,显著减少(P＜0.05).其中,DNMT1抑制组效果显著(P＜0.05),联合抑制未见显著协同效应.与对照组比较,NDRG1-siRNA可显著逆转由DNMT1-siRNA引起的DU145细胞生物学行为改变(P＜0.05).结论 通过抑制DNMT1、DNMT3b在前列腺癌DU145细胞中的表达,可部分恢复NDRG1的表达,并可显著抑制肿瘤细胞增殖,促进细胞凋亡,减弱细胞迁移及侵袭能力,其中单独抑制DNMT1效果显著,联合抑制无明显协同效应,提示DNMT1可以成为前列腺癌去甲基化治疗的一个有效靶点.
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荧光原位杂交技术在上尿路和下尿路尿路上皮癌诊断应用中的对比
目的 比较荧光原位杂交技术(FISH)在上尿路和下尿路尿路上皮癌中的诊断效能.方法 疑为尿路上皮癌的患者共155例(包括上尿路占位56例,其中尿路上皮癌49例;下尿路占位99例,其中尿路上皮癌75例),进行FISH检测,进行敏感性、特异性等方面的比较.结果 FISH在上尿路和下尿路尿路上皮癌中的敏感性分别为87.8％和72.0％ (P＜0.05),特异性分别为85.7％和70.8％ (P ＞0.05),阳性预测值分别为97.7％和88.5％ (P＞0.05),阴性预测值分别为50.0％和44.7％ (P ＞0.05).结论 FISH在上尿路尿路上皮癌中的敏感性和阳性预测值高于下尿路尿路上皮癌,而特异性和阴性预测值相仿,与上尿路癌恶性程度较高,诊断时分期较晚有关.
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沉默高草酸尿大鼠肾脏骨桥蛋白基因的表达对草酸钙晶体在肾脏中沉积的影响
目的 观察骨桥蛋白(OPN)在草酸钙肾结石形成中的作用.方法 构建携带OPN-短发卡RNA(shRNA)并能有效沉默OPN基因的慢病毒载体,通过肾静脉导入大鼠肾脏,7d后开始喂饲含0.8％乙二醇和1％氯化铵的饮水,诱导肾脏草酸钙晶体沉积.喂饲9d后处死大鼠取出肾脏,比较体内沉默肾脏OPN基因表达后草酸钙晶体在肾组织中沉积数量的变化.结果 携带OPN-shRNA的慢病毒载体均能有效感染肾脏皮质和髓质,OPN-shRNA能显著抑制肾组织OPN基因的表达.OPN-shRNA组与空病毒载体组肾皮质草酸钙晶体(以每个观察视野结晶的平均总像素表示)分别为20716 ±7 755和54921 ±3469(P＜0.01),髓质分别为18 618±2 285和30 475±1 735(P＜0.01).结论 沉默高草酸尿大鼠肾组织OPN基因的表达可以显著减少草酸钙晶体在肾脏中的沉积,提示OPN在草酸钙肾结石形成过程中可能起一定的促进作用.
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微小RNA-29c在膀胱癌组织中的表达及对膀胱癌T24细胞的影响
目的 观察微小RNA(miRNA,miR)-29c在膀胱癌组织中的表达及对膀胱癌T24细胞增殖、凋亡、侵袭力的影响.方法 选择长春大学医院及吉林大学第一医院2013年1月至2015年12月23例膀胱组组织标本及相应的癌旁组织标本,反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)测定膀胱癌及癌旁组织中miRNA-29c的表达.miRNA-29c质粒转染膀胱癌T24细胞,RT-PCR测定转染T24细胞中miRNA-29c的表达量,噻唑蓝(MTT)检测细胞增殖,流式细胞仪测定细胞凋亡,Transwell检测细胞侵袭力.结果 膀胱癌组织中miRNA-29c相对表达量(0.41±0.17)明显低于癌旁组织(1.00 ±0.00) (P ＜0.05).A组的miRNA-29c相对表达量(354.36±13.54)明显高于B组(1.21±0.02)和C组(1.00 ±0.01) (P ＜0.05).A组细胞早期凋亡率(25.63±0.86)％和总凋亡率(26.21±0.25)％均明显高于B组[(8.01±0.15)％、(8.69±0.13)％]和C组[(6.52±0.12)％、(6.81±0.16)％,P＜0.05].A组细胞吸光度(A)值(0.589±0.302)明显低于B组(0.823±0.354)和C组(0.921±0.424,P＜0.05).A组细胞侵袭数(56.24±2.15)明显低于B组(92.31±2.76)和C组(113.24±12.17,P ＜0.05).T24 A组c-myc蛋白表达量(0.39±0.03)低于T24 B组(1.33±0.23)和C组(1.28±0.17,P＜0.05).结论 膀胱癌组织巾miRNA-29c的表达量下降,miRNA-29c能够促进膀胱癌细胞凋亡,抑制膀胱癌细胞增殖,降低膀胱癌细胞的侵袭力,miRNA-29c抑制膀胱癌细胞增殖可能和蛋白激酶B(Akt)通路有关.
