一种捕获尿液中膀胱癌细胞的新型微流控芯片的设计 新型微流控芯片的设计

膀胱癌主要发生在膀胱粘膜上,是泌尿系统常见的恶性肿瘤,其发病率和致死率较高.目前临床的技术手段对于膀胱癌的诊断和检测有诸多缺点和不足,例如检测过程有创伤,且敏感性和特异性均不高.本文设计并制备出一种新型的用于膀胱癌检测的微流控芯片,选取聚二甲硅氧烷作为芯片基片材料,采用模塑法制作芯片;使用硅烷化修饰在玻片上固定特异性抗体,并利用圆柱形阵列结构减缓流速以抓捕靶细胞.采用此芯片,从膀胱癌患者尿液样品中抓捕肿瘤细胞并经特异性荧光抗体进行鉴定.本文成功制备了无创膀胱癌检测的微流控芯片,为膀胱癌的检测和诊断提供了新的思路和有力的平台.

MMP-2、MMP-9与膀胱肿瘤关系的研究现状

膀胱肿瘤是临床中一种常见的疾病,占泌尿系肿瘤的第1位,其发生、发展和侵袭转移与其细胞外的微环境的改变有密切的联系.大量实验表明:膀胱癌细胞的分化,浸润及转移与其诱导产生基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)的能力密切相关,而其中的MMP-2和MMP-9参与降解细胞外基质(extracellular matrix,ECM)和基底膜(basement mambrance,BM)的主要成分Ⅳ型胶原,是为重要的两种水解蛋白酶,在癌细胞的侵袭和转移过程中有重要的作用.

人参皂苷Rg3诱导膀胱癌细胞系EJ的凋亡作用

目的:探讨Rg3抑制膀胱癌细胞的作用及其诱导凋亡的机制.方法:用一定质量浓度的Rg3处理膀胱癌细胞系EJ细胞,MTT法检测细胞增殖活力和抑制率50%的时候药物的浓度(IC50);Hoechst33258荧光染色观察凋亡细胞的形态;流式细胞仪分析细胞周期及细胞凋亡率;免疫细胞化学观察caspase-3的表达变化;琼脂糖凝胶电泳测定DNA梯状带.结果:Rg3抑制EJ细胞生长,呈浓度依赖关系,Rg3处理细胞48 h的IC50为125.5 mg·L-1;经150 mg·L-1Rg3处理细胞24 h和48 h后,观察到典型的凋亡细胞形态,即染色质凝集、核片段化、凋亡小体、核内致密的颗粒状荧光及caspase-3的表达增加;并呈时效依赖关系;用75 mg·L-1Rg3处理细胞24,48,150 mg·L-1的Rg3处理细胞48 h后,Rg3诱导了细胞凋亡和调节细胞周期,S期和G2/M期的细胞比率增加,G0/G1的细胞比率下降;凋亡率从对照组的(1.05±0.17)%分别上升到(8.41±0.98)%,(18.57±2.20)%和(33.98±1.64)%,琼脂糖凝胶电泳检测出典型的DNA梯形条带,其效应随药物浓度的增加和作用时间的延长而增强.结论:Rg3可通过诱导EJ细胞凋亡而发挥其抑制细胞增殖的作用.

