中华实验外科杂志
Chinese Journal of Experimental Surgery 중화실험외과잡지
- 主管单位: 中国科学技术协会
- 主办单位: 中华医学会
- 影响因子: 0.75
- 审稿时间: 1-3个月
- 国际刊号: 1001-9030
- 国内刊号: 42-1213/R
- 论文标题 期刊级别 审稿状态
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敲低ABCB5基因对食管癌化疗敏感性的影响
目的 观察敲低ABCB5基因对食管癌化疗敏感性的影响.方法 构建ABCB5短发卡RNA(shRNA)慢病毒载体,包装空病毒和ABCB5 shRNA慢病毒,感染食管癌EC109细胞,筛选出空载细胞株(对照组)和ABCB5 shRNA细胞株(ABCB5 KD1组和ABCB5 KD2组).采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测两株敲低稳定细胞株基因沉默效果;采用Western blot法检测ABCB5蛋白表达;采用细胞计数试剂盒(CCK-8)法检测细胞的对化疗药物顺铂的敏感性;建立裸鼠食管癌模型,检测敲低ABCB5基因前后EC109细胞体内成瘤能力及顺铂对移植肿瘤的抑制作用.结果 与对照组比较,ABCB5 KD1组和ABCB5 KD2组食管癌细胞ABCB5 mRNA水平显著下调,差异有统计学意义(t=2.945,P=0.000;t=3.198,P=0.000).与对照组ABCB5蛋白水平比较,ABCB5 KD1组和ABCB5 KD2组食管癌细胞ABCB5 mRNA水平显著下调,差异有统计学意义(t=3.091,P=0.000;t=3.598,P=0.000).与对照组细胞比较,顺铂对食管癌细胞ABCB5敲低稳定细胞株具有较高的杀伤性,差异有统计学意义(F=3.124,P=0.010;F=3.593,P=0.009).ABCB5基因敲低食管癌细胞移植后肿瘤生长缓慢,且应用顺铂治疗后,对肿瘤的抑制作用更加显著.结论 敲低ABCB5基因能够特异性沉默ABCB5 mRNA和蛋白水平的表达,显著增强食管癌对顺铂的敏感性.
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微小RNA-194对肝癌细胞增殖和侵袭的影响
目的 检测微小RNA(miRNA,miR)-194在肝癌组织以及肝癌细胞株中的表达,探讨miR-194对肝癌细胞生物行为学的影响.方法 采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测miR-194在20例肝癌组织和20例癌旁组织以及肝癌细胞株HepG2和正常肝细胞株L02中的表达,建立miR-194过表达或低表达肝癌细胞株,采用细胞增殖实验、划痕实验、蛋白免疫印迹技术检测癌细胞的增殖、迁移能力改变及其相关机制.结果 miR-194在肝癌组织中的相对表达量显著高于癌旁组织,差异有统计学意义(0.364±0.040比0.198±0.028,t=3.176,P=0.003);在肝癌细胞株HepG2中的相对表达量也显著高于正常肝细胞株,差异有统计学意义(0.517±0.069比0.181±0.025,t =4.557,P=0.010);在肝癌细胞株HepG2中,高表达miR-194组细胞的增殖能力(1.857±0.170比1.019±0.019,t=7.065,P=0.000)和迁移能力(0.483±0.084比0.927±0.030,t=5.181,P=0.008)较对照组肝癌细胞显著增强,差异有统计学意义,而低表达组细胞的增殖能力(0.529±0.095比1.019±0.019)较对照组肝癌细胞显著降低(t=5.422,P=0.006).检测Wnt/β-连环蛋白(β-catenin)的表达改变,miR-194过表达细胞的Wnt蛋白的表达显著高于对照组(0.589±0.194比0.302±0.013,t =3.035,P=0.039);且β-catenin蛋白的表达亦显著高于对照组(0.941±0.101比0.220±0.115,=9.434,P=0.000),差异均有统计学意义,而miR-194低表达细胞的Wnt蛋白(0.310±0.028比0.260±0.026,t 1.308,P=0.261)和β-catenin蛋白(0.179±0.028比0.080±0.034,t=2.242,P=0.088)较对照组表达差异无统计学意义.结论 miR-194在肝癌组织中高表达,其可能与肝癌细胞的增殖和侵袭能力增加有关,miR-194的上述作用可能是通过上调Wnt/β-catenin信号通路实现.
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丹参素对大鼠肝缺血再灌注损伤的保护作用
目的 观察丹参素对大鼠肝缺血再灌注损伤的保护作用.方法 60只SD大鼠随机分成3组(每组20只):假手术(Sham)组、缺血再灌注(I/R)组、丹参预处理(Sal+I/R)组.解剖出肝脏中叶、左叶的门静脉、肝动脉以及胆管,应用小血管夹钳夹后造成肝脏左、中叶缺血,1h后恢复血流,构建缺血再灌注模型.假手术(Sham)组按同样步骤解剖,但不阻断血流.丹参预处理(Sal+I/R)组于缺血前60 min经尾静脉注射丹参素40 mg/kg.再灌注6h后,各组随机各取10只大鼠,经下腔静脉收集血液标本及留取肝组织标本.再灌注12h后同样方法处理剩余大鼠.测血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平.检测肝脏组织中谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)和超氧化物歧化酶(SOD)的水平.苏木素-伊红(HE)染色,光镜观察肝脏组织病理学的变化.结果 Sal+ I/R组血清中ALT、AST、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平[6 h:(350.47 ±69.65) U/L、(500.25±76.12) U/L、(165.32±23.46) ng/L、(65.31±9.52) ng/L;12 h:(250.47±36.78) U/L、(355.25±59.12) U/L、(130.65±34.31) ng/L、(103.38±18.46) ng/L]均低于I/R组[6 h:(550.34±82.31) U/L、(702.28±106.48) U/L、(300.13±49.28) ng/L、(95.55 ±29.21) ng/L;12 h:(490.34 ±89.68) U/L、(550.28±64.23) U/L、(260.00±60.08) ng/L、(180.32±38.12) ng/L,P=0.019];Sal+ I/R组肝脏组织中GPX和SOD的水平[6 h:(52.34±11.59)、(63.00±19.23) pg/ml;12 h:(68.32±21.45)、(81.00±17.65) pg/ml]高于I/R组[6 h:(30.12±5.12)、(43.00 ±7.45) pg/ml;12 h:(39.58 ±3.16)、(54.00±8.46) pg/ml,P=0.029];光镜下Sal+ I/R组肝脏组织损伤较I/R组轻.结论 丹参素可降低大鼠肝脏缺血再灌注损伤后血清IL-6、TNF-α的水平,提高肝组织中GPX和SOD的水平,减轻缺血再灌注后肝脏的损伤程度.
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白藜芦醇对肿瘤Hela细胞增殖和凋亡作用及影响
目的 观察白藜芦醇对宫颈癌Hela细胞增殖和凋亡作用及影响.方法 白藜芦醇4个药物浓度(0、50、100、200 μg/ml)处理肿瘤Hela细胞,噻唑蓝(MTT)实验检测白藜芦醇对宫颈癌Hela细胞24、48、72 h作用后的增殖和细胞毒性作用.Hoechst33258荧光染色观察细胞形态变化,免疫印迹技术检测B细胞淋巴瘤/白血病-2 (bcl-2)和bcl-2相关X蛋白(bax)表达改变.结果 白藜芦醇0、50、100、200 μg/ml 4个浓度处理对照组和实验组宫颈癌Hela细胞,24、48、72 h后细胞增殖率明显降低,增殖抑制率与药物浓度呈递增关系(P=0.031).24 h细胞增殖率分别为:0.99、0.87、0.78、0.60,48 h细胞增殖率分别为:0.99、0.84、0.67、0.48,72 h细胞增殖率分别为:0.99、0.83、0.66、0.47,各组比较差异有统计学意义(P =0.020).Hoechst33258染色显示肿瘤细胞数量明显减少,两组比较差异有统计学意义(P=0.011).随白藜芦醇药物作用于Hela细胞浓度的增加,Hela细胞bcl-2逐渐降低,bax逐渐升高(P=0.024).结论 不同浓度的白藜芦醇对宫颈癌细胞Hela细胞增殖抑制作用.白藜芦醇浓度增加,增殖率逐渐降低,具有浓度依赖性.
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鞘内注射牛肾上腺素髓质肽8-22对骨癌痛小鼠痛行为的影响
目的 观察鞘内注射Mas相关基因受体C(MrgC)高选择性激动剂牛肾上腺素髓质8-22 (BAM8-22)对骨癌痛小鼠痛行为的影响.方法 雄性C3H/HeJ小鼠50只,8~ 10周龄,体重18~22 g,随机分为5组(n=10):假手术Sham组(S组)、癌痛模型组BCP组:分为人工脑脊液对照组(B0组)和BAM8-22组(B1、B2、B3组).BCP组(B0 ~ B3组)小鼠右侧股骨远端骨髓腔接种含有2×105个NCTC 2472纤维肉瘤细胞的20μl α-MEM,建立骨癌痛模型;S组小鼠骨髓腔注入不含NCTC 2472细胞的20μl α-MEM.在接种肿瘤细胞后第14天S组和B0组鞘内注射5μl人工脑脊液,B1~B3组分别鞘内注射溶于人工脑脊液的BAM8-22 0.8 nmol/5μl、2.4 nmol/5μl、8.0 nmol/5μl,连续给药7d,1次/d.各组于首次给药前0.5h及每次给药后2h检测小鼠的自发抬足次数(NSF)、机械性缩足反射阈值(PWMT).结果 与S组[(1.80±0.20)次、(1.87±0.22)g]比较,BCP组接种后7~21 d时NSF[(14.67±2.65)次]显著增多(P=0.000),PWMT[(0.42±0.22)g]显著降低(P=0.002);与B0组[(12.38±1.12)次、(0.48±0.22)g]及14 d给药前[(12.65±1.10)次、(0.46 ±0.19)g]比较,给药后2h,B2[(7.28 ±0.82)次、(1.01±0.13)g]和B3组[(4.18±1.02)次、(1.38±0.12)g]NSF显著减少(P=0.012、0.011、0.001、0.001),PWMT显著增高(P=0.027、0.025、0.013、0.009),且B3组比B2组对痛行为学的改善更显著(P =0.007、0.031);B1组[(12.03±1.22)次、(0.51±0.16)g]给药后痛行为学无明显变化(P =0.096、0.074、0.527、0.474).结论 鞘内注射BAM8-22能够剂量依赖性改善骨癌痛小鼠的痛行为学反应.
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血管生成素-2经肌内皮缝隙连接调节血管低反应性
目的 观察肌内皮缝隙连接(MEGJ)对血管生成素-2(Ang2)调节缺氧大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)低反应性的介导作用,并明确参与的缝隙连接蛋白(Cx)亚型.方法 建立血管内皮细胞(VECs)和VSMCs双面共培养模型,检测异硫氰酸荧光素-牛血清白蛋白(FITC-BSA)透过率反映VSMCs收缩反应性,观察鬼笔环肽荧光反映MEGJ形成,观察磺酰罗丹明B细胞培养试剂染料转运反映MEGJ通讯功能.结果 (1)在双面共培养模型,缺氧4h后VECs和VSMCs中iNOS表达显著增高,且VSMCs中的显著强于VECs中(3.6倍,P=0.003),此增高的VSMCs中iNOS表达可被Ang2 siRNA抑制约60% (P =0.003).(2) MEGJ抑制剂18α-GA、Cx43 siRNA(50 nmol/L)和促血管生成素受体2(Tie2) siRNA(50 nmol/L)可降低外源性Ang2作用下缺氧VSMCs的iNOS表达(P值分别为0.001,0.001和0.001),改善VSMCs收缩反应性(P值分别为0.004,0.009和0.001).(3)Cx43 siRNA和Tie2 siRNA可抑制缺氧及Ang2处理后上调的MEGJ形成(P值分别为0.005和0.005),并抑制上调的MEGJ通讯增强(P值分别为0.003和0.004).结论 MEGJ介导Ang2对缺氧VSMCs低反应性的调节,Cx43是参与的蛋白亚型.