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富含亮氨酸重复序列和免疫球蛋白样结构域基因1过表达对膀胱癌细胞免疫相关基因的影响
目的 利用基因表达谱芯片技术筛选过表达富含亮氨酸重复序列和免疫球蛋白样结构域基因1(LRIG1)的膀胱癌细胞与对照组膀胱癌细胞间差异表达的免疫相关基因,探讨LRIG1对膀胱癌细胞免疫功能影响的机制.方法 分别提取转染LRIG1基因的膀胱癌细胞BIU87-LRIG1和未转染LRIG1基因的膀胱癌细胞BIU87的总核糖核酸(RNA),反转录成cDNA并标记后,同22K人类基因表达谱芯片杂交后筛选出与免疫相关的差异表达基因,并进一步使用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)验证.结果 在21 522条基因中,两组细胞间差异表达的免疫相关基因有9条,其中BIU87-LRIG1细胞中上调基因4条,下调基因5条.RT-PCR提示BIU87-LRIG1组的程序化死亡基因5(PDCD5)表达水平(1.22±0.04)较BIU87组(0.43±0.06)明显增高.结论 使用基因芯片技术筛选出了LRIG1过表达可影响膀胱癌免疫功能的9种相关基因.
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膀胱肿瘤导向肽NYZL1的体内外分子动力学特征
目的 探讨膀胱肿瘤导向肽NYZL1的功能及体内外分子动力学特征.方法 采用竞争性抑制法检测其与细胞结合,噻唑蓝(MTT)法确定NYZL1的抗肿瘤功能;细胞免疫荧光技术、组织免疫荧光技术和活体荧光成像技术研究NYZL1-异硫氰酸荧光素(FITC)分子探针与肿瘤细胞结合的内化作用及探针在肿瘤微循环和全身器官的动态分布的动力学特征.结果 单纯加入不同浓度组NYZL1-FITC荧光值为416.00±13.20、966.85±20.20和1 751.45±16.40,先加入NYZL1再加入NYZL1-FITC荧光值为180.45±12.40、696.30±16.30、1 253.24±11.50,组间差异有统计学意义(P＜0.05);在25μmol/L和100 μmol/L浓度下NYZL1和NYZL1-FITC组的吸光度(A)值分别为0.613±0.055、0.646±0.061和0.647±0.063、0.664±0.070,计算各组相对抑制率均低于30％;探针进入细胞,5 min出现绿色荧光,10 ～20 min时细胞核显影,4h细胞内荧光强度强;静脉注射裸鼠后,探针一部分经肝胆循环和肾脏排泄,另外一部分经血液循环向肿瘤组织靶向浓聚,4～6h肿瘤组织浓聚达高峰,但探针在组织中的分布与肿瘤的血管分布密切相关,探针能够同时标记肿瘤血管和细胞.结论 NYZL1不具有抗肿瘤效应,能够携带荧光染料进行膀胱肿瘤的靶向光学分子成像.