槲皮黄酮对膀胱癌细胞抑制作用的机制研究

以BIU-87细胞为模型,探讨槲皮黄酮对膀胱癌细胞的抑制作用机制.体外培养人膀胱癌细胞株BIU-87,将不同浓度槲皮黄酮加入处于对数生长期的BIU-87细胞中共培养,采用CCK-8法检测槲皮黄酮对BIU-87细胞增殖的抑制作用;流式细胞仪检测分析槲皮黄酮诱导BIU-87细胞的凋亡作用和细胞周期;Western blot技术检测分析了细胞中抗凋亡蛋白Bal-2,Bal-xL的表达量及TAKl/JNK信号通路中蛋白的表达水平.CCK-8实验发现,不同浓度槲皮黄酮处理BIU-87细胞24 h或48h后,药物对BIU-87细胞增殖抑制作用均明显高于对照组(P＜0.05);流式细胞术结果显示,不同浓度槲皮黄酮对BIU-87细胞的凋亡率均显著高于对照组,呈剂量时间依赖性,细胞周期G0/G1期细胞逐渐减少,G2/M期细胞逐渐增多,S期细胞变化不明显;Western blot检测发现槲皮黄酮处理的BIU-87细胞中Bal-2,Bal-xL蛋白表达水平降低,并且p-TAK1,p-MKK4/7,p-JNK表达水平也降低.槲皮黄酮可抑制BIU-87细胞增殖,促进BIU-87细胞凋亡,其机制可能与抑制TAK1/JNK信号通路进一步降低了Bal-2,Bal-xL的表达有关.

肿瘤坏死因子凋亡诱导配体诱导膀胱癌EJ细胞凋亡的研究

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)是能够较特异性诱导肿瘤细胞凋亡的肿瘤坏死因子超家族成员,由于对正常组织不表现毒性[1],在肿瘤治疗方面得到广泛研究.我们对TRAIL诱导膀胱癌细胞EJ凋亡的作用进行了研究,现报告如下.

β-葡萄糖醛酸苷酶基因转染人膀胱癌细胞的生物学观察

β-葡萄糖醛酸苷酶(β-glucuroni-dase,βG)是一种酸性水解酶,参与机体的生理、病理及药物代谢等过程,能特异性水解葡萄糖醛酸苷的糖苷键,释放出葡萄糖醛酸和配基.

用端粒酶活性对循环中的膀胱癌细胞进行分子检测

8-Br-cAMP对膀胱癌细胞中c-erbB-2 c-myc表达的影响

目的探讨环腺苷酸(cAMP)类似物8-溴-环腺苷酸(8-Br-cAMP)对人原代培养的膀胱癌细胞中c-erbB-2、c-myc蛋白及mRNA表达的影响.方法原代培养膀胱癌细胞,采用完整细胞免疫组化、原位杂交方法检测膀胱癌细胞中c-erbB-2、c-myc蛋白及mRNA的表达.结果8-Br-cAMP处理后的膀胱癌细胞中c-erbB-2、c-myc蛋白及mRNA表达水平明显低于未处理组,两组相比差异均有统计学意义(P＜0.05).结论8-Br-cAMP可抑制膀胱癌细胞中c-erbB-2、c-myc蛋白及mRNA表达,进而抑制肿瘤细胞的分裂和增殖.

异丹叶大黄素下调XIAP基因的化疗增敏作用研究

目的 观察异丹叶大黄素(ISO)对膀胱癌细胞增殖及X染色体连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)的影响,并观察异丹叶大黄素对化疗药物多西他赛诱导膀胱癌细胞凋亡及其细胞毒性的增敏作用.方法 以异丹叶大黄素作用于人源性膀胱癌T24T细胞,以ATPase法检测异丹叶大黄素对膀胱癌细胞的细胞毒性,并以软琼脂集落形成实验,检测异丹叶大黄素对T24T增殖能力的影响.以逆转录-聚合酶链反应和蛋白质印迹法检测异丹叶大黄素对膀胱癌细胞X染色体连锁凋亡抑制蛋白基因表达的影响.以AT-Pase法、倒置显微镜下以及流式细胞仪分别观察检测异丹叶大黄素对多西他赛诱导的膀胱癌细胞凋亡和细胞毒性的影响.结果 异丹叶大黄素可显著抑制膀胱癌细胞的增殖和集落形成,其IC50约为(54.5±3.6)μmol·L-1.经蛋白印迹法和逆转录-聚合酶链反应法证实,异丹叶大黄素在作用于人源性膀胱癌T24T细胞后,其X染色体连锁凋亡抑制蛋白基因在蛋白和mRNA水平均显著性降低.经多西他赛处理T24T细胞后,IC50为(8.78±1.32)nmol·L-1;而联用异丹叶大黄素后,IC50仅为(1.02 ±0.38)nmol·L-1,两者之间有显著性差异(P＜0.01).经流式细胞仪检测,T24T细胞接受2.5 nmol·L 1多西他赛组凋亡率(21.07±2.79)％显著低于联用异丹叶大黄素治疗组的凋亡率(49.59±5.67)％ (P ＜0.01).结论 异丹叶大黄素可抑制膀胱癌细胞增殖,并可通过下调X染色体连锁凋亡抑制蛋白基因表达,显著增强多西他赛诱导的膀胱癌细胞凋亡,并增强细胞毒性.

