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微小RNA-23a调控人卵泡颗粒细胞凋亡的体外研究
目的:研究微小RNA-23a(miR-23a)对人卵泡颗粒细胞中蛋白激酶B(Akt)磷酸化和PTEN表达的影响,探讨miR-23a调控人颗粒细胞凋亡的分子机制.方法:分别将miR-23a前体(pre-miR-23a转染组)、miR-23a抑制剂(miR-23a抑制剂组)和pre-miR-NA(阴性对照组)转染至体外培养的人卵泡颗粒细胞.应用实时定量荧光PCR技术检测miR-23a的表达,Westem blot法检测Akt、p-Akt、PTEN、半胱天冬氨酸蛋白酶(Caspase-3)等凋亡相关蛋白的表达,并应用Hoechst 33258法检测细胞的凋亡率.结果:(1)与阴性对照组比较(4.05±0.92),转染pre-miR-23a后,miR-23a表达量(19.18±1.69)显著升高,转染miR-23a抑制剂后,miR-23a表达量(1.27±0.15)显著降低,差异均有统计学意义(P＜0.05).(2)转染pre-miR-23a后,Akt和p-Akt相对表达量显著低于阴性对照组(P＜0.05);PTEN和Caspase-3裂解片断(Cleaved-caspase-3)相对表达量显著高于阴性对照组(P＜0.05).(3) pre-miR-23a转染组的细胞凋亡率为(17.87±2.20)％,显著高于阴性对照组(4.20±1.23)％(P＜0.05).结论:微小RNA-23a通过对其靶基因的调控参与PTEN/Akt信号通路介导的细胞凋亡,启动Caspase-3依赖的信号传导诱导体外培养人颗粒细胞的凋亡.
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微小RNA-23a在恶性胶质瘤患者血清和肿瘤组织表达及其调控ATP5A1基因表达的作用
目的 检测微小RNA(miRNA,miR)-23a在恶性胶质瘤(GBM)患者血清和肿瘤组织表达,探讨其在GBM中的功能.方法 通过实时定量反转录聚合酶链反应(RT-qPCR)检测GBM患者血清和肿瘤组织miR-23a表达变化;采用miR-23a mimic转染GBM细胞株U87MG、U251、T98G、A172,并用CellTiter-Glo(R) Luminescent Cell Viability Assay检测细胞生长,同时测定转染miR-23amimic的U87MG、U251细胞实体瘤生长;通过RT-qPCR检测GBM患者组织ATP5A1 mRNA表达,免疫组织化学方法检测肿瘤组织ATP5A1蛋白的表达;用miR-23a mimic转染GBM细胞株U87MG、U251、T98G、A172,Western blot检测ATP5A1蛋白的表达变化.结果 GBM患者血清和肿瘤组织miR-23a表达分别为0.40±0.18和1.00±0.12,明显低于癌旁组织(1.50 ±0.56) (P=0.005)和健康人血清(2.60 ±0.45) (P=0.005),同时miR-23a mimic可以抑制GBM细胞株U87MG、U251、T98G、A172的生长以及U87MG、U251实体瘤的生长(P=0.011),U87MG和U251感染pLKO.1慢病毒的细胞实体瘤大小分别为(597.1 ±95.4) cm3和(429.5±78.7)cm3,感染miR-23a mimic的分别为(153.2±38.6)cm3和(168.7±33.1) cm3(P=0.008);RT-qPCR以及免疫组织化学检测表明ATP5A1 (5.4±1.1)在GBM肿瘤组织中表达明显升高,而miR-23a mimic可以降低ATP5A1在GBM细胞株U87MG、U251、T98G、A172中的表达.结论 miR-23a具有抑制GBM细胞株生长和实体瘤形成的作用,miR-23a可以调节ATP5A1蛋白的表达.
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微小RNA-23a调控大鼠骨髓间充质干细胞成软骨分化的实验研究
目的:研究微小RNA-23a(microRNA-23a,miR-23a)调控大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)成软骨分化的作用和分子机制.方法:分离大鼠BMSCs并转染miR-23a基因后,通过RT-PCR和番红O染色法检测miR-23a调控大鼠BMSCs成软骨分化的作用,并进一步利用Western blot研究番红O调控BMSCs成软骨分化的分子机制.结果:转染miR-23a组和未转染组相比,成软骨分化相关基因如Sox9、二型胶原(CollagenⅡ)、聚集蛋白聚糖(Aggrecan)发生明显上调,而软骨肥大相关基因十型胶原(Collagen X)表达发生下调.番红O染色显示转染miR-23a组和未转染组相比,硫酸软骨素表达亦发生明显上调.Western blot检测显示转染miR-23a能明显促进大鼠BMSCs的Sox9蛋白表达而抑制其Runx2蛋白表达.结论:miR-23a可能通过上调Sox9表达及抑制Runx2表达来达到促进BMSCs成软骨分化并抑制其进一步肥大的作用.
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MiR-23a质粒的构建及其在胃腺癌细胞系MGC803中的表达
目的 构建表达微小RNA-23a(miR-23a)的真核表达质粒,为进一步研究小RNA分子miR-23a在胃腺癌细胞系MGC803中的功能奠定良好的实验基础.方法 首先设计并合成扩增miR-23a前体基因全长的PCR引物,提取胃腺癌细胞系MGC803基因组为模板,PCR扩增大小为324 bp的目的基因;PCR产物经过EcoR Ⅰ和BglⅡ酶切后,与线性化的pcDNA3载体连接后转化大肠杆菌,扩增、纯化获得所需质粒,以琼脂糖凝胶电泳、酶切鉴定以及基因测序鉴定其分子质量和插入片段的序列;构建的质粒经脂质体方法转染MGC803细胞,实时定量PCR检测转染细胞MGC803中miR-23a的表达水平,经MTT实验、平板克隆形成实验、软琼脂克隆形成实验、TUNEL实验及Transwell实验,观察过表达miR-23a后对MGC803细胞增殖、凋亡及侵袭能力的影响.结果 纯化质粒的相对分子质量为5.7 kb,酶切及测序鉴定结果符合目的条带大小(324 bp),插入的寡核苷酸序列与miR-23a前体基因序列完全相符;实时定量PCR结果表明pcDNA3/miR-23a能够有效表达miR-23a; MTT、平板克隆形成及软琼脂克隆形成实验结果显示,过表达miR-23a可以促进MGC803细胞活性;TUNEL实验结果显示,过表达miR-23a可以减少胃腺癌细胞MGC803凋亡的发生;Transwell实验结果显示miR-23a可以促进胃腺癌细胞MGC803的侵袭能力.结论 构建的真核表达质粒在胃腺癌细胞MGC803中有效表达miR-23a,能够促进细胞活性及侵袭能力,并能抑制凋亡的发生.
关键词： 胃腺癌细胞系MGC803 微小RNA-23a 细胞活性 侵袭 凋亡