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Oct4B1基因过表达增强结直肠癌SW620细胞对奥沙利铂的耐药性及其机制
目的 探讨Oct4B1基因过表达是否增强结直肠癌SW620细胞对奥沙利铂耐药性及其机制,以及与诱导细胞上皮-间充质转化(EMT)过程的关系.方法 实验分组:将SW620细胞随机平均分为实验组及对照组、实验组(SW620-Oct4B1):转染带G418抗性的Oct4B1过表达质粒;对照组(SW620-NC):转染带G418抗性的阴性对照质粒;筛选合适浓度G418建立稳定转染细胞株.对稳定转染两组细胞作如下检测:(1)噻唑蓝(MTT)法检测细胞对不同浓度奥沙利铂的敏感性;(2)Western blot检测P-糖蛋白(P-gp)及EMT标志物E-钙黏蛋白(E-cadherin)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)的表达;(3)划痕实验检测12、24 h迁移能力;(4)Transwell小室检测24 h时侵袭能力.结果 实验组与对照组比较:(1)对奥沙利铂敏感性实验组明显低于对照组(t =8.889、5.427、9.678、4.459、5.362,P=0.001、0.006、0.001、0.011、0.006);(2)P-gp表达两组分别为0.401、0.439、0.419(0.420±0.020)及0.099、0.110、0.120(0.110 ±0.010),实验组明显高于对照组(t=24.723,P=0.000);(3)12 h伤痕愈合率分别为32.196%、32.382%、33.441% (32.670 ±0.670)%及23.049%、25.286%、23.674% (24.000±1.150)%,实验组明显高于对照组(f=11.245,P=0.001);24 h伤痕愈合率分别为67.048%、68.650%、66.291% (67.330±1.200)%和49.161%、47.632%、53.203%(50.000 ±2.880)%.实验组显著高于对照组(t=9.620,P=0.001);(4)24 h两组透膜细胞数分别为400.105、407.500、384.300(397.300±11.850)个及205.641、186.244、215.02(202.300±14.680)个,实验组显著多于对照组(t=17.905,P=0.000);(5)E-cadherin表达两组分别为0.186、0.190、0.223(0.200 ±0.020)及0.530、0.531、0.529(0.530 ±0.010),实验组明显低于对照组(t=28.143,P=0.000),而N-cadherin表达两组分别为0.949、0.935、0.906(0.930±0.020)及0.687、0.648、0.675(0.670±0.020),实验组显著高于对照组(t=15.181,P=0.000).结论 Oct4B1基因过表达能增强结直肠癌SW620细胞对奥沙利铂耐药性,其机制可能与诱导细胞EMT过程有关.
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人脂肪基质血管成分上清液修复急性肾缺血再灌注损伤
目的 观察人脂肪基质血管成分(SVF)上清液对急性肾缺血再灌注损伤(IRI)的影响.方法 分离制备SVF上清液(SVF-CM),建立肾小管上皮细胞(HK-2)低氧、复氧损伤模型,进行细胞增殖、凋亡检测.将32只SD大鼠随机分成4组,即SVF-CM组、SVF组、对照组及假手术组.术后24 h收集血液及肾组织标本,行血清肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)及苏木素-伊红(HE)、免疫组织化学检测.结果 SVF-CM与SVF均显著促进HK-2增殖、抑制HK-2凋亡,两组之间增殖(P=0.781)、凋亡(P =0.921、0.280)比较差异无统计学意义.术后24 h,SVF-CM、SVF组SCr和BUN水平显著低于对照组(P =0.000),但两组间比较差异无统计学意义(P=0.993、0.985).SVF-CM、SVF组肾小管损伤评分为(1.9±0.8)、(1.7±0.9)分,低于对照组[(3.3±0.7)分,P=0.000];增殖细胞核抗原(PCNA)阳性细胞数为(60.86±18.39)、(62.51±20.03)个,高于对照组[(33.61±6.91)个,P=0.000];凋亡细胞数为(24.73 ±6.82) 、(22.11 ±5.68)个,低于对照组[(45.12±7.85)个,P =0.000].但比较SVF-CM组和SVF组肾小管损伤评分、PCNA阳性细胞数以及凋亡细胞数,差异无统计学意义(P=0.114、0.875、0.197).结论 SVF上清液可促进大鼠肾IRI结构和功能恢复,且与SVF具有相同作用效果.
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猪原位肝移植围手术期管理
目的 总结猪原位肝移植围手术期管理经验.方法 项目组自2013年9月至2016年8月共使用巴马小型猪124只,实施各类原位肝移植术62例,其中标准原位肝移植30例,劈离式肝移植10例,心脏死亡捐献(DCD)供肝肝移植11例,经体外膜肺氧合(ECMO)修复后DCD供肝肝移植5例,经常温机械灌注(NMP)修复后DCD供肝肝移植6例.结果 124例供、受体手术中121例气管插管顺利,3例出现插管失败行气管切开术.62例不同术式肝移植,无肝期时间近似18 ~ 26 min,平均(22.3±2.6)min,未使用任何血管活性药物,通过快速的胶体输注,可以维持平均动脉压(MAP) ≥50 mmHg(1 mmHg =0.133 kPa).术中因出血死亡5例,均为劈离式肝移植.肝移植术后共死亡14例,其中标准原位肝移植3例,均为项目组早期建立动物模型阶段,1例死于腹腔出血,2例死于胆漏腹腔感染;DCD供肝肝移植11例,均死于模型本身造成的肝功能衰竭.术后5d存活率:标准原位肝移植90%,劈离式肝移植50%,DCD供肝肝移植0%,经ECMO修复后DCD供肝肝移植100%,经NMP修复后DCD供肝肝移植100%.结论 精细的围手术期管理是猪原位肝移植成功的保证,其中熟练掌握猪气管插管及气管切开术,精确的液体管理,动物模型的成熟建立,尽量缩短无肝期时间是围手术期管理的关键.
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尼古丁对白细胞介素-1β诱导的软骨细胞炎性反应及核因子-κB信号通路的影响
目的 观察尼古丁对白细胞介素-1β(IL-1β)诱导的软骨细胞炎性反应及核因子-κB(NF-κB)信号通路的影响.方法 通过Ⅱ型胶原酶消化分离大鼠原代软骨细胞,并利用噻唑蓝(MTF)法检测10-8、10-7、10-6、10-5 mol/L尼古丁对软骨细胞活力的影响.随后软骨细胞分为5组,分别为正常组(不含任何药物刺激),模型组(10 μmol/L IL-1β),尼古丁低、中、高剂量组(10-8、10-7、10-6 mol/L+ 10μmol/L IL-1β).MTT法检测各组细胞活力,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α),白细胞介素-γ(IFN-γ)及IL-6含量,Western blot检测各组细胞中诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、p-NF-κB p65及p-IκBα表达量.结果 与正常组比较,10-8、10-7、10-6 mol/L尼古丁(0.52 ±0.05、0.64±0.06、0.78±0.07)显著提高软骨细胞活力(P=0.032、0.004、0.000).与正常组比较,模型组中软骨细胞活力降低,TNF-α、IFN-γ及IL-6含量[(8.73±0.84)、(17.24±1.76)、(2.78 ±0.21) ng/L]提高(P =0.002、0.001、0.001),iNOS、p-NF-κB p65及p-IκBα表达量上调.与正常组比较,尼古丁低、中、高剂量组中细胞活力提高,TNF-α、IFN-γ及IL-6含量降低[低剂量组(6.61±0.14)、(15.36±1.33)、(2.29±0.19) ng/L,P=0.004、0.000、0.000;中剂量组(5.52±0.50)、(13.23±1.27)、(1.82±0.17) ng/L,P=0.007、0.000、0.000;高剂量组(3.93±0.40)、(10.45±1.04)、(1.54±0.15) ng/L,P=0.005、0.000、0.000],p-IκBα表达量下调,尼古丁中、高剂量组中iNOS及p-NF-κB p65表达量显著下调(中剂量组:0.38±0.04、0.40±0.04,P=0.008、0.000;高剂量组:0.31±0.30、0.30±0.05,P=0.000、0.000).结论 一定剂量尼古丁能通过抑制NF-κB信号通路来抑制IL-1β诱导的软骨细胞炎性反应.
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短发卡RNA介导的缺氧诱导因子-1α基因沉默对缺氧状态下骨肉瘤细胞增殖的影响
目的 观察缺氧环境对原代骨肉瘤细胞增殖的影响,以及用短发卡RNA (shRNA)沉默缺氧诱导因子(HIF)-1α基因后,缺氧状态下原代骨肉瘤细胞增殖的变化.方法 将原代骨肉瘤细胞分别置于缺氧环境(37℃、1% O2、5% CO2)或常氧环境(37℃、21%O2、5% CO2)下培养,采用噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞周期变化,Western blot检测HIF-1 α蛋白表达水平.其次,将HIF-1α基因及阴性对照基因(SCR)对应的shRNA由慢病毒载体介导转染原代骨肉瘤细胞,分别记为HIF-1 α/shRNA组和SCR/shRNA组,定量聚合酶链反应(qPCR)定量分析HIF-1αmRNA变化,Western blot检测转染后细胞HIF-1 α蛋白表达变化.后,转染后的细胞再次缺氧培养,采用MTT法检测细胞增殖.结果 细胞实验显示,缺氧环境可在一定时间(24 h)内抑制原代骨肉瘤细胞增殖,但随着缺氧时间延长抑制作用减弱,与常氧组比较,缺氧细胞12 h细胞增殖率减少30.5%,24 h减少25.0%.同时HIF-1α表达升高,表明肿瘤细胞增殖与HIF-1α之间明显相关.转染shRNA后,与空白对照组及SCR/shRNA组比较,HIF-1 α/shRNA组的HIF-1α mRNA相对表达量明显降低(P =0.000),HIF-1α蛋白表达下降(P=0.000),缺氧培养的细胞增殖受到抑制.结论 shRNA介导的HIF-1 α基因沉默可以有效逆转缺氧环境中HIF-1 α对骨肉瘤细胞增殖的促进作用,从而可能干预肿瘤发育和生长的进程.
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Notch信号通路通过调控Snail/E-钙黏蛋白参与肝细胞肝癌侵袭迁移的机制
目的 探讨Notch信号通路在肝癌(HCC)细胞侵袭迁移中的作用机制.方法 分别用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot检测肝癌细胞株HepG2和非肿瘤肝细胞株HL-7702中Snail和E-钙黏蛋白(E-cadherin)的mRNA和蛋白表达;Westem blot检测NICD蛋白的表达;200 pmol小干扰RNA(siRNA)-Snail和5μmol/L DAPT分别处理HepG2后,RT-PCR和Westem blot 检测Snail和E-cadherin的mRNA和蛋白表达;Transwell小室检测各处理组细胞的侵袭、迁移能力.结果 HepG2中Snail mRNA和蛋白的表达均高于非肿瘤肝细胞株HL-7702(0.11±0.06比0.08±0.02、0.46±0.06比0.21±0.04),差异有统计学意义(P =0.021、0.032),E-cadherin mRNA和蛋白的表达低于HL-7702(0.47±0.11比0.83±0.05、0.17 ±0.03比0.25±0.06),差异有统计学意义(P =0.012、0.004).与siRNA阴性对照组比较,siRNA-Snail组Snail mRNA(0.76±0.13比0.25±0.06,P=0.031)和蛋白(0.81±0.24比0.27 ±0.08,P=0.024)表达显著降低,E-cadherin mRNA(0.33±0.06比0.85±0.18,P=0.015)和蛋白(0.14 ±0.02比0.52 ±0.07,P=0.031)的表达显著上调,细胞侵袭(93.42±12.33比39.66±8.33,P=0.011)、迁移(375.66±65.21比98.52±12.76,P=0.008)能力均明显下降.HepG2中NICD蛋白的表达明显高于HL-7702(0.26±0.04比0.11±0.02),差异有统计学意义(P=0.004).与NT组比较,Notch信号通路特异性γ-分泌酶抑制剂(GSI)抑制剂DAPT能够降低NICD蛋白的表达(0.22±0.05,0.12 ±0.02,P=0.020),说明DAPT能够有效抑制Notch信号通路的活化.DAPT能有效抑制Snail mRNA(0.56±0.08比0.23±0.05,P=0.004)和蛋白(0.72 ±0.06比0.27±0.04,P=0.030)的表达,上调E-cadherin mRNA(0.21±0.03比0.54±0.06,P=0.011)和蛋白(0.32±0.07比0.77 ±0.08,P =0.021)的表达,同时能够抑制肝癌细胞的侵袭(87.33±9.33比32.21 ±6.63,P=0.008)、迁移(384.23±43.33比78.31±9.33,P=0.012).结论 Notch信号通路在肝癌侵袭迁移过程中起重要作用,其作用机制是通过调控Snail/E-cadherin来实现的.