淋巴毒素β受体活化对膀胱癌细胞NF-κB信号通路及细胞增殖的影响

目的 研究淋巴毒素β受体(LTβR)的活化对膀胱癌细胞株5637核转录因子-κB(NF-κB)信号通路及细胞增殖的影响.方法 以膀胱癌细胞株5637为研究对象,以配体淋巴毒素α1β2(LTα1β2)诱导LTβR信号活化.qRT-PCR检测NF-κB信号通路RelA、RelB mRNA,细胞因子LTα、LTβ、LIGHT、TNFα、IL-6、IL-1β mRNA和增殖相关基因细胞周期素D1(CyclinD1)、生存素(Survivin) mRNA的表达水平;WB法检测NF-κB经典信号通路活化状态;CCK-8法检测细胞增殖水平.结果 LTβR活化后,RelA mRNA表达上调2.5倍(P =0.003),TNFα、IL-1β、CyclinD1、Survivin mRNA出现不同程度的上调(均P＜0.05),随着LTβR表达下调,以上基因mRNA表达也下降(均P＜0.05);WB结果显示活化标志蛋白p-p65表达出现升高趋势(P＞0.05);与对照组相比,细胞增殖活性的差异未见统计学意义(P＞0.05).结论 活化LTβR可促进NF-κB经典信号通路主要成员RelA的表达和活化,并有可能通过上调促炎细胞因子TNFα、IL-1β的表达参与膀胱癌炎性微环境的形成;有利促增殖相关基因CyclinD1、Survivin的表达,但在细胞增殖水平上并未见明显效应.

紫甘薯花色苷对膀胱癌BIU87细胞增殖的影响及其机制探讨

目的 观察紫甘薯花色苷对膀胱癌BIU87细胞增殖的影响并探讨其机制.方法 从紫甘薯中提取花色苷的浓缩液,以不同浓度(100、200、400、800μg/ml)的花色苷干预BIU87细胞48h,通过细胞形态学观察以及细胞计数试剂盒(CCK-8法)检测花色苷对BIU87细胞的增殖抑制作用,流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡率.结果 形态学表现为随着花色苷浓度的升高BIU87细胞数量减少、细胞体积缩小、细胞间隙增大、细胞黏附性变差、细胞形态变形.CCK-8法检测显示不同浓度的花色苷对BIU87细胞均有显著的增殖抑制作用,100、200、400、800μg/ml的花色苷处理BIU87细胞48 h的吸光度(A)值分别为1.24±0.07、1.15±0.11、0.90±0.08、0.56±0.09,与对照组相比,差异均有统计学意义(均P ＜0.05).FCM结果显示,100、200、400、800μg/ml花色苷浓度组的凋亡率分别为7.31％、11.11％、25.96％、36.28％,随着花色苷浓度的升高,凋亡率逐渐增大.结论 紫甘薯花色苷可通过诱导细胞凋亡抑制膀胱癌BIU87细胞的增殖,且具有剂量-依赖性.

三氧化二砷对小鼠膀胱癌细胞系细胞内游离钙浓度影响的实验研究

目的:研究As2O3对小鼠膀胱癌细胞系WYH929肿瘤细胞内游离钙离子浓度的影响.方法:用钙离子荧光探剂Fura 2-AM,以荧光分光光度计检测As2O3对膀胱癌细胞内游离钙离子浓度的变化.结果:As2O3可以使肿瘤细胞[Ca2+]i水平明显升高,由88 nmol/L逐渐升高至230 nmol/L,存在明显的量效关系(P＜0.05),而与细胞外钙离子浓度变化无关(P＞0.05).结论:As2O3影响小鼠膀胱癌细胞株WYH929肿瘤细胞内钙稳态,诱导肿瘤细胞内钙离子浓度持续升高;这可能是其抗肿瘤,诱导肿瘤细胞凋亡作用的机制之一.