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多不饱和脂肪酸对前列腺癌细胞的促凋亡作用
目的 观察深海鱼油(Fish oil)、n-3系多不饱和脂肪酸(PUFA)中的二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)、n-6系PUFA中的花生四烯酸(AA),对良性前列腺细胞和不同前列腺癌细胞的影响.方法 采用噻唑蓝(MTT)方法,检测Fish oil、EPA、DHA和AA对前列腺细胞和前列腺癌细胞生存率的影响;应用Western blot和实时定量反转录聚合酶链反应(RT-qPCR),检测半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶(Caspase)-3的基因表达水平.结果 与对照组比较,不同浓度Fish oil刺激PCS-440-010良性前列腺细胞24 h后,没有影响其生存率;不同浓度Fish oil刺激PC-3和DU145前列腺癌细胞24 h后,两种癌细胞生存率分别下降了27％和40％(P＜0.05);不同浓度Fish oil刺激LNCaP前列腺癌细胞24 h后,没有影响其生存率.分别给予n-3系PUFA中的EPA和DHA刺激24 h,均可以明显降低PC-3(分别下降13％和26％)和DU145(分别下降16％和30％)前列腺癌细胞的生存率(P＜0.05).给予不同浓度的AA刺激24 h,对DU145前列腺癌细胞的生存率无明显影响.给予DHA 50 μmol/L分别刺激DU145前列腺癌细胞12、24、48、72 h后发现,DU145细胞生存率与DHA刺激呈时间依赖性.Caspase-3的mRNA水平明显增高,呈浓度依赖性(P＜0.05).结论 DHA能够呈浓度、时间依赖性降低前列腺癌细胞的生存率,而对良性前列腺细胞无此影响.
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染色质免疫共沉淀技术在前列腺癌细胞株中的优化
目的 优化染色质免疫共沉淀技术(ChIP)的关键条件,以期提高实验效率.方法 拟以前列腺癌细胞株PC-3、DU145为实验材料,主要对裂解液体积、超声波的功率、脉冲及工作时间等方面进行调整,超声波破碎仪设置不同的条件(25％或30％功率,35 s或50 s间隔,3s或5 s工作时间),然后解交联富集这些DNA片段,测定其浓度及纯度值,分别行聚合酶链反应(PCR)并用2％琼脂糖凝胶电泳检测结果.结果 前列腺癌细胞株合适的ChIP实验条件为:(1)超声波大功率为30％,设定每38 s行3s或55 s行5s超声工作时间,总的时间45 ～75 s;(2)纯化后的DNA浓度＞10 ng/μl、纯度值(A260/ A280)＞1.45,可以得到比较好的实验结果.结论 在前列腺癌细胞株PC-3、DU145中,选定合适的超声波频率后,总的超声工作时间为60s时,便可得到合适的DNA片段;洗脱液体积固定后,分2次离心要比1次离心所得到的DNA纯度值高,所得到的实验结果也越明显.
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微小RNA-188-5p在前列腺癌中的表达及其对前列腺癌细胞增殖和转移的调控
目的 观察微小RNA(miRNA,miR)-188-5p在前列腺癌中的表达和对前列腺癌细胞增殖和转移的生物学影响.方法 采用实时定量反转录聚合酶链反应(RT-qPCR)技术检测miR-188-5p在前列腺癌组织和前列腺癌细胞中的表达.将miR-188-5p mimic利用Lipfectamine 2000转染至前列腺癌细胞,通过软琼脂细胞克隆形成实验、前列腺癌细胞侵袭和迁移实验研究前列腺癌细胞生物功能的改变.利用生物信息学软件miRanda预测miR-1886p的靶基因.采用双荧光素酶报告实验验证miR-188-5p对靶基因的直接调控.结果 miR-188-5p mRNA水平在前列腺癌组织中与前列腺癌旁组织和前列腺增生组织比较表达下调(0.996±0.024、0.990±0.094、0.385±0.031),差异有统计学意义(P＜0.05).miR-188-5p mRNA水平在LNCaP、DU145和PC-3细胞中较RWPE-1明显下降(1.022±0.012、0.409±0.034、0.358±0.024、0.255±0.018),且差异有统计学意义(P＜0.01).LNCaP和PC-3细胞中miR-188-5p mimic转染组细胞的体外克隆形成能力明显低于空白对照组(21±5、47±3;25±4、51±5),差异有统计学意义(P＜0.01).在细胞侵袭和迁移实验中,miR-188-5p mimic转染组PC-3和LNCaP细胞到达对侧的迁移细胞数明显低于空白对照组,差异有统计学意义(P＜0.05).利用生物信息学软件miRanda预测溶酶体相关4次跨膜蛋白质β(LAPTM4B)基因是miR-188-5p可能作用的靶基因.双荧光素酶报告实验确定miR-188-5p与LAPTM4B之间的直接调控关系.结论 miR-188-5p在前列腺癌组织和细胞中表达显著下调,过表达miR-188-5p可以抑制前列腺癌细胞的增殖和转移能力.miR-188-5p可能通过作用靶基因LAPTM4B参与调控前列腺癌的生长和转移.