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肝再生磷酸酶-1和肝再生磷酸酶-3在膀胱尿路上皮癌细胞株的表达
目的 观察肝再生磷酸酶(PRL)-1和PRL-3在膀胱尿路上皮癌细胞株中的表达及其在膀胱癌侵袭转移中的作用.方法 采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)及免疫细胞化学法检测PRL-1和PRL-3在BIU-87和T24细胞株种的表达,采用博伊登室(Boyden chamber)体外侵袭性实验计算BIU-87和T24细胞株穿膜情况.结果 BIU-87和T24细胞株中PRL-1 mRNA的相对表达量分别为0.772±0.037和0.304±0.033,差异有统计学意义(t=20.930,P=0.000);PRL-3 mRNA的相对表达量分别为0.828±0.039和0.298±0.038,差异有统计学意义(=21.494,P=0.000).PRL-1mRNA和PRL-3 mRNA在BIU-87和T24细胞株中的表达均呈正相关(r=0.941、0.997,P=0.017、0.000).BIU-87和T24细胞株中PRL-1蛋白相对表达量分别为7.000±1.870和4.400±1.140,差异有统计学意义(t=2.654,P=0.029);PRL-3蛋白分别为8.200±0.836和5.200±1.303,差异有统计学意义(t =4.330,P=0.003).PRL-1和PRL-3在BIU-87和T24细胞株中的蛋白表达均呈正相关(r=0.958、0.942,P=0.010、0.017).Boyden chamber体外侵袭实验显示,BIU-87细胞株穿越Matrigel膜的细胞数为(148.800±6.418)个,T24细胞株为(102.200±6.340)个,差异有统计学意义(t=11.549,P=0.000).结论 PRL-1和PRL-3膀胱尿路上皮癌细胞株中呈高表达,这可能在膀胱尿路上皮癌侵袭转移中起重要作用.
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无透镜显微镜联合细胞诊断芯片集成系统的构建
目的 建立并经鉴定可用来监测贴壁细胞生长和细胞染色过程的基于芯片组装而成的无透镜显微镜组件系统.方法 通过将样本放在一个厚1 μm Si3N4基层在一个5兆像素、CMOS成像元件平面和2.2μm像素尺寸的MEMS巢式芯片上.采用样品与成像元件平面间的距离的变化,使直径≥15 μm的细胞成像.这套组件被用以培养和监测胆管癌细胞TFK-1的生长形态(2 d),并监测细胞的色素染色.结果 TFK-1细胞在培养0、24、48 h后,经组件拍摄的TFK-1细胞生长及细胞染色过程图像无论是静止细胞,还是成三角状伸展的细胞边缘影像,与4×物镜放大倍数的显微镜成像质量相当.结论 这套手提式的、经济方便的无透镜成像组件很适合用以集成一套基于细胞研究的芯片实验室系统.
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突变型低氧诱导因子-1α修饰骨髓间充质干细胞来源的外泌体联合软骨再生支架治疗家兔早期软骨缺损
目的 探讨突变型低氧诱导因子-1α(HIF-1α)修饰的骨髓间充质干细胞(BMSCs)来源的外泌体(BMSC-Exo)对关节软骨损伤的修复作用.方法 BMSC和软骨细胞培养;超高速离心法提取突变型HIF-1 α修饰的BMSC分泌的外泌体(BMSC-Exomu)及正常BMSC分泌的外泌体(BMSC-Exonor);噻唑蓝(MTT)法检测软骨细胞活性;Western blot分析BMSC-Exos调节细胞凋亡过程中的作用.构建早期软骨缺损动物模型,并分为4组:单纯缺损组、支架植入治疗组、支架+BMSC-Exonor组、支架+BMSC-Exomu组.术后6周取材,通过大体观察、苏木素-伊红(HE)染色、蕃红O-快绿染色,比较各组软骨缺损的修复效果.结果 MTT法与Western blot结果显示,同对照组比较,BMSC-Exonor能对TNF-α介导的软骨细胞凋亡发挥作用,差异有统计学意义(P=0.006).而BMSC-Exomu效果更为显著(P=0.001).动物实验发现,与其他各组比较,支架+BMSC-Exomu组的软骨修复作用强、膝关节炎的症状较其他组均有明显好转,其损伤面透明软骨形成多,软骨基质分泌多.结论 在TNF-α诱导的软骨细胞凋亡中,与BMSC-Exonor比较,BMSC-Exomu对软骨细胞具有更强的保护作用.BMSC-Exo的应用对于家兔早期软骨缺损具有较好的辅助治疗效果.
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过表达细胞周期蛋白依赖性激酶2A基因抑制食管癌TE-13细胞增殖
目的 观察过表达细胞周期蛋白依赖性激酶2A(CDKN2A)基因对食管鳞癌细胞株TE-13增殖、迁移能力的影响.方法 采用脂质体转染法将已构建好的PcDNA3.1_CDNK2A及空载体质粒PcDNA3.1_neo分别转染人食管癌细胞TE-13,分为实验组(PcDNA3.1_CDNK2A_ TE-13),阴性对照组(PcDNA3.1_neo-TE-13)及空白对照组(只添加转染试剂).采用实时定量聚合酶链反应(Real-time PCR)检测转染前后CDKN2A mRNA表达水平;应用噻唑蓝(MTT)法检测转染后细胞的增殖能力;采用Transwell实验检测细胞的迁移能力.结果 实验组、阴性对照组及空白对照组CDNK2A mRNA相对表达水平分别为0.45 ±0.10、0.48±0.12及2.12±0.24,实验组显著高于阴性对照和空白对照组(F=200.500,P=0.000).实验组、阴性对照组及空白对照组吸光度值分别为0.71 ±0.08、1.05±0.09和0.97±0.08,差异有统计学意义(F=27.220,P=0.000).Tanswell结果显示实验组、阴性对照组及空白对照组穿过生物膜细胞分别为(156.8±23.1)、(166.9 ±28.4)和(162.1 ±30.3)个,差异无统计学意义(F=0.200,p=0.818).结论 CDKN2A基因表达能够显著抑制食管癌细胞的增殖,但对其迁移能力无明显影响.
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胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤基序岛区甲基化对微小RNA-129-2表达调控及肾癌细胞增殖和克隆形成的影响
目的 观察微小RNA(miRNA,miR)-129-2上游胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤基序(CpG)岛区甲基化对其在肾癌中的表达调控,并探讨对肾癌细胞增殖和克隆形成能力的影响.方法 应用甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)和亚硫酸盐处理测序法(BSP)检测miR-129-2上游CpG岛区的甲基化状态,探针法实时荧光定量反转录-聚合酶链反应(Taqman-RT-PCR)检测miR-129-2的表达,噻唑蓝(MTT)法、平板克隆形成实验分别检测去甲基化对肾癌细胞增殖和克隆形成能力的影响.结果 MSP显示在肾癌组织中miR-129-2是高甲基化状态,同时BSP结果显示经去甲基化试剂处理后的肾癌细胞株(786-O、ACHN、Caki-1和796-P)中miR-129-2的甲基化程度降低[(66.16±6.20)%比(85.63±6.27)%、(66.20±6.55)%比(86.74±4.42)%、(59.00±4.58)%比(76.85±9.40)%、(63.13±6.07)%比(80.32±8.39)%;t=3.824,4.498、2.956、2.874;P=0.019、0.011、0.042、0.045];表达水平显著升高,与对照组比较分别为(0.107 ±0.001比0.059±0.005、0.084±0.007比0.027±0.005、0.173±0.006比0.151±0.050、0.114±0.006比0.079±0.004);t =9.793、11.897、3.093、7.566;P =0.001、0.000、0.036、0.002);与各对照组比较,786-0、ACHN和769-P细胞株在去甲基化试剂处理后对细胞增殖能力(0.97±0.16比1.42±0.13、1.34±0.09比1.76±0.06、0.92±0.04比1.16±0.07;t=3.804、6.329、5.220;P=0.019、0.003、0.006)和克隆形成能力[(69±3)个比(102±6)个、(57±5)个比(78±6)个、(91±5)个比(112±6)个;f=8.498、4.571、5.157;P=0.001、0.010、0.007]两个方面均减弱.结论 miR-129-2的表达受DNA甲基化调控,且与肾癌细胞的增殖和克隆形成能力密切相关.
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CD147抑制剂衣霉素及激活剂血管紧张素Ⅱ对胆囊癌细胞的影响
目的 观察CD147抑制剂衣霉素及激活剂血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)对人胆囊癌GBC-SD细胞的增殖、侵袭、CD147和基质金属蛋白酶-9(MMP-9)表达的影响,探讨其对GBC-SD细胞的作用机制.方法 用不同浓度的衣霉素(5、10、20 μl/ml)、AngⅡ(5、10、20 μl/ml)及联合用药(衣霉素10 μl/ml+ AngⅡ20 μl/ml)干预GBC-SD细胞,应用细胞计数试剂盒(CCK-8)法观察其对细胞增殖的影响,Western blot法检测CD147及MMP-9表达,Transwell小室法检测细胞侵袭能力.结果 (1)衣霉素组与对照组比较:各实验组细胞增殖率与对照组细胞增殖率比较[(88.17±8.36)%比(100.00±0.00)%,P =0.005;(85.35±6.42)%比(100.00 ±0.00)%,P =0.003;(70.15±6.89)%比(100.00±0.00)%,P=0.000],逐渐降低,呈时间及浓度依赖性;CD147的K值与对照组比较(0.75±0.04比0.88±0.07,P=0.046;0.71 ±0.04比0.88 ±0.07,P=0.009)、MMP-9的K值与对照组比较(0.84 ±0.04比1.10 ±0.08,P=0.004;0.67±0.10比1.10±0.08,P=0.000)均降低,呈浓度依赖趋势;实验组与对照组比较(43.00±10.98比67.65±8.65,P=0.034;32.46±7.71比67.65 ±8.65,P=0.005)侵袭能力降低,与剂量呈反比趋势.(2) AngⅡ组与对照组比较:各实验组细胞增殖率与对照组细胞增殖率比较[(104.32±5.05)%比(100.00±0.00)%,P=0.056;(108.25±6.57)%比(100.00±0.00)%,P=0.019;(115.50±8.65)%比(100.00±0.00)%,P=0.003]逐渐升高,呈时间及浓度依赖性;CD147的K值与对照组比较(1.02 ±0.08比0.88±0.07,P=0.039;1.08±0.05比0.88 ±0.07,P=0.005)、MMP-9的K值与对照组比较(1.28±0.06比1.10 ±0.08,P=0.034;1.57±0.07比1.10 ±0.08,P=0.001)均升高,呈浓度依赖趋势;实验组与对照组比较(98.00±12.56比67.65±8.65,P=0.013),侵袭能力增加.(3)联合用药:在细胞侵袭、CD147表达、MMP-9表达方面与对照组比较,差异无统计学意义.结论 衣霉素可以抑制胆囊癌细胞增殖及侵袭、减少CD147 、MMP-9的表达,AngⅡ可以促进胆囊癌细胞增殖及侵袭、增加CD147、MMP-9的表达,联合用药可抵消其相互作用.