花色苷对膀胱癌细胞凋亡因子及蛋白Caspase-3的表达影响观察

目的 探讨花色苷对膀胱癌细胞凋亡因子和蛋白Caspase-3表达的影响.方法 利用PI染色流式细胞术和Western Blotting测定不同浓度花色苷对膀胱癌细胞凋亡因子和蛋白Caspase-3表达的影响.结果 各浓度花色苷诱导膀胱癌细胞的凋亡率与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05);各浓度的花色苷对蛋白Caspase-3的表达率均明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05).结论 花色苷可诱导膀胱癌细胞发生凋亡,作用机制与Caspase-3蛋白表达升高相关.

膀胱癌细胞中血管内皮生长因子表达分析

血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是特异性刺激内皮细胞增殖的一种细胞因子.可以被多种因素刺激活化,影响细胞生长、分化、存活及凋亡,具有重要的生理和病理作用[1].我们采用免疫组织化学技术检测膀胱癌中VEGF的表达,以研究该指标与膀胱癌发生发展的关系.

原苏木素B对膀胱癌细胞BTT和T24的增殖抑制作用

苏木为豆科云实属植物苏木（Caesalpinia sappan L）的干燥心材，具有行血祛瘀，消肿止痛的功能。近年来的研究结果表明，苏木提取物对多种肿瘤细胞具有显著的抑制作用［1-3］。原苏木素B是苏木中主要成分之一［4，5］，也是中国药典中苏木药材的质量标准检测指标［6］，目前尚未见到关于原苏木素B的抑癌作用报道，本文以小鼠膀胱癌细胞BTT和人膀胱癌细胞T24肿瘤细胞为靶细胞，观察离体条件下原苏木素B对靶细胞不同时间的抑制活性，以探讨原苏木素B的抗肿瘤生物活性。

3种作用机制不同的药物单独及联合作用于膀胱癌细胞的实验研究

目的 探讨3种作用机制不同的药物单独及联合作用于膀胱癌细胞的结果,为制定更加有效的预防膀胱癌术后复发的可行方案提供理论依据.方法 选用吡柔比星(THP)、羟基喜树碱(HCPT)和丝裂霉素C(MMC)3种作用机制不同的化疗药物,培养单药耐药T-24细胞(分别命名为T-24/THP、T-24/HCPT、T-24/MMC),分别单药、三药联合作用T-24细胞和耐药细胞,应用MTT法和凋亡检测试剂盒检测其抑制率和凋亡率,比较结果的差别.应用RT-PCR和电泳检测耐药细胞和T-24细胞的MDR-1的表达.后三药联合模仿单药进行耐药细胞的培养.结果 结果显示T-24/MMC对HCPT存在耐药性,T-24/THP对MMC存在耐药性(t检验P＜0.05),3种药物联合组对T-24细胞和耐药细胞的抑制效果明显高于单药组.RT-PCR的显示各耐药细胞均出现MDR-1表达,T-24细胞未见表达.三药联合模仿单药培养耐药细胞,无耐药细胞产生.结论 3种机制不同的药物联合应用能明显增加对膀胱癌细胞的抑制率和凋亡指数,并不易导致耐药膀胱癌细胞产生.

