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人软骨终板干细胞与退变髓核细胞体外非接触共培养的实验研究
目的:探究人软骨终板干细胞(cartilage endplate stem cells,CESCs)与退变髓核细胞(nucleus pulposus cells,NPCs)在Transwell非接触共培养条件下的相互作用.方法:对取自因腰椎退行性疾病行腰椎间盘切除椎弓根螺钉内固定患者的软骨终板、退变髓核进行CESCs及NPCs的分离培养及鉴定.通过琼脂糖悬浮培养法获得CESCs的克隆,扩增后行流式技术及免疫荧光对CESCs进行干细胞表面标记的检测,取第三代CESCs与第一代NPCs进行实验,建立三个细胞培养组:CESCs单独培养组、NPCs单独培养组、CESCs与NPCs共培养组(分别接种于Transwell底部和上层插槽中进行非接触共培养).在培养之后的不同时间点(3、5、7d),采用实时荧光定量PCR (Real-time PCR,RT-PCR)检测各组细胞中蛋白聚糖(Agg)、SOX-9及Ⅱ型胶原蛋白(CollⅡ)mRNA的表达变化情况,共培养7d后,采用Western-blot检测各组细胞中蛋白聚糖、Ⅱ型胶原蛋白、Sox-9蛋白的表达变化.结果:经过分离培养及鉴定,筛选出的细胞为CESCs(流式细胞计数分析,CESCs细胞表面的CD73、CD90、CD105阳性率分别为97.5％、98.7％、98.7％);共培养后,RT-PCR显示单独培养的CESCs在各检测时间点几乎无Agg、CollⅡ、SOX-9基因表达;而共培养组的CESCs在第5天开始出现Agg、CollⅡ、SOX-9基因表达(其表达量分别为0.10、0.11、0.15),与单独培养CESCs相比有统计学意义(P＜0.05);共培养组NPCs的Agg、CollⅡ及SOX-9基因表达量(其表达量分别为1.32、1.25、0.92)高于单独培养NPCs的表达量(P＜0.05),且随着时间延长逐渐升高,共培养与单独培养相比,差异有统计学意义(P＜0.05).共培养7d后,Westernblot结果与RT-PCR结果一致,共培养组CESCs的Agg、CollⅡ、SOX-9蛋白表达量高于单独培养组(P＜0.05).结论:CESCs与NPCs共培养时的相互作用能促使CESCs表达髓核细胞特异性标记物Agg、CollⅡ和SOX-9;通过相互作用,CESCs可增强NPCs表达自身特异性相关分子.
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缺氧和营养缺乏对软骨终板干细胞凋亡的影响及相关机制
目的:观察缺氧和营养缺乏对软骨终板干细胞(cartilage endplate-derived stem ceils,CESCs)凋亡的影响,探讨B细胞淋巴瘤/白血病-2/腺病毒E1B 19-kDa结合蛋白3(Bcl-2/adenovirus E1B 19-kDa-interactingprotein 3,BNIP3)信号通路在其中的作用.方法:从临床获取退变椎间盘软骨终板标本,分离培养软骨终板细胞,使用琼脂糖筛选获得CESCs并进行干细胞标志物鉴定,将第三代细胞分别在常氧/完全培养基(对照组)与缺氧和营养缺乏(实验组)条件下培养48h,通过流式细胞术检测细胞凋亡率,CCK-8法检测细胞活性,WesternBlot检测BNIP3、Bcl-2关联x蛋白(Bax)、Bcl-2关联k蛋白(Bak)和低氧诱导因子1α(HIF-1α)蛋白表达水平.使用BNIP3小干扰RNA(siRNA)干扰CESCs中BNIP3基因,同时设置阴性干扰对照组(Scramble siRNA),同前分组处理后再次检测细胞凋亡率、细胞活性及BNIP3、Bax、Bak蛋白的表达水平.结果:对5例标本获得的CESCs进行了干细胞标志物鉴定,其中细胞表面粘附分子44 (CD44)、CD73、CD90和CD105为阳性,CD34、CD45、CD11b、CD19和HLA-DR为阴性,提示CESCs具有干细胞特性.实验组细胞凋亡率为(29.12±0.65)％显著高于对照组的(14.87±2.03)％(P＜0.05);实验组的细胞增殖活性明显降低,为对照组的56.18％ (P＜0.05).与对照组相比,实验组BNIP3、Bax、Bak蛋白的表达均显著上调(P＜0.05).使用BNIP3 siRNA干扰后,缺氧和营养缺乏引起的细胞凋亡增加和细胞增殖活力下降均被明显抑制;同时,缺氧和营养缺乏导致CESCs中BNIP3、Bax和Bak的蛋白表达升高也被显著逆转(P＜0.05).结论:缺氧和营养缺乏能够诱导CESCs发生凋亡,此过程可能是通过上调BNIP3、Bax和Bak蛋白表达而发挥作用的.