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双基因重组载体对乙醇作用下兔干细胞增殖与成骨活性的影响
目的 观察双基因重组载体对乙醇作用下兔干细胞增殖与成骨活性的影响.方法 取第3代兔骨髓间充质干细胞(BMSCs),随机分为6组:(1)正常组:正常培养BMSCs,无基因转染;(2)模型组:无基因转染BMSCs;(3)无关序列组:10μl无关序列载体转染BMSCs;(4)沉默过氧化物酶体增殖子活化受体γ (siPPARγ)组:10μl siPPARγ基因载体转染BMSCs;(5)表达降钙素基因相关肽(exCGRP)组:10μl CGRP基因载体转染BMSCs;(6)双基因组:10μl双基因重组载体转染BMSCs.除正常组外,其余各组细胞给予终质量浓度0.09 mol/L乙醇.采用噻唑蓝(MTT)法检测BMSCs增殖,第14天检测各组细胞内碱性磷酸酶活性、层粘连蛋白、Ⅰ型胶原、培养基中骨钙素含量,并作碱性磷酸酶(ALP)染色.结果 双基因组细胞增殖明显,增殖曲线接近于正常组.细胞中ALP活性、层粘连蛋白、Ⅰ型胶原、培养基中骨钙素含量:双基因组数值高,分别为(18.593±2.350) U/L、(24.422 ±3.110) ng/ml、(5.951 ±0.650) μg/L、(5.836 ±0.630) ng/ml,显著高于模型组[(6.528 ±0.830) U/L、(9.422±1.250) ng/ml、(1.733±0.230) μg/L、(2.016 ±0.240) ng/ml]、无关序列组[(7.011±0.850) U/L、(9.693±1.260) ng/ml、(1.663 ±0.220) μg/L、(1.913±0.230) ng/ml],明显高于siPPARγ组[(13.536 ±1.710) U/L、(17.103±2.230) ng/ml、(3.486±0.410) μg/L、(3.686±0.420) ng/ml]、exCGRP组[(13.692 ±1.760) U/L、(17.185 ±2.240) ng/ml、(3.525±0.420) μg/L、(3.833±0.430) ng/ml]、正常组[(15.056±1.910) U/L、(18.528±2.430) ng/ml、(4.035±0.460)μg/L、(4.012±0.460) ng/ml],差异均有统计学意义(均P=0.000).模型组、无关序列组数值显著低于正常组,差异均有统计学意义(均P=0.000).siPPARγ组、exCGRP组数值略低于正常组,差异均无统计学意义:ALP活性(P=0.222、0.274),层粘连蛋白(P =0.362、0.390),Ⅰ型胶原(P=0.082、0.105),骨钙素(P =0.276、0.543).双基因组数值显著高于正常组,差异有统计学意义:ALP活性(P=0.031),层粘连蛋白(P=0.010),Ⅰ型胶原、骨钙素(均P =0.001);且明显高于siPPARγ组、exCGRP组,差异均有统计学意义:ALP活性(P =0.005、0.006),层粘连蛋白(P=0.003、0.003),Ⅰ型胶原、骨钙素(均P=0.000).ALP染色显示:双基因组中大量细胞胞质染色为深蓝色,且较正常组多.结论 双基因重组载体可以保持乙醇作用下兔干细胞正常增殖,显著促进成骨活性,优于单一基因作用.
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可注射性生物活性玻璃/硫酸钙复合骨植入材料的细胞相容性
目的 探讨生物活性玻璃/硫酸钙(PSC/CS)骨水泥的细胞相容性.方法 通过复合PSC[10.8%五氧化二磷(P2O5)与54.2%二氧化硅(SiO2)、35%氧化钙(CaO)]与CS得到复合材料(PSC/CS),用噻唑蓝(MTT)法测定PSC/CS与硫酸钙骨水泥(CSC)浸提液对骨髓间充质干细胞(BMSCs)增殖的影响,并进行细胞毒性分级,同时检测PSC/CS和CSC BMSCs黏附的影响,比色法检测各组碱性磷酸酶(ALP)活性.结果 增殖结果显示,在第3天(PSC/CS组:0.328±0.002、CSC组:0.312±0.013)、第6天(PSC/CS组:0.708±0.017、CSC组:0.658±0.021)、第9天(PSC/CS组:1.123±0.124、CSC组:0.933±0.028),差异有统计学意义(P =0.103、0.075、0.061);细胞相对增殖率在第3天分别为98.34%和97.65%,第6天分别为98.27%和95.36%,第9天分别为97.24%和94.34%,细胞毒性分级均为Ⅰ级,细胞黏附率(P =0.047、0.034、0.032)及ALP活性测定结果(P=0.042、0.043、0.026)实验组明显高于对照组,差异有统计学意义.结论 含PSC的PSC/CS具有良好的细胞相容性.
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先天性马蹄内翻足诱导多能干细胞建立及鉴定
目的 以尿液脱落细胞为来源,构建先天性马蹄内翻足患者特异的诱导多能干细胞(iPSCs).方法 收集先天性马蹄内翻足患者尿液180 ml,通过离心,分离出尿液脱落细胞并进行培养,然后使用病毒系统对该细胞进行重编程,获得状态良好的细胞并进行鉴定,鉴定方法包括多能性基因检测、碱性磷酸酶(ALP)染色、核型鉴定、流式细胞仪(FACS)检测表面标志物、拟胚体(EB)悬浮球实验和甲基化检测等多种检测手段.结果 获得的细胞多能性基因表达与人胚胎干细胞H9相似,ALP染色呈强阳性,核型正常,多能性标记Tra-1-60阳性率为84.1%,能形成大量EB悬浮球,细胞在Nanog同源框(NANOG)和有机阳离子/肉毒碱运输蛋白4(Oct4)基因启动子区域的甲基化基本消失,证实获得的细胞具有多能性干细胞的所有特征,确定为iPSCs.结论 本实验成功构建了先天性马蹄内翻足患者特异iPSCs,为明晰先天性马蹄内翻足的演变特征提供了疾病模型.
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人脂质运载蛋白2基因调控骨髓间充质干细胞成骨分化和骨质疏松小鼠骨强度
目的 探讨人脂质运载蛋白2(Lipocalin-2,LCN2)基因在骨质疏松症中的作用及机制.方法 反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测并比较骨质疏松患者(n=18)及非骨质疏松患者(n=18)血液标本Lipocalin-2 mRNA表达量;下调小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs) Lipocalin-2基因,碱性磷酸酶(ALP)染色茜素红染色检测细胞成骨分化能力,Westem blot检测细胞成骨分化相关基因表达;建立骨质疏松小鼠模型,下调骨质疏松小鼠Lipocalin-2基因,micro-CT检测小鼠胫骨上段骨小梁体积,检测股骨抗弯的力学性能.结果 骨质疏松患者组(1.693±0.359) Lipocalin-2的mRNA相对表达量高于非骨质疏松患者组(1.108±0.234),P=0.019.而且在骨质疏松患者中,有骨质疏松性骨折病史患者的Lipocalin-2的mRNA相对表达量(n=10,2.172±0.624)高于无骨折病史的患者组(n=8,1.473±0.336).Lipocalin-2下调组小鼠BMSCs成骨分化基因Runt相关基因2(Runx2)、骨钙蛋白(OCN)的蛋白水平及mRNA相对表达量分别高于对照组.Lipocalin-2下调组[(812.78 ±25.36) N/mm]小鼠股骨抗弯强度高于对照组[(744.36±31.54) N/mm],LCN2-小干扰RNA(siRNA)组[(19.69±3.69) μm2]小鼠胫骨上段骨小梁面积大于对照组[(14.77±4.25)μm2].结论 骨质疏松患者血液Lipocalin-2表达上升,下调Lipocalin-2基因后干细胞成骨分化能力增强,下调Lipocalin-2基因能改善小鼠骨质疏松程度,其机制与Runx2及OCN相关.
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美托洛尔对脓毒症大鼠血清肌钙蛋白Ⅰ、肿瘤坏死因子-α及核因子-κB的影响
目的 观察美托洛尔对脓毒症大鼠血清肌钙蛋白Ⅰ(cTnⅠ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)及核凶子-κB(NF-κB)的影响.方法 选取雄性SD大鼠40只,根据数字表随机分组法分为美托洛尔组(n=10)、模型组(n=10)、假手术组(n=10)、正常对照组(n=10),除正常对照组不给予建立脓毒症模型处理外,其余3组均给予盲肠结扎穿孔术(CLP)建立脓毒症模型处理,假手术组开腹后不做任何处理,模型组制模后经尾静脉注射生理盐水,美托洛尔组于制模后2h经大鼠尾静脉以0.2 mg/(kg·h)速度给予冲击量0.05 mg的美托洛尔至CLP5 h.并分别于术后3、12、24h采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定4组大鼠血清cTnⅠ及TNF-α水平,采用免疫组织化学半定量法对NF-κB的变化情况进行观察,并取心肌组织制作病理切片观察各组大鼠心肌超微结构病理学的变化.结果 术后24 h,假手术组与正常对照组的cTnⅠ、TNF-α及NF-κB水平比较差异无统计学意义(P=0.058、0.124、0.063);美托洛尔组的cTnⅠ、TNF-α及NF-κB水平分别为(0.43 ±0.18) ng/ml、(18.29±2.13) pg/ml、(43.28 ±2.49) μg/ml,模型组为(0.68 ±0.14) ng/ml、(20.32 ±2.16) pg/ml、(51.37±2.61) μg/ml,与假手术组的(0.12 ±0.04) ng/ml、(5.54±1.17) pg/ml、(12.43±1.53) μg/ml,正常对照组的(0.10 ±0.01) ng/ml、(5.21±1.12) pg/ml、(11.38±1.65) μg/ml比较明显升高,但美托洛尔组cTnⅠ、TNF-α及NF-κB水平较模型组降低(P =0.042、0.056、0.003);且美托洛尔组中血清cTnⅠ与血清TNF-α呈正相关(r=0.895,P=0.000),血清cTnⅠ与血清NF-κB呈正相关(r=0.921,P=0.000);病理切片观察正常对照组与假手术组心肌超微结构未见明显异常,模型组心肌超微结构变化明显异常,而美托洛尔组心肌超微结构轻度变化.结论 美托洛尔作为一种β受体阻断药,对脓毒症大鼠具有减轻心肌损伤作用,其可能是由美托洛尔抑制大鼠血清中cTnⅠ、TNF-α及NF-κB的水平来实现的.
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表皮生长因子联合5-氟尿嘧啶对裸鼠胃癌移植瘤的作用
目的 观察表皮生长因子(EGF)联合5-氟尿嘧啶(5-Fu)对胃癌裸鼠移植瘤的疗效,探讨其作用机制.方法 建立裸鼠胃癌SGC7901细胞株移植瘤模型.分为对照组、EGF组、化疗组及EGF+化疗组.观察比较各组成瘤及肿瘤抑制率,检测各组细胞核增殖抗原(Ki-67)的表达及肿瘤干细胞标志物CD133阳性细胞比例.结果 EGF+化疗组肿瘤抑制率明显高于化疗组,肿瘤抑制率分别为70.9%与44.0%,EGF+化疗组与化疗组肿瘤Ki-67表达分别为(44.58±8.38)%和(35.25±4.67)%,EGF+化疗组处于增殖期的肿瘤细胞增加,EGF+化疗组肿瘤干细胞标志物阳性比例明显高于化疗组,分别为(7.34±0.92)%和(4.21±0.65)%.联合治疗组与对照组及化疗组比较差异均有统计学意义(P =0.000、0.039、0.011).结论 EGF可增强5-Fu对胃癌细胞的敏感性.机制可能与EGF诱导处于静止期肿瘤细胞增殖相关.
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Nutlin3和JQ1协同抗骨肉瘤的作用
目的 探讨Nutlin3和JQ1在骨肉瘤细胞中是否具有协同的抗骨肉瘤作用.方法 采用1.0μmol/L Nutlin3单药,0.5μmol/L JQ1单药以及两药联合处理骨肉瘤细胞,通过细胞计数试剂盒(CCK-8)细胞活性检测、协同效应分析、流式细胞仪检测凋亡和Western blot实验,检测Nutlin3 和JQ1两种药物的协同抗骨肉瘤效应,并探讨其分子机制.结果 CCK-8结果显示,在SJSA-1细胞株中,Nutlin3和JQ1单药均能够一定程度的抑制骨肉瘤细胞活性,半数抑制浓度(IC50)值分别为3.7 μmol/L和1.0 μmol/L;但两药联合处理后抗癌效果显著提高,IC50值减低至0.12 μmol/L;采用联合作用指数研究表明在携带有野生型p53的SJSA-1骨肉瘤细胞中CI值为0.18,在p53缺失的Saos-2骨肉瘤细胞中CI值为0.94,表明两个抗癌制剂具有高度协同作用,且这两种新型抗癌制剂的协同作用依赖于p53的活性.流式细胞仪检测凋亡发现1μmol/L Nutlin3和0.5μmol/L JQ1单药分别诱导15%和37%的细胞发生凋亡,两者联合能够诱导80%的细胞发生凋亡,显著高于单药的凋亡作用(P=0.000),表明两者联合能够诱导大量骨肉瘤细胞发生凋亡.Western blot结果显示Nutlin3和JQ1联合应用能够激发半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶(Caspase)-3高度活化,导致PARP绝大部分裂解,促进了凋亡信号的活化;同时也发现,Nutlin3和JQ1联合应用能够促进p53的表达升高.结论 新型抗癌制剂Nutlin3和JQ1具有明显的协同抗骨肉瘤作用,这种协同作用具有p53依赖性.