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微小RNA-1236和外源性小分子双链RNA激活膀胱癌细胞p21表达作用的比较
目的 人工合成与微小RNA(miRNA,miR)-1236所作用的p21基因启动子靶序列完全互补配对的4对小分子双链RNA(dsRNA):dsP21-242、dsP21-243、dsP21-244和dsP21-245(dsP21-243序列配对程度高),分别观察其与miR-1236在激活人膀胱癌细胞株T24和EJ细胞中抑癌基因p21表达能力的差异.方法 参照小激活RNA(saRNA)的设计原则设计合成4对dsRNA.分别转染阴性对照组(dsControl)、阳性对照组(miR-1236)和实验组(dsRNA)至T24和EJ细胞,通过实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)、反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot分别检测p21 mRNA和蛋白表达的水平.结果 FQ-PCR检测结果显示实验组中仅dsP21-245能明显促进两种细胞中pZ1mRNA水平的升高;且与阴性对照组比较,dsP21-245分别上调T24和EJ细胞中p21 mRNA的表达至2.32倍(P＜0.01)和2.84倍(P＜0.01);与阳性对照组比较,两种细胞株中p21 mRNA的表达差异均没有统计学意义(P＞0.05).RT-PCR检测结果证实了p21 mRNA表达变化的趋势.Western blot结果显示在两种细胞株中p21蛋白表达水平的升高与p21 mRNA水平的上调一致.其余3对dsRNA均未能显著上调两种细胞株中p21基因的表达(P＞0.05).结论 人工合成的dsP21-245能显著促进膀胱癌细胞中p21的高表达,且与miR-1236激活p21表达的能力差异无统计学意义.
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缺氧诱导因子-1α和11-19赖氨酸富集白血病基因相关因子2在前列腺癌组织的表达及其临床意义
目的 检测前列腺癌及前列腺增生组织中癌基因缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)和抑癌基因11-19赖氨酸富集白血病基因相关因子2(EAF2)的表达,探讨两者与前列腺癌的临床病理特征的相关性.方法 应用免疫组织化学链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶(SP)法检测48例前列腺癌及30例前列腺增生组织HIF-1α和EAF2基因的表达,并对前列腺癌患者血清前列腺特异抗原(PSA)、Gleason评分、TNM分期及骨转移与生存时间等临床病理特征进行研究.结果 HIF-1α和EAF2在前列腺癌组织中阳性率分别为72.9％和39.6％,在前列腺增生组织中阳性率分别为43.3％和63.3％,差异有统计学意义(P＜0.05).EAF2表达与PSA水平:PSA≤20 ng/ml:68.8％(11/16),PSA＞ 20 ng/ml:25.0％ (8/32);Gleason评分:＜7分:50.0％ (8/16),=7分:64.7％ (11/17),＞7分:6.7％(1/15);TNM分期:Ⅰ～Ⅱ期:66.7％ (12/18),Ⅲ～Ⅳ期:23.3％ (7/30);骨转移:无:51.7％ (15/29),有:15.8％ (3/19)呈负相关(P＜0.05).HIF-1α表达则相反.两者表达均与年龄无明显相关.本组前列腺癌患者生存期的比较显示EAF2表达呈阳性的患者生存期明显高于EAF2呈阴性的患者(P＜0.05).结论 前列腺癌组织中癌基因HIF-1a表达增强,抑癌基因EAF2表达下调,其表达强度与肿瘤的生物学特征密切相关.