RI基因siRNA干扰质粒的构建及其对人膀胱癌细胞迁移和侵袭能力的影响

目的 构建核糖核酸酶抑制因子(RI)基因siRNA干扰质粒,并检测其对人膀胱癌细胞BIU-87迁移和侵袭能力的影响.方法 设计并构建针对RI基因mRNA的2个特异性siRNA表达载体和1个无同源性的阴性对照载体,经酶切和DNA测序鉴定后,转染BIU-87细胞,通过RT-PCR、Western blot和免疫细胞化学法检测干扰的有效性.光镜及HE染色观察细胞形态的改变,黏附试验、划痕试验和Transwell法检测细胞黏附、迁移和侵袭能力的变化,激光共聚焦显微镜观察细胞骨架微丝结构.结果 酶切和测序结果证明干扰质粒构建正确;转染特异性siRNA表达载体的BIU-87细胞RI蛋白的表达水平明显降低,对照组未发生明显改变;转染干扰质粒的细胞堆叠严重,细胞黏附能力显著降低,迁移和侵袭能力显著提高,细胞骨架微丝聚集,伸展出片状伪足.结论 已成功构建RI基因siRNA干扰质粒,其可显著提高膀胱癌细胞的迁移和侵袭能力,说明RI可作为抑制肿瘤迁移和侵袭的有效靶点.

P53基因质粒联合反义c-myc基因质粒对人膀胱癌细胞T24生长的影响

目的探讨P53基因质粒联合反义c-myc基因质粒对人膀胱癌细胞T24增殖及凋亡的作用.方法将可在真核细胞表达P53蛋白的质粒pCEP4P53和表达反义c-myc基因的质粒pCEP4ASCMH以转染试剂FuGENE6为介导,同时转染到人膀胱癌细胞T24中,经MTT检测、软琼脂集落生长、琼脂糖电泳等方法分析实验结果.结果 P53基因质粒联合反义c-myc基因质粒较单一基因质粒能更显著地抑制癌细胞的增长,并能引起癌细胞的凋亡;FuGENE6有助于提高质粒DNA的转染效率.结论 pCEP4P53基因质粒和反义c-myc基因质粒pCEP4ASCMH的协同作用,大大地促进了肿瘤细胞的凋亡,为人膀胱癌的基因治疗提供了新途径.

乙酰肝素酶siRNA对人膀胱癌T24细胞株侵袭能力的影响

目的:观察乙酰肝素酶(Heparanase,HPSE)小干扰R N A(small-interfering RNA,siRNA)对人膀胱癌细胞株侵袭力的影响.方法:体外化学合成一段乙酰肝素酶特异性小干扰RNA(siRNA)序列,以阳离子脂质体介导将不同浓度的siRNA转染至膀胱癌细胞系T24细胞中,应用逆转录—聚合酶链反应(RT-PCR)法检测转染前后T24细胞中HPSE mRNA表达,采用transwell小室侵袭试验测定肿瘤细胞的体外侵袭力.结果:转染HPSE siRNA可以显著降低T24细胞中的HPSE mRNA表达,HPA siRNA处理细胞48小时,与对照组相比,各有效浓度的HPSE siRNA可显著抑制T24细胞的体外侵袭能力(P＜0.05).结论:以siRNA阻遏乙酰肝素酶在膀胱癌细胞中表达可以成功地抑制膀胱癌细胞侵袭能力,通过应用RNA干扰技术等方法抑制乙酰肝素酶活性可能可以应用于临床治疗膀胱癌.

膀胱癌细胞来源外泌体的提取与鉴定

目的:提取并鉴定膀胱癌5637细胞来源外泌体.方法:收集膀胱癌5637细胞培养上清液,采用多步骤离心法提取膀胱癌5637细胞外泌体.透射电子显微镜观察外泌体形态及颗粒直径.Bradford法定量外泌体蛋白含量.蛋白质免疫印迹鉴定外泌体标志蛋白.结果:20mL5637细胞培养基可收集约50-80 μg外泌体.膀胱癌5637细胞来源外泌体呈典型的茶杯样形态,外泌体颗粒直径大约在30-150nm.膀胱癌5637细胞外泌体提取物中可检测到标志蛋白CD63、TSG101、Hsp70和Hsp90表达.结论:多步骤离心法可以用于提取膀胱癌5637细胞外泌体,为后续开展膀胱癌5637细胞外泌体作用与机制的研究奠定了基础.