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载脂蛋白M增加24脱氢胆固醇还原酶的表达并可能通过其抑制炎性反应
本研究旨在观察载脂蛋白M(ApoM)在炎性反应中的作用.一、方法取野生型ApoM(ApoM+/+)及敲除型ApoM(ApoM-/-)小鼠腹腔注射生理盐水或脂多糖(LPS)处理1h,提取肝脏总RNA;采用磷酸盐缓冲液(PBS)或肿瘤坏死因子-α(TNF-α)处理ApoM过表达的EA.hy926细胞3h,提取总RNA,检测其24-脱氢胆固醇还原酶(DHCR24)及白细胞介素-1β(IL-1β)表达.数据用t检验及双因素方差分析,以P<0.05为差异有统计学意义.
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微小RNA-136-5p对甲状腺癌TPC-1细胞迁移与侵袭能力的影响
本研究旨在探讨微小RNA(miRNA,miR)-136-5p对甲状腺癌TPC-1细胞迁移与侵袭能力的影响及其机制.一、材料与方法1.慢病毒过表达载体的转染:在GV369慢病毒载体基础上构建LV-hsa-miR-136重组载体,进一步行慢病毒的包装及浓缩,获得病毒颗粒.实验分为3组:空白对照组、阴性对照组及实验组.胰酶消化TPC-1细胞,接种于培养板中培养24 h,加入5μl含聚凝胺的病毒稀释液进行感染.
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高压氧预处理减轻大鼠脑梗死后出血性转化
我们通过建立大鼠脑梗死后脑梗死后的出血性转化(HT)模型,观察高压氧预处理(HBOP)对大鼠脑梗死后出血性转化的影响.一、材料与方法1.材料:雄性Spradgue-Dawley大鼠共96只,体重280 ~330 g.1%戊巴比妥钠,磷酸盐缓冲液(PBS),甲酰胺溶液,50%葡萄糖注射液,显微实验动物器械,动物实验用高压氧舱,小动物立体定向仪,微量注射器,动物实验用恒温系统,微量注射泵,超声乳化器,分光光度计.
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骨形态发生蛋白-12诱导间充质干细胞向腱细胞分化及其机制
切口疝是腹正中切口术后常见并发症,早期促进切口愈合,有望降低切口疝发生率.腹白线主要由横行排列的胶原纤维构成,其间腱细胞数量少、活化困难.研究表明间充质干细胞(MSCs)可在骨形态发生蛋白(BMPs)的诱导下分化为腱细胞[1],但其分化通路存在争议.本研究旨在探讨BMP-12诱导MSCs向腱细胞分化作用及其机制.
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微小RNA-214抑制肠癌细胞增殖的分子生物学研究
微小RNA(miRNA,miR)-214在多种实体恶性肿瘤中呈现低表达,而在相应的癌旁正常组织中呈现高表达,提示miR-214可能发挥抑制基因的作用[1].我们采用脂质体转染技术将外源性miR-214转染人结直肠癌细胞,并通过细胞计数试剂盒(CCK-S)实验和Transwell实验分析miR-214对人结直肠癌LoVo细胞增殖和侵袭能力的影响.
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小干扰RNA下调Linc00152表达抑制胃癌细胞增殖迁移
Linc00152是以长度约为15 kb的长链非编码RNA,其基因位于2号染色p11.2[1],其在肿瘤组织中的表达水平高于正常组织.因而提示其可能与胃癌等恶性肿瘤的发生发展有关.我们采用人胃癌细胞MGC-803为研究材料,通过噻唑蓝(MTT)和划痕实验探讨Linc00152在胃癌细胞增殖和迁移中的作用.
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Girdin对胰腺癌细胞Aspc-1迁移及侵袭能力的影响
我们通过腺病毒干扰Girdin表达,观察Girdin对胰腺癌细胞Aspc-1侵袭和迁移的影响.一、材料与方法1.材料:人胰腺癌细胞株Aspc-1购自上海博谷生物科技有限公司;抗体购自美国Abcam公司;Tirzol购自美国Invitrogen 公司;反转录试剂盒购自日本TaKaRa公司;SYBR Green购自德国Roche公司;基质胶购自美国BD公司.2.方法:利用Girdin干扰腺病毒转染Aspc-1细胞,应用Western blot和实时定量反转录聚合酶链反应(RT-qPCR)检测Girdin基因的蛋白和mRNA的表达水平,划痕实验检测细胞迁移,Transwell实验检测细胞侵袭能力.
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微小RNA-490-3p对结肠癌细胞生物学行为的影响
我们取结肠癌细胞(SW480)为研究对象,观察微小RNA(miRNA,miR)-490-3p对其生物学行为的影响.一、材料与方法1.材料:人结肠癌细胞株SW480、Leibovitz L-15培养基、胎牛血清(FBS)、青-链霉素、反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)试剂、Sequence 5'-CAACCTGGAGGACTCCATGCTG-3'、Lipofectamine 2000转染试剂、Martigel基底膜胶、Transwell板、辣根过氧化物酶标记二抗等.
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微小RNA-320a在前列腺癌中的表达及其功能
目的 检测微小RNA(miR-RNA,miR)-320a在前列腺癌患者血清及组织中的表达,探讨miR-320a在前列腺癌中的功能及作用机制.方法 实时荧光定量聚合酶链反应(Real-timePCR)检测miR-320a在前列腺癌患者和健康男性血清中的表达,同时检测前列腺癌组织中miR-320a的表达;细胞计数试剂盒(CCK-8)检测miR-320a对前列腺癌细胞增殖影响;细胞划痕实验检测miR-320a 对前列腺癌细胞侵袭的影响;双荧光素酶报告实验检测miR-320a对于SOX4基因调控作用;Western blot实验检测miR-320a对于SOX4抑制作用.结果 前列腺癌患者血清中miR-320a表达低于正常对照血清[(0.983±0.103)比(2.432±0.376),P=0.000];前列腺癌组织直径≥2.5 cm的肿瘤比直径<2.5 cm的肿瘤miR-320a表达水平低(P =0.023).Real-time PCR结果显示转染miR-320a mimics后,PC3细胞中miR-320a表达增高.CCK-8检测结果显示转染后24、48、72 h,miR-320a mimics组细胞增殖(0.306±0.041、0.567±0.117、0.612±0.134)低于miR-320aNC组(0.542±0.094、0.976±0.133、1.347 ±0.217)、PC3组(0.462±0.110、0.954±0.158、1.212±0.161).细胞划痕实验显示,细胞划痕后培养48 h,miR-320a mimics组细胞间划痕距离大于PC3、miR-320aNC组.双荧光素酶报告实验证明miR-320a可以直接作用于SOX4的3'非翻译区,调控SOX4表达.Western blot检测结果表明高表达miR-320a后,SOX4表达水平降低.结论 miR-320a在前列腺癌患者血清中低表达,并且miR-320a的表达与前列腺癌肿瘤大小呈负相关;miR-320a抑制前列腺癌细胞增殖和迁移,可能是通过调控SOX4发挥作用的.
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急性胰腺炎易感性与白细胞介素-10基因多态性的Meta分析
目的 探讨白细胞介素-10 (IL-10)基因rs1800896、rs1800871多态性与急性胰腺炎(AP)患病风险的相关性.方法 检索PubMed、EMBASE、Web of Science、中国知网文献数据库,查找国内外关于IL-10 rs1800896、rs1800871多态性与AP易感性关系的病例对照研究.由2名评价者根据纳入标准分别独立筛选文献并提取数据后,采用Stata 12.0软件进行Meta分析.结果 共纳入7篇文献,包含12项病例对照研究.结果显示,IL-10rs1800896可提高AP的患病风险[GG比AA:优势比(OR)=1.71,95%可信区间(CI):1.28 ~2.28;AG+ GG比AA:OR=1.26,95% CI:1.06 ~ 1.49;GG比GA+ AA:OR=1.55,95% CI:1.18 ~2.05;G比A:OR=1.26,95% CI:1.11 ~ 1.44];IL-10 rs1800871则与AP患病风险无关(CC比TT:OR=1.02,95% CI:O.81 ~ 1.27;TC+ CC比TT:OR=1.07,95% CI:0.90~1.27;CC比TC+ TT:OR =0.96,95%CI:0.80 ~ 1.16;C比T:OR=1.02,95%CI:0.91~1.14).结论 rs1800896可明显增加AP易感性,IL-10 rs1800871则与AP易感性无关.
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成髓细胞瘤转录因子第2亚型在前列腺组织的表达及其临床意义
目的 观察成髓细胞瘤转录因子第2亚型(MYBL2)在前列腺组织中的表达并探讨其临床意义.方法 采用免疫组织化学法检测80例前列腺组织芯片中MYBL2的蛋白表达水平,结合泰勒(Taylor)和癌症基因组图谱(TCGA)数据库,分析MYBL2表达量和患者临床病理特征和预后的关系.结果 MYBL2在前列腺癌组织中的表达量(4.22 ±2.02)明显高于癌旁前列腺组织(2.43±1.61,P =0.001).前列腺癌组织中MYBL2高表达与高Gleason评分相关(Gleason评分<8为3.50±1.78,Gleason评分≥8为5.37±1.89,P=0.001),差异有统计学意义.Taylor和TCGA数据库分析发现,相对于癌旁组织(7.39 ±0.28),MYBL2的mRNA表达量在前列腺癌组织中显著上调(7.58 ±0.30,P=0.002),MYBL2表达量上调与高Gleason评分(P=0.001)和肿瘤转移(P=0.000)相关.Kaplan-Meier生存分析结果显示,MYBL2高表达的前列腺癌患者与MYBL2低表达患者比较,其无生化复发生存时间缩短,两者比较差异有统计学意义(Taylor数据库:P=0.038;TCGA数据库:P=0.001).结论 MYBL2在前列腺癌组织中表达显著上调,与肿瘤发生进展及患者不良临床病理特征明显相关.
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T细胞激活抑制物免疫球蛋白可变区结构域和程序性死亡受体1分子联合阻断在小鼠结肠癌模型中抗肿瘤效应的研究
目的 探讨T细胞激活抑制物免疫球蛋白可变区结构域分子(VISTA)和CD8、CD33分子在K-鼠类肉瘤病毒癌基因(KRAS)基因外显子不同变异的结直肠癌组织中的表达及VISTA和程序性死亡受体1(PD1)拮抗剂CA170治疗对小鼠CT26结肠癌移植瘤模型抑制作用的机制.方法 收集经病理诊断与KRAS基因测序的结肠癌患者193例,免疫组织化学方法检测上述分子在肿瘤组织中的表达.用小鼠肠癌细胞株CT26构建BALB/c小鼠移植瘤模型,采用液相蛋白分析和流式细胞术和游标卡尺检测两组小鼠模型的多个细胞因子表达和移植瘤体中免疫细胞的变化以及瘤体抑制的指标.统计学分析以上指标.结果 大肠癌组织中VISTA、CD33、CD8分子表达在KRAS基因突变组和野生组之间差异有统计学意义(P =0.020、0.001、0.033).CA170及对照组瘤体积分别为(1 173.3 ±531.2)、(6 399.4±1 790.5)mm3;两组间瘤体抑制率比较差异有统计学意义(P=0.000);实验组间的细胞因子粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、血管内皮生长因子(VEGF)、MCSF、趋化因子2(CCL2)、干扰素(IFN)-γ、白细胞介素(IL)-10、IL-12以及调节性T细胞(Tregs)、骨髓来源的抑制性细胞(MDSCs)和肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的浸润差异有统计学意义(P =0.010、0.001、0.000).结论 VISTA和CD33分子高表达及CD8+的T细胞的低浸润状况与大肠癌的KRAS基因分型相关;VISTA和PD1分子联合阻断剂CA170治疗可以改善肠癌小鼠的全身免疫状况并显著减慢小鼠肠癌的生长.