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前列腺癌动物模型中循环肿瘤细胞实时检测
目的 建立一种转移性前列腺癌原位动物模型及研究在体实时检测循环肿瘤细胞(CTC)的可行性.方法 将绿色荧光蛋白(GFP)的慢病毒载体LV-GFP,转染到人前列腺癌PC3细胞株;利用Puromycin筛选获得稳定转染的PC3-GFP细胞株.将20只雄性裸鼠随机分2组,应用1 ×106个PC3-GFP或普通PC3细胞裸鼠腋下注射获得皮下瘤.分离表达GFP的皮下肿瘤组织,将其切成1 mm3大小的组织块,并将组织块种植于10只雄性裸鼠前列腺包膜下;并于种植后5、10、15d分别检测CTC数目,分析CTC数目与时间的相关性.结果 成功建立PC3-GFP细胞株,该系生长曲线与未转染细胞一致;裸鼠皮下成瘤率为100％.PC3-GFP原位瘤模型接种10只小鼠,8只成瘤,在5d开始检测时,有6只出现CTCs,平均2.37 CTCs/h;10 d,8只小鼠均检测到CTCs,平均6.25 CTCs/h;15d,CTCs数目平均99.75 CTCs/h.结论 建立的转移性原位前列腺癌模型能模拟肿瘤转移的过程;在体实时检测CTC,可对肿瘤转移做到早期诊断,对肿瘤治疗效果进行实时监测和评估.
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长链非编码RNA在泌尿系肿瘤中的研究进展
基因组转录后的产物绝大部分为非编码RNA(ncRNA),编码蛋门质的信使RNA(mRNA)只占少数.长链非编码RNA(lncRNA)指ncRNA的长度超过200个核苷酸.研究证实一些lncRNAs在细胞巾的表达比蛋白编码基因有更高的特异性并与年龄相关.lncRNAs参与各种细胞过程,包括细胞生长相关的基因表达、分化、DNA复制、重组和修复以及细胞迁移等.在病理条件下,如癌症中许多lncRNAs表达异常.本文总结了lncRNA在一些泌尿系肿瘤,包括前列腺癌(PCa)、膀胱癌和肾癌的表达及意义.其中前列腺癌抗原3(PCA3)是早用于诊断PCa的lncRNA,也是早用来对患者尿液进行检测,诊断PCa是否存在的标志物.使用下一代测序技术,异常表达的lncRNA比较容易在血液或其他体液如尿液中检测.因此,我们预计在泌尿系统癌症,比如PCa、膀胱癌、肾癌的临床实际工作巾,lncRNA的检测,特别是从尿液中检测,会有更广阔的应用.
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脂肪性肝病实验研究中的几个热点与展望
脂肪性肝病是西方国家慢性肝病的主要因素,在我国患病率呈逐年上升趋势,已成为第二大肝病.迄今,脂肪肝的发病机制仍不明确,缺乏有效的治疗药物.本文就近年与脂肪肝相关性的肠道菌群、非编码RNA、免疫系统等研究进展进行总结,并对脂肪肝的发病机制、诊断与治疗等进行探讨.
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实验外科与原创性创新
在科学研究过程中,只有能改变世界的原创性工作更能得到大家的认可,但应承认只有极少数人能真正得到这样的的机遇.为了不断推进我国实验外科研究领域的进展,需要在以下几个方面努力:(1)原创性与跟踪性研究必须紧密结合在一起,从而在原始科技创新方面取得巨大进展;(2)提供一种开放、自由、良好的学术氛围,这样创新才能如百花齐放;(3)组建具有中国特色的实验外科智库和科学共同体;(4)在后现代医学阶段,我国实验外科要继承和发扬外科优良传统,从而为我国人民创造更好的健康医疗服务.
| 年 | 期数 |
| 2019 | 01 02 |
| 2018 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2017 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2016 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2015 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2014 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2013 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2012 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2011 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 |
| 2010 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2009 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2008 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2007 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2006 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2005 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2004 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2003 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2002 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2001 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2000 | 01 02 03 04 05 06 |
| 1999 | 01 02 03 04 05 06 |
| 1998 | 01 02 |