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人退变椎间盘内3种干细胞的生物学特性比较
目的 比较来源于同一人退变椎间盘内髓核干细胞(NPSCs)、纤维环干细胞(AFSCs)及软骨终板干细胞(CESCs)的生物学特性.方法 收集7例经X线、核磁共振成像(MRI)确诊为椎间盘突出症患者,将取出的椎间盘仔细分离并进行酶消化、滤网过滤后获得NPSCs、AFSCs及CESCs.培养至第3代时,采用细胞计数试剂盒(CCK-8)检测3种干细胞的生长活性,并进行成脂、成骨及成软骨诱导分化.诱导21d后分别应用油红O染色检测细胞成脂能力,茜素红染色检测细胞成骨能力,甲苯胺蓝染色检测细胞成软骨能力.提取第3代细胞总RNA,分别行反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测成脂、成骨及成软骨相关基因的表达情况.结果 来自于同一患者的NPSCs、AFSCs与CESCs形态上相似,差异无统计学意义(P＞0.05).生长曲线显示CESCs[第1、3、5、7、9、11、13、15天吸光度(A)值分别为0.35 ±0.01、0.52 ±0.02、0.64 ±0.08、0.80 ±0.19、0.79 ±0.20、1.06±0.11、1.37 ±0.09、1.31±0.41]与AFSCs(第1、3、5、7、9、11、13、15天A值分别为0.38±0.01、0.50±0.03、0.72 ±0.06、0.82 ±0.13、0.87±0.08、0.87±0.09、1.20 ±0.05、1.43±0.05)增殖能力要比NPSCs(第1、3、5、7、9、11、13、15天A值分别为0.32±0.02、0.42 ±0.04、0.59±0.01、0.64±0.17、0.65 ±0.19、0.68 ±0.21、0.67 ±0.12、0.59±0.12)活跃.油红O染色、茜素红染色及甲苯胺蓝染色分别证实3种干细胞均可向脂肪、骨及软骨三系诱导分化.RT-PCR检测结果显示AFSCs在成脂[过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ):6.85 ±0.32,脂蛋白脂肪酶(LPL):13.72±0.37]、及成软骨[Ⅱ型胶原(COL-2):10.45±1.10,性别决定因子相关基因-9(SOX-9):14.39±1.22]基因表达方面比NPSCs(PPARγ:6.63±0.50,LPL:8.41±0.42,COL-2:3.53±0.62,SOX-9:7.66 ±0.68)与CESCs(PPARγ:7.21±0.21,LPL:10.62±0.37;COL-2:8.26±0.49,SOX-9:13.70±1.10)略强;而成骨能力方面,CESCs强[Runt相关转录因子2(RUNX-2):7.30±1.1,COL-2:8.22±0.84],AFSCs(RUNX-2:6.20 ±0.92,COL-2:4.94±0.90)与NPSCs相当(RUNX-2:2.61 ±0.06,COL-2:7.05 ±0.82);NPSCs的成脂基因尤其LPL基因表达较低.结论 NPSCs、AFSCs及CESCs在体外培养中细胞形态相似,但生物学特性方面存在差异.体外诱导分化及RT-PCR检测结果均提示AFSCs比其他两种干细胞在椎间盘组织工程领域中更加具有优越性.
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Fibronectin差别黏附法筛选、纯化软骨终板干细胞
目的 通过Fibronectin介导进行差别黏附筛选软骨终板干细胞,观察筛选的效果及其初步生物学性能.方法 从脊柱融合术中获取椎间盘软骨终板标本,机械-酶消化法获取原代软骨终板细胞,体外扩增至第2代后接种于Fibronectin包被过的培养瓶,孵育20 min后将未贴壁细胞及培养液转移至新培养瓶再孵育40 min,吸弃未贴壁细胞及培养液,所得2瓶细胞进行体外扩增,流式细胞仪检测细胞表面标志物.对筛选后的细胞进行向多系细胞诱导分化.结果 第2代细胞筛选前,细胞形态个体差异较大,呈三角形或多角形,融合时呈铺路石样外观,筛选后细胞形态比较均匀,形成细胞克隆群.流式细胞仪检测发现:经Fibronectin筛选后所获软骨终板干细胞CD90、CD73表达阳性率＞95％,CD105表达阳性率＞85％；经诱导能向骨、软骨及脂肪细胞方向分化.结论 Fibronectin筛选所得的软骨终板细胞基本符合国际细胞治疗协会对间充质干细胞的定义标准.Fibronectin差别黏附筛选法得够有效筛选、纯化软骨终板干细胞.
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应力调节人椎间盘软骨终板干细胞成骨分化的研究
目的 探讨周期性拉伸应力对人椎间盘软骨终板干细胞(cartilage endplate-derived stem cells,CESCs)成骨分化的影响.方法 利用琼脂糖悬浮培养系统从人退变椎间盘软骨终板中分离CESCs.取部分软骨终板组织用于免疫组织化学染色.采用Flexercell-4000TM应力加载系统对接种于培养板内的第3代CESCs分别施加1、6、12、24 h的拉伸刺激(实验组),拉伸率为10％,频率1 Hz;以同样条件接种于培养板不进行牵拉的静态培养细胞为对照组.加载完成后,Western blot检测CESCs中BMP-2蛋白的表达变化;实时荧光定量PCR检测Runx2、ALP及SOX9基因的表达变化.结果 免疫组织化学染色提示BMP-2蛋白表达于软骨细胞.Western blot检测示,10％的持续周期性拉伸应力可上调CESCs中BMP-2蛋白相对表达量,除1h外,实验组其余各拉伸时间点BMP-2蛋白相对表达量与对照组比较差异均有统计学意义(P＜0.05),并具有时间依赖性.实时荧光定量PCR检测示,周期性拉伸应力上调了Runx2和ALP mRNA表达,下调了SOX9 mRNA表达,实验组拉伸12、24 h的Runx2和ALPmRNA相对表达量及拉伸6、12、24 h的SOX9 mRNA相对表达量与对照组比较差异均有统计学意义(P＜0.05),并具有时间依赖性.结论 周期性拉伸应力作用于体外培养的CESCs,可通过调节部分成骨相关基因的表达诱导CESCs向成骨方向分化.