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纳布啡预处理联合超声引导椎旁神经阻滞对胸腔镜下肺癌根治术患者细胞免疫功能的影响
目的 观察纳布啡预处理联合超声引导下椎旁神经阻滞用于胸腔镜下肺癌根治术患者镇痛,探讨纳布啡预处理联合超声引导椎旁神经阻滞的优化效果.方法 选取行胸腔镜下肺癌根治术患者60例,年龄40~70岁,体重55 ~ 80 kg,美国麻醉医师协会评分标准(ASA)分级Ⅰ级或Ⅱ级,TNM分期Ⅰ期或Ⅱ期,采用随机数字表法,将患者以随机数字表法随机分为3组(n=20):对照组(A组)、纳布啡预处理组(B组)、纳布啡预处理+罗哌卡因组(C组).入室后C组在局麻下行超声引导术侧胸T4、T7和T9三点靶向横突根部阻滞,每点注入0.5%罗哌卡因10 ml,确定阻滞平面后开始麻醉诱导.于全麻诱导前3 min于B、C组静脉注射纳布啡20 mg,A组静脉注射等容量生理盐水.采用瑞芬太尼和异丙酚双通道靶控输注维持麻醉.于麻醉诱导前5 min时(T0)、手术开始后1h时(T1)、术毕时(T2)、术毕24 h时(T3),取中心静脉血样,检测T0~T3血浆去甲肾上腺素(NE)、肾上腺素(E)及皮质醇(Cor)浓度及T淋巴细胞亚群CD3+、CD4+、CD8+水平和CD4+/CD8+比值.记录术中丙泊酚用量、瑞芬太尼用量及麻醉恢复期血管活性药使用率.结果 与T0时比较,A组T2时CD3+:50.6 ±6.0、CD4+:28.4 ±6.2和CD4+/CD8+:1.3±0.1降低,T3时CD3+:40.5±5.1、CD4+:27.3 ±6.4和CD4 +/CD8+:1.8±0.3降低,B组T2时CD3+:54.4 ±6.0、CD4+:32.5 ±6.9降低,T3时CD3+:52.3 ±5.7、CD4+:38.7 ±7.6降低,C组T2时CD3+:63.3±7.5、CD4+:38.2 ±7.0降低,T3时CD3+:60.4±7.4、CD4+:42.5 ±7.4降低(P=0.000);与A组比较,B组、C组T2、T3时CD3+、CD4+细胞水平升高,B组T2时CD4+/CD8+:1.9±0.1,T3时2.1±0.2升高,C组T2时CD4+/CD8+:2.2±0.2,T3时2.2±0.2升高(P=0.000);与B组比较,C组T2、T3时CD3+、CD4+细胞水平和CD4 +/CD8+比值升高(P=0.000).与A、B组比较,C组T1 ~ T3 NE、E和Cor浓度及术中丙泊酚用量、瑞芬太尼用量、麻醉恢复期血管活性药使用率降低;与A组比较,B组T1~ T3 NE、E和Cor浓度及术中丙泊酚用量、瑞芬太尼用量、麻醉恢复期血管活性药使用率降低.结论 纳布啡预处理联合超声引导下椎旁神经阻滞可改善胸腔镜下肺癌根治术患者细胞免疫功能.
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莫洛尼鼠白血病病毒前病毒整合基因-3蛋白在骨肉瘤患者中的表达及其临床病理意义
目的 探讨抗凋亡蛋白病毒前病毒整合基因(PIM)-3在骨肉瘤患者中的表达及分析其临床病理意义.方法 随机选取120例骨肉瘤组织、90例骨软骨瘤和120例正常骨组织,并且对这些患者随访9 ~12个月,采用免疫组织化学法以及Western blot法检测PIM-3蛋白的表达及定位情况,分析PIM-3蛋白的表达及临床病理意义.结果 骨肉瘤患者PIM-3蛋白表达量高,显著高于另外两组受试者(P=0.001).同时骨软骨瘤患者体内PIM-3蛋白含量也高于正常受试者(P=0.001).PIM-3蛋白在骨肉瘤患者不同性别(t=0.216,P =0.829)、年龄(t=0.068,P=0.946)、肿瘤部位(=0.153,P=0.928)间表达比较差异无统计学意义,但在不同肿瘤大小间差异有统计学意义(P=0.001).结论 PIM-3蛋白在骨肉瘤的发生、发展和转移过程中起一定作用.
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乳腺癌扩增性抗原1在胆管细胞性肝癌组织的表达及其意义
目的 探讨乳腺癌扩增性抗原1(AIB1)和上皮-间充质转化(EMT)相关标记分子在胆管细胞性肝癌(ICC)中的表达及其临床意义.方法 免疫组织化学法检测AIB1在癌旁组织及ICC组织中表达,分析AIB1与ICC临床病理的关系.结果 免疫组织化学检测结果显示,ICC组织中AIB1蛋白表达水平明显高于癌旁组织,与癌旁组织比较,ICC组织中N-钙黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)表达水平也明显升高.ICC组织中的AIB1蛋白表达水平与患者年龄、性别、肿瘤直径、远处转移及病理分型无相关性.AIB1阳性表达的发生淋巴结转移性ICC患者发生率是48.71% (19/39),而AIB1阴性表达的发生淋巴结转移性ICC患者发生率是24.32% (9/37),两者差异有统计学意义(x2=4.855,P=0.035).此外,N-cadherin阳性表达的发生淋巴结转移性ICC患者发生率是47.50% (19/40),而N-cadherin阴性表达的发生淋巴结转移性ICC患者发生率是25.00%(9/36),两者差异有统计学意义(x2=4.122,P=0.027).Vimentin蛋白表达水平与患者年龄、性别、肿瘤直径、远处转移及病理分型无相关性.Western blot结果表明,淋巴结转移阳性胆管癌组织AIB1表达水平明显高于淋巴结转阴性胆管癌组织,差异有统计学意义(x2=0.625,P=0.034).结论 AIB1在ICC中表达增加,且与ICC淋巴结转移和EMT基因相关,提示AIB1可能通过诱导ICC、EMT,可促进ICC发生侵袭性转移.
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6岁以下儿童寰椎侧块及枢椎椎弓根螺钉置入的研究
目的 探讨6岁以下儿童寰椎侧块及枢椎椎弓根置入3.5 mm直径螺钉的可行性.方法 随机选取并收集250例2~6岁儿童上颈椎CT影像资料.测量每例儿童寰椎侧块(C1LM)及枢椎椎弓根(C2P)横径、长度及矢状位高度.以C1LM/C2P可在椎弓根钉置入后,横径、长度及高度均留有至少0.5 mm厚度骨皮质,作为该规格椎弓根螺钉适用于此C1LM/C2P的判断标准.统计3.5 mm直径螺钉在不同年龄、性别及侧别的寰枢椎中的置入适用率.结果 2~6岁儿童整体C1 LM的长度及横径分别为(21.12 ±2.94) mm及(7.35 ±1.41) mm.整体C2P长度、横径及高度依次为(19.77 ±2.92)、(5.30±1.02)、(5.39 ±0.85) mm.2岁儿童寰枢椎置入3.5mm直径螺钉的可行性在88.00%以上,3岁以上儿童可达92.12%以上.结论 3,5 mm直径的螺钉适合用于置入大多数6岁以下儿童的C1LM/C2P,在选择寰枢椎螺钉规格时,需具体考虑患儿性别、年龄及置入侧别.
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半乳糖凝集素-1表达对甲状腺乳头状癌增殖、迁移和侵袭的影响
目的 观察半乳糖凝集素-1(Galectin-1)在甲状腺乳头状癌组织中的表达,并探讨其对甲状腺乳头状癌增殖、迁移和侵袭的影响.方法 选择123例在我院进行甲状腺手术治疗的患者作为研究对象,采用免疫组织化学法检测手术切除组织中Galectin-1和Galectin-3表达,分析两种蛋白诊断甲状腺良性病变组织、甲状腺乳头状癌组织的价值.以甲状腺乳头状癌细胞株TCP-1作为研究对象,沉默Galectin-1基因表达,比较未沉默和沉默Galectin-1后TPC-1细胞增殖、迁移和侵袭能力.结果 Galectin-1和Galectin-3诊断甲状腺乳头状癌的敏感度、特异度、阳性似然比和阴性似然比分别为94.1%和96.8%、29.406和0.061、94.7%和81.9%以及5.199和0.072.Galectin-1诊断甲状腺乳头状癌的特异度显著高于Galectin-3(x2=8.453,P=0.004),两者诊断甲状腺乳头状癌的敏感度差异无统计学意义(x2=0.253,P=0.617).未转染TPC-1细胞株和仅转染脂质体TPC-1细胞株在转染12、24、36、48、72 h时的570 mm波长处吸光度(A570)值显著高于干扰Galectin-1基因的TPC-1细胞[未转染TPC-1细胞株t=2.470、4.478、8.860、17.539,P=0.019、0.000、0.000、0.000;仅转染脂质体TPC-1细胞株t=3.471、3.527、7.580、20.270,P=0.001、0.001、0.000、0.000].染TPC-1细胞株和仅转染脂质体TPC-1细胞株划痕直线大宽度显著低于敲除Galectin-1基因的TPC-1细胞(P=0.000).Transwell小室侵袭实验结果显示,未转染TPC-1细胞株和仅转染脂质体TPC-1细胞株侵袭细胞数量显著高于敲除Galectin-1基因的TPC-1细胞(P=0.000).结论 Galectin-1能够促进甲状腺乳头状癌增殖、迁移和侵袭.
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直肠黏膜活检组织行钙视网膜蛋白、S100及PGP9.5联合染色对先天性巨结肠症的诊断价值
目的 评估直肠黏膜负压吸引活检组织行钙视网膜蛋白(CR)、S100蛋白(S100)及蛋白基因产物9.5 (PGP9.5)染色诊断先天性巨结肠症(HD)的准确性.方法 2014年6月至2017年1月,华中科技大学同济医学院附属协和医院就诊的疑似HD患儿318例,在进行详细的病史调查及体检后行直肠黏膜负压吸引活检,取得的标本进行CR、S100、PGP9.5免疫组织化学染色,观察是否有神经节细胞及粗大增生的神经纤维来诊断HD,并与术后病理检查结果比较,评估其诊断HD的准确性.结果 318例患者进行该诊断方法,其中219(69%)例显示有神经节细胞,99例(31%)缺乏神经节细胞,在这99例中,S-100蛋白及PGP9.5染色分别显示有92%和93%的患儿含有黏膜下粗大的神经纤维.132例患者终行结肠切除术,其中,99例术后病检证实了HD.该方法的准确性和特异性分别为97.0% [95%可信区间(CI):88.0% ~99.0%]和100.0% (95% CI:97.0%~100.0%),阳性预测值为94.3% (95% CI:87.0% ~ 99.0%),阴性预测值为99.1% (95% CI:95.0%~100.0%).结论 CR、S-100和PGP9.5染色之间能通过优势互补,提高直肠黏膜负压吸引活检诊断HD的精准性.
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斯钙素-1促进膀胱癌5637细胞增殖和迁移、抑制凋亡的研究
目的 观察斯钙素-1(STC-1)在膀胱癌组织中的表达及其对膀胱癌细胞5637生物学行为的影响.方法 取60例膀胱癌患者癌组织及癌旁正常组织,采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blot技术检测膀胱癌及其对应的癌旁组织中STC-1 mRNA和蛋白的表达.随后分别应用细胞计数试剂盒(CCK-8)、流式细胞仪、Transwell小室观察STC-1蛋白对5637细胞增殖、凋亡及迁移能力的影响.结果 膀胱癌组织中STC-1 mRNA的相对表达量(0.826 ±0.112)明显高于癌旁正常组织(0.283 ±0.006)(P=0.000).STC-1蛋白在膀胱癌组织中的相对表达量(0.795±0.107)显著高于癌旁正常组织(0.164±0.039) (P=0.000).随着TNM分期的增加,STC-1 mRNA和蛋白表达水平有升高的趋势,但各分期间的表达差异无统计学意义.与对照组比较,STC-1可显著促进5637细胞的增殖.此外,与STC-1单克隆抗体组(56.26 ±2.27)%和空白对照组(53.43±2.04)%比较,STC-1蛋白组的5637细胞凋亡比例(18.48±0.87)%明显下降(P=0.000).Transwell 小室结果显示,STC-1蛋白组细胞迁移数为(96±7)个,与STC-1单克隆抗体组[(28±2)个]和空白对照组[(32±3)个]比较,细胞迁移能力明显增强(P =0.000).结论 STC-1可能在膀胱癌的发生发展中发挥重要作用.
