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MicroRNA-30a在膀胱癌中的表达及作用
目的 探究微小RNA(miRNA)在人膀胱癌细胞系中的表达及其对人膀胱癌细胞增殖、凋亡及迁移侵袭能力的影响.方法 应用荧光实时定量PCR(qRT-PCR)法检测膀胱癌细胞系(5637和T24)和膀胱上皮永生化细胞(SV-HUC-1)中miRNA-30a的表达水平.通过对T24细胞转染miR-30a mimic和5637细胞转染miR-30a inhibitor上调或下调miR-30a的表达,并对其分别转染NC mimic和NC inhibitor作为对照.利用流式细胞技术、MTT法和Transwell法探究miR-30a的表达对膀胱癌细胞增殖、凋亡以及侵袭能力的影响.结果 在两种膀胱癌细胞系(5637和T24)中miRNA-30a的表达显著低于正常膀胱细胞系SV-HUC-1,并且在恶性度较高的T24膀胱癌细胞中其表达水平明显低于恶性度相对较低的5637细胞系.细胞转染72h后,miR-30a mimic组T24细胞OD值(0.83±0.09)明显低于NC mimic组(1.21±0.12)(P=0.003);miR-30a inhibitor组5637细胞OD值(1.28±0.14)高于NC inhibitor组(1.09±0.14)(P=0.019).miR-30a mimic组T24细胞凋亡率(21.27±2.42)%明显高于NC mimic组(10.61±1.29)%;miR-30a inhibitor组5637细胞凋亡率(6.78±2.57)%明显低于NC mimic组(13.42±1.40)%,差异均具有统计学意义(P=0.0002,P=0.0014).miR-30a mimic组穿膜细胞数(183.57±16.61)低于NC mimic组(465.80±9.20)(P<0.0001);miR-30a inhibitor组(581.25±11.02)高于NC mimic组(397.13±7.57)(P<0.0001).结论 miR-30a表达的上调能够抑制膀胱癌细胞的增殖,促进细胞的凋亡,并降低膀胱癌细胞的迁移及侵袭的能力.膀胱癌细胞中miR-30a的低表达可能与膀胱癌的发生发展及转移有关.
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表阿霉素-羧甲基葡聚糖磁性纳米颗粒的制备及其协同恒定外磁场体内外对人膀胱癌细胞增殖和凋亡的影响研究
目的 研究表阿霉素-羧甲基葡聚糖磁性纳米颗粒(EPI-CDMN)的制备方法,并分析外磁场协同EPI-CDMN对人体膀胱癌细胞(BIU-87)株的体内外增殖、凋亡的影响作用.方法 本研究采用氧化还原法制备EPI-CDMN并检测其化学性质,分成对照组、磁场组、EPI-CDMN组、磁场+EPI-CDMN组,观察各组细胞凋亡等指标的差异.结果 磁场组、EPI-CDMN组、磁场+EPI-CDMN组的BIU-87细胞生长抑制率、死亡率、凋亡率均显著高于对照组(P<0.05);磁场+EPI-CDMN组的BIU-87细胞生长抑制率、死亡率、凋亡率均显著高于磁场组、EPI-CDMN组(P<0.05);磁场组、EPI-CDMN组、磁场+EPI-CDMN组裸鼠移植瘤的瘤体平均重量、瘤体平均体积均显著低于对照组(P<0.05),磁场组、EPI-CDMN组、磁场+EPI-CDMN组裸鼠移植瘤的瘤体BIU-87细胞凋亡指数显著高于对照组(P<0.05);磁场+EPI-CDMN组裸鼠移植瘤的瘤体平均重量、瘤体平均体积均显著低于磁场组、EPI-CDMN组(P<0.05),磁场+EPI-CDMN组裸鼠移植瘤的瘤体BIU-87细胞凋亡指数显著高于磁场组、EPI-CDMN组(P<0.05).结论 外磁场协同EPI-CDMN对人体BIU-87细胞的杀伤作用显著的增强,为膀胱癌的磁导向靶向治疗提供了实验基础.
关键词： 表阿霉素-羧甲基葡聚糖磁性纳米颗粒 外磁场 膀胱癌细胞 -
siRNA干扰HMGB1表达对膀胱癌T24株细胞恶性生物学行为的影响及其可能的机制
目的:探讨高迁移率族蛋白1(high-mobility group box 1,HMGB1)对膀胱癌T24株细胞的增殖、凋亡及恶性生物学行为的影响及其潜在作用机制.方法:收集2014年12月至2016年1月期间重庆医科大学附属第一医院泌尿外科病区手术切除的20例膀胱癌以及相应癌旁组织,免疫组化方法检测膀胱癌和癌旁组织HMGB1表达差异;应用RNAi处理T24细胞并分为空白对照组(Blank)、阴性对照组(NC)和干扰组(siHMGB1);CCK-8、流式细胞术、划痕实验和Transwell侵袭实验分别检测HMGB1敲低后对T24细胞增殖、凋亡、周期、迁移以及侵袭能力的影响;Western blotting检测不同膀胱癌细胞株BIU-87和T24细胞的HMGB1表达水平以及敲低HMGB1对T24细胞恶性生物学行为相关蛋白的影响.结果:与癌旁组织相比,HMGB1在膀胱癌组织处于高表达状态[(67.33±4.91)vs (12.00±3.79),P＜0.05].与NC组和Blank组相比,siHMGB1组细胞增殖受抑制(P＜0.05);流式细胞术提示敲低HMGB