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七氟醚和丙泊酚对人体精子运动功能和体外获能的影响
目的 观察吸入麻醉药七氟醚和静脉麻醉药丙泊酚在临床浓度下对人体精子运动功能和体外获能的影响.方法 正常成年男性精液标本经Percoll密度梯度法离心优选后沉淀,沉淀精子置于人体精子体外获能培养基,调节精子密度为(30 ~50)×106/ml,随机分为对照组(C组)、七氟醚组(S组)和丙泊酚组(P组),七氟醚组根据暴露环境中七氟烷浓度不同,分为低浓度组(S1组,1.8%)和高浓度组(S2,2.2%);丙泊酚组根据培养基中丙泊酚浓度不同,分为低浓度组(P1组,1.8 μg/ml)和高浓度组(P2组,2.4μg/ml).在37℃孵箱中培养5h,采用计算机辅助精子分析系统(CASA)评价精子运动参数,包括:精子运动活力(a+b级)%、曲线速度(VCL)、直线速度(VSL)、平均路径速度(VAP)和头部侧向运动平均振幅(ALH);采用金霉素荧光染色技术评价精子体外获能,以(B+AR)%表示已发生获能的精子比例.结果 1.8%、2.2%七氟醚和1.8、2.4μg/ml丙泊酚分别作用于精子5h以后,精子的运动活力(a+b级)%以及VCL、VSL、VAP、ALH都有明显下降,且对精子运动功能的影响呈现剂量依赖关系(P=0.017);相同临床效应浓度,七氟醚对精子运动功能的抑制作用明显强于丙泊酚(P=0.026);相同临床效应浓度下,七氟醚对精子获能的抑制作用显著强于丙泊酚组(P=0.011).结论 七氟烷和丙泊酚临床相关浓度暴露,对人体精子运动功能和体外获能均具有抑制作用,随着暴露浓度的增加,抑制作用增强;七氟烷对精子运动功能和体外获能的抑制作用强于丙泊酚.
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微血栓在蛛网膜下腔出血后迟发性脑缺血的作用机制和治疗进展
蛛网膜下腔出血(SAH)后迟发性脑缺血(DCI)是导致患者致死、致残的严重并发症.一般认为SAH后DCI主要原因是脑血管痉挛(CVS).SAH后炎性反应、凝血系统激活、内皮细胞的激活、纤溶级联反应受损可能导致微血栓的形成,进而发展成DCI.尸体解剖已经证实了SAH后微血栓的存在.明确微血栓形成的机制以及微血栓在DCI中的作用对SAH的治疗和预后具有重要意义.
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微小RNA在骨肉瘤基础研究的进展
骨肉瘤是常见的原发性恶性骨肿瘤,通常起源于儿童和青少年的长骨干骺端,其恶性程度高,可在数月内发生肺转移.尽管诊断治疗手段水平不断提高,然而其预后效果不佳,患者生存率仍非常低.微小RNA(miRNA,miR)是一段18 ~25核苷酸的非编码RNA,参与调控转录后水平基因表达.研究表明miRNA影响肿瘤微环境并与恶性肿瘤发生发展有着密不可分的关系.本文结合国内外文献,着重对miRNA在骨肉瘤基础研究进展作出综合性阐述.
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携氧机械灌注对于供肝保护作用的研究进展
近年来,为了缓解器官来源不足的困境,许多边缘供肝(比如心脏停跳后供肝、老年供肝、脂肪肝供肝等)逐渐应用于临床.相对于传统的脑死亡后供肝捐献,边缘供肝质量更差,术后并发症较多,这为器官的保存方法提出了更高的要求.携氧机械灌注由于可以循环供氧维持代谢等优点,逐渐受到移植领域的重视.本文就该保存技术进行回顾总结.
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生物支架材料在尿道组织工程中的研究进展
生物支架材料在组织工程尿道构建中起到关键作用,它是种子细胞附着、增殖、分化的载体和基质.不同性质的生物支架材料的相应的优缺点不同.本文就生物支架材料在尿道重建中的应用作一综述.
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钙化性主动脉瓣疾病细胞模型研究进展
钙化性主动脉瓣疾病(CAVD)曾被认为是被动的退行性病变,但近来的研究结果显示钙化进程是一个主要由主动脉瓣瓣膜间质细胞(AVICs)主动调控的过程.瓣膜间质细胞(VICs)存在于瓣叶组织中,其主要的功能是维持瓣叶生物功能的稳定.VICs在体外培养时可以发生表型转化,转变为成骨细胞样细胞并形成钙化结节,且多种因素可以调控这一钙化进程.本文将对CAVD的细胞模型作一综述.
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三野淋巴结清扫术在食管癌手术中的应用
食管癌是常见恶性肿瘤之一,尽管多学科治疗手段提高了食管癌的预后,但其病死率仍较高,因为食管癌淋巴结转移可首先出现在颈部至腹部,所以采取了扩大淋巴结清扫的策略;三野淋巴结清扫术(3FLD)建立于20世纪80年代的日本,定义为一种经胸食管切除术,其进行颈-胸-腹三野淋巴结清扫,目前其被全世界广泛接受.迄今为止,已经报道各种关于3FLD和二野淋巴结清扫术(2FLD)的对比试验,并且证明3FLD在预后方面优于2FLD.但是,在3FLD中出现众多术后并发症如喉返神经损伤和术后胃肠道功能紊乱.近来,食管癌术前治疗的功效得到报道,微创手术的重要性也正在得到验证.术前治疗和可行的手术方法相结合,其将在未来不断提高食管癌患者的预后.
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纳米技术在肝癌诊疗领域的探索与应用
原发性肝癌(主要指肝细胞癌)是全球第二大致死性肿瘤疾病,绝大多数患者在确诊时已处于中晚期,失去了根治性治疗的机会.肝癌对化学治疗和放射治疗均不敏感,而索拉非尼作为目前唯一的肝癌分子靶向药物,其不良反应较大,长期疗效不理想.因此,亟需开发新的治疗方法以有效提高肝癌的治疗水平和远期预后.纳米医学作为新兴学科,以安全、稳定、高效的纳米材料为基础,针对肝癌微环境的特征性变化,构建出靶向性强的纳米载体,并进一步衍生出以纳米载体输运体系为基础的多种高效的诊断和治疗方法,如高性能计算机断层扫描(CT)、磁共振成像(M RI)、荧光成像等高效分子成像模式及声动力学、光动力学、热消融、诊疗一体化平台等新型治疗策略,为肝癌的精准诊疗提供了新的思路.
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异柠檬酸脱氢酶在胶质瘤临床研究中的进展
胶质瘤是常见的神经系统恶性肿瘤,异柠檬酸脱氢酶(IDH)基因突变的发现为胶质瘤的研究指出了新的方向.IDH与胶质瘤发病机制的研究已较为深入,而IDH与胶质瘤诊断、治疗、预后等临床问题的关系研究逐渐受到学者的关注.本文通过总结IDH基因突变与胶质瘤的关系及其在胶质瘤临床研究中的应用,为胶质瘤的药物治疗提供新的靶点和研究方向.
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快速构建轻度认知功能障碍大鼠模型
目的 探讨应用D-半乳糖(D-gal)快速建立轻度认知功能障碍大鼠模型的方法和合适剂量.方法 成年雄性SD大鼠100只,模型A、B、C、D组大鼠颈背部皮下分别注射D-gal 100、300、1 000、2000 mg/(kg·d)1周,对照O组皮下注射等量生理盐水1周.注射结束后,次日开始Morris水迷宫实验,完成后,进行脑匀浆丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性及乙酰胆碱酯酶(AchE)浓度的测定及观察海马组织的病理形态学变化.结果 (1)各组大鼠存活率均为100%.与O组比较,D组大鼠体重增加不显著,游泳速度减慢.(2)水迷宫定向航行实验中,2~5d,C组和D组大鼠平均逃避潜伏期均较O组大鼠延长(P值分别为2 d:C:0.008,D:0.000;3 d:C:0.000,D:0.000;4 d:C:0.000,D:0.000;5 d:C:0.000,D:0.000);空间探索实验中,C组和D组大鼠60 s平均穿越原平台次数分别为(3.05 ±0.76)和(2.05 ±0.69)次均较O组[(4.40±1.05)次]显著减少(P =0.000,0.000).(3)C组和D组大鼠脑匀浆MDA含量分别为(29.19±2.35)ng/ml和(32.57±2.05) ng/ml,比O组(20.52±2.08) ng/ml显著增高(P=0.000,0.000);C组和D组大鼠脑匀浆SOD活性分别为(1.46 ±0.12) IU/ml和(1.34±0.13) IU/ml,比O组(1.74 ±0.12) IU/ml显著降低(P =0.001,0.000);C组和D组大鼠脑匀浆AChE浓度分别为(3.52±0.70) ng/ml和(4.02 ±0.39) ng/ml,比O组(1.72±0.33) ng/ml显著增高(P=0.000,0.000).(4)病理形态学结果显示,C组大鼠海马CA1区部分椎体细胞缺失,细胞密度稍下降,较多量椎体细胞显示胞核固缩、深染,出现少量细胞凋亡,脑白质正常;D组CA1区椎体细胞密度明显下降,排列明显疏松、紊乱,多量细胞出现胞核固缩、深染,细胞凋亡.结论 大鼠皮下注射D-gal 1 000 mg/(kg·d)1周,出现符合轻度认知功能障碍的病理过程及其特征.
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去甲斑蝥素通过线粒体途径诱导胶质瘤细胞凋亡的研究
目的 探讨去甲斑蝥素(NCTD)诱导胶质瘤细胞凋亡的分子机制.方法 不同浓度NCTD(25、50、100、200 μmol/L)分别处理胶质瘤C6细胞24、48 h,噻唑蓝(MTT)法检测药物对细胞的生长抑制作用;膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素(Annexin V-FITC)/碘化丙锭(PI)染色法检测NCTD对C6细胞凋亡的影响;Western blot法检测B细胞淋巴瘤/白血病-2(bcl-2)家族蛋白的表达.结果 MTT法检测显示NCTD呈时间、剂量性抑制细胞增殖,处理24、48 h后半数抑制浓度(IC50)分别为96.5、48.7 μmol/L,对细胞增殖具有明显抑制作用(F=78.202、897.714,P=0.000);流式细胞仪结果显示,10、30、50 μmol/L NCTD作用C6细胞10 h,细胞凋亡率分别(2.0±2.9)%、(8.4±4.1)%、(19.7±5.7)%,与对照组[(0.9±3.1)%]比较,差异有统计学意义(F=76.246,P=0.000);Western blot结果显示,25、50、100 μmol/L处理C6细胞24h后,细胞Bcl-2、Mcl-1蛋白的表达下调.结论 NCTD具有较强的抑制胶质瘤细胞生存和诱导凋亡作用,作用机制与通过诱导bcl-2家族抗凋亡蛋白表达下调,激活内源性线粒体凋亡通路有关.
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抑制转录共激活因子TAZ和B7-H4在胶质瘤组织的表达
目的 观察抑制转录共激活因子TAZ和B7-H4在正常脑组织和胶质瘤组织的表达,探讨两者与胶质瘤病理学特征的关系.方法 收集82例胶质瘤组织作为实验研究对象,另取35例正常脑组织作为对照组,应用免疫组织化学方法检测TAZ和B7-H4的表达水平.结果 胶质瘤组织中TAZ阳性表达率明显高于正常脑组织中TAZ阳性表达率(75.61%比11.43%),两者差异有统计学意义(x2=41.090,P=0.000),胶质瘤组织中B7-H4阳性表达率明显高于正常脑组织中B7-H4阳性表达率(68.29%比8.57%),两者差异有统计学意义(x2=35.000,P=0.000);TAZ及B7-H4表达水平与胶质瘤组织学分级有明显相关(分别为t=5.340,P=0.020;t =4.850,P=0.030).结论 TAZ及B7-H4的高表达在胶质瘤的发生发展中起到一定的作用.
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丝/苏氨酸激酶1在胶质瘤中的表达及其对U87MG细胞增殖能力的影响和机制
目的 探讨丝/苏氨酸激酶1(PIM1)在胶质瘤中的表达及其对胶质瘤细胞株U87MG增殖能力的影响及其机制.方法 应用实时定量反转录聚合酶链反应(RT-qPCR)方法对28例胶质母细胞瘤标本和15例外伤脑组织标本分别进行PIM1含量的检测;利用RNA干扰技术敲低胶质瘤细胞株U87MG的PIM1的表达量,将细胞株分为短发卡RNA(shRNA)阴性对照组以及shRNA干扰组,通过细胞计数试剂盒(CCK-8)法检测细胞增殖变化、Western blot检测PIM1、蛋白激酶B(Akt)、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)蛋白变化.结果 胶质瘤组织中PIM1 mRNA表达量(1.59±0.13)显著高于正常脑组织PIM1 mRNA表达量(0.42 ±0.09,P=0.010);胶质瘤细胞株U87MG的shRNA干扰组72 h细胞增殖(0.462 ±0.014)与shRNA阴性对照组72 h细胞增殖(0.826±0.034)比较,其增殖能力明显降低,差异有统计学意义(P=0.008),敲减PIM1可导致Akt信号通路蛋白表达发生变化.结论 PIM1可能通过Akt信号通路促进U87MG细胞增殖.
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黄芩苷对海人酸致癫小鼠Toll样受体2/4信号通路的影响
目的 观察黄芩苷对小鼠癫痫持续状态后Toll样受体2(TLR2)、Toll样受体4(TLR4)信号通路的影响,探讨黄芩苷对癫痫发作后神经细胞保护作用的机制.方法 48只ICR雄性小鼠随机分为对照组、癫痫持续状态组、黄芩苷治疗组(100 mg/kg).采用腹腔内注入海人酸(12 mg/kg)建立小鼠癫痫持续状态模型.通过苏木素-伊红(HE)染色、尼氏染色观察小鼠海马组织神经细胞的形态学变化及坏死情况,免疫组织化学观察海马组织中TLR2、TLR4的细胞阳性表达,采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blot检测TLR2、TLR4、核转录因子-κB (NF-κB) mRNA和蛋白的表达量.结果 黄芩苷治疗组可显著减轻癫痫所致的海马神经细胞的损伤,降低神经细胞坏死(114.27±15.53),同时下调海马组织中TLR2、TLR4、NF-κB mRNA和蛋白的表达(P=0.043).结论 癫痫发作后可激活TLR2、TLR4介导的炎症信号通路;黄芩苷可通过抑制TLR2、TLR4介导的炎症信号通路,降低癫痫发作后海马神经细胞的损伤.
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术前外周血中性粒细胞与淋巴细胞比值和单核细胞与淋巴细胞比值对胶质母细胞瘤患者临床预后的影响
目的 探讨术前外周血中性粒细胞与淋巴细胞比值(NLR)和单核细胞与淋巴细胞比值(MLR)对胶质母细胞瘤患者临床预后的影响.方法 共纳入经术后病理证实的初发胶质母细胞瘤患者200例,收集其临床资料及生存资料.采用Kaplan-Meier法分析1年和3年生存率,用Log-rank进行单因素生存分析.Cox模型比例风险评估行多因素分析.结果 高NLR组(NLR>7.25)的总生存率(OS)和无进展生存率(PFS)(11.2个月和8.8个月)均低于低NLR组(14.7个月和12.3个月),两组差异有统计学意义(OS:P=0.027;PFS:P=0.030),MLR对胶质母细胞瘤患者临床预后差异无统计学意义(OS:P =0.082;PFS:P =0.063).单因素分析结果显示:肿瘤是否全切(OS:P =0.000;PFS:P =0.000)、术后是否放疗(OS:P =0.000;PFS:P =0.000)、术后是否化疗(OS:P =0.000;PFS:P =0.001)是影响胶质母细胞瘤患者临床预后的因素.多因素分析结果示:肿瘤未全切(OS:P=0.000;PFS:P=0.000)、术后未放疗(OS:P=0.011;PFS:P=0.010)及NLR> 7.25(OS:P =0.048;PFS:P =0.036)是影响胶质母细胞瘤患者临床预后的独立危险因素.结论 高的NLR预示着较差的临床预后;MLR对胶质母细胞瘤患者的临床预后无预测价值.
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应用规律成簇的间隔短回文重复/Cas9构建敲除趋化因子受体4的人胶质瘤U251细胞
目的 运用规律成簇的间隔短回文重复(CRISPR)/Cas9基因编辑技术构建敲除趋化因子受体4 (CXCR4)基因的人脑胶质瘤U251细胞.方法 设计3对针对目标基因CXCR4的导向RNA(sgRNA),通过PX335质粒构建3组该基因的Cas9表达载体(CXCR4-sgRNA-1、CXCR4-sgRNA-2、CXCR4-sgRNA-3),测序验证后,将构建正确的载体CXCR4-sgRNA-1转染进至U251细胞,T7核酸内切酶Ⅰ (T7E1)酶切鉴定敲除效率,分离单克隆细胞5组进行培养,分别测序及蛋白印迹法鉴定其敲除效率和蛋白含量,获得稳定敲除阳性单克隆细胞.结果 测序验证CXCR4-sgRNA-1组载体构建成功,转染载体后U251细胞经聚合酶联反应(PCR)酶切鉴定敲除效率为48%,其2、3、4、5号单克隆细胞敲除效率分别为20%、40%、30%、20%.PCR产物连接T载体后测序,结果显示3组出现点突变,2号为A突变为G,4号为T突变为C和5号为A突变为G,而3号单克隆敲入38 bp碱基,确定为有意义的突变.2、3、4号单克隆细胞CXCR4蛋白表达量为0,敲除组CXCR4蛋白相对表达量较对照组明显降低(0比0.746±0.010,P=0.000),差异有统计学意义.免疫印迹结果说明敲除CXCR4基因的U251细胞株内无CXCR4蛋白的表达;测序比对得到有效的敲除细胞株.结论 通过CRISPR/Cas9系统高效地获得了靶向CXCR4重组质粒,并且筛选出稳定敲除CXCR4表达的U251细胞株.
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姜黄素抑制环氧化酶-2表达和激活半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶诱导胶质瘤细胞凋亡及影响线粒体膜电位
目的 探讨姜黄素(Curcumin)诱导U251人脑胶质瘤细胞凋亡的相关规律.方法 采用20 ~ 100μmol/L姜黄素作用胶质瘤细胞24 h,酶标法测定姜黄素对细胞生长的抑制作用.共聚焦显微镜观察姜黄素对胶质瘤细胞环氧化酶-2(COX-2)蛋白表达的影响;采用流式细胞仪检测细胞凋亡及线粒体膜电位的变化;采用透射电镜观察胶质瘤细胞形态学变化;酶标法测定各种半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶(Caspase)抑制剂对姜黄素诱导细胞凋亡活性的影响.结果 实验表明经20 ~ 100 μmol/L的姜黄素作用6~24 h后,胶质瘤细胞的生长均不同程度地受到抑制,各浓度姜黄素作用24 h后U251生长抑制率在(26.23 ±3.31)%~ (89.02 ±2.13)%之间;并呈时间浓度依赖性,组间差异有统计学意义(P =0.007).经姜黄素处理后的胶质瘤细胞,流式细胞仪检测凋亡指数分别为(16.35±1.72)%、(31.78±2.46)%、(52.91±2.18)%,组间比较差异有统计学意义(P=0.005).姜黄素能明显降低胶质瘤线粒体膜电位.经20 ~ 100 μmol/L的姜黄素处理肿瘤细胞30 h后,Caspase-3活性随药物浓度的增加及作用时间的延长先增加,而后逐渐降低,高峰值分别位于15、20、25、30 h处.各种Caspase抑制剂可抑制姜黄素诱导的胶质瘤细胞凋亡.细胞生长抑制率由85.23%分别降至36.52%、59.86%和48.39% (P =0.006),而Caspase-8抑制剂z-IETD-fmk的抑制效果稍弱,细胞抑制率由85.23%降至68.42%(P =0.036).组间比较差异有统计学意义.结论 姜黄素能降低COX-2表达和激活Caspase诱导胶质瘤细胞凋亡,姜黄素能有效降低胶质瘤细胞线粒体膜电位,使胶质瘤细胞处于缺氧状态;姜黄素对胶质瘤细胞线粒体膜电位的影响,可能参与胶质瘤细胞的凋亡过程.
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鬼臼毒素纳米制剂对人胶质瘤U251细胞的研究
目的 探讨鬼臼毒素纳米制剂的理化性质,通过实验评价其抗人胶质瘤U251细胞的作用.方法 通过透析法制备鬼臼毒素载药聚合物胶团,应用细胞毒性实验、肿瘤细胞摄取实验、6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色观察细胞凋亡效应评价其疗效.结果 鬼臼毒素聚合物胶团的半数抑制浓度(IC50)值在24、48、72 h时分别为(7.18±0.82)、(5.71±0.18)、(2.57±0.12) μg/ml,明显低于游离鬼臼毒素,细胞摄取率约为游离鬼臼毒素的2倍,鬼臼毒素聚合物胶团作用后的U251细胞有明显的细胞凋亡的形态学改变.结论 鬼臼毒素纳米制剂能够有效抑制人胶质瘤U251细胞的增殖.
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小干扰RNA下调核因子IA对人脑胶质瘤细胞增殖、侵袭和迁移的影响
目的 观察核因子IA (NFIA)在胶质瘤中的表达及对胶质瘤生物学功能的影响.方法 采用免疫组织化学法检测49例胶质瘤组织和10例正常脑组织中NFIA的表达.使用RNA干扰技术处理胶质瘤U251细胞,采用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)和Western blot检测NFIA表达水平的变化,分别采用噻唑蓝法(MTT)、划痕实验及Transwell侵袭实验,检测敲低NFIA表达对胶质瘤细胞增殖、侵袭和迁移能力的变化;Western blot检测相关蛋白表达变化.结果 免疫组织化学检测结果显示NFIA在胶质瘤组织中的表达明显高于正常脑组织.下调胶质瘤细胞中NFIA表达后:MTT实验显示阴性对照组(1.367 ±0.021)与空白对照组(1.330 ±0.046)细胞生长差异无统计学意义(P=0.500),NFIA干扰组(0.823±0.096)细胞生长明显减慢,与阴性对照组与空白对照组比较,差异均有统计学意义(P=0.001).划痕实验显示NFIA干扰组细胞迁移距离(57.9±6.9) μm明显低于阴性对照组[(125.4±10.7) μm]和空白对照组[(111.5±5.9)μm],差异有统计学意义(P=0.001),Transwell实验显示RNA干扰组穿膜细胞数[(33.3±3.2)个]低于阴性对照组和空白对照组[(80.3±4.5)、(87.7±5.0)个],差异有统计学意义(P =0.001).Western blot结果显示,NFIA干扰组Ezrin蛋白相对表达(0.33 ±0.05)显著低于阴性对照组(1.08±0.08)与空白对照组(1.00±0.05),p21蛋白相对表达(1.02±0.08)显著低于阴性对照组(0.25±0.04)与空白对照组(0.29±0.03),差异均有统计学意义(P=0.001).结论 NFIA在胶质瘤组织中高表达,下调NFIA表达可抑制胶质瘤细胞增殖、侵袭和迁移能力.
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人垂体腺瘤细胞信号转导网络间交叉通讯机制与靶向药物治疗前景
人垂体腺瘤是腺垂体发生的良性肿瘤,腺瘤细胞兼具激素异常分泌和异常增殖的双重特点.人垂体腺瘤细胞的生物学行为受细胞内多条信号转导通路调控,这些信号通路彼此发生交叉通讯,构成复杂的调控网络,共同维持维持垂体腺瘤细胞激素异常分泌和增殖.本文旨在回顾调控垂体腺瘤激素异常分泌和细胞增殖的信号转导通路及其交叉通讯机制,分析信号网络中关键分子靶点的调控作用,为探索相关靶向治疗药物提供理论依据.
年 | 期数 |
2019 | 01 02 |
2018 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
2017 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
2016 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
2015 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
2014 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
2013 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
2012 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
2011 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 |
2010 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
2009 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
2008 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
2007 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
2006 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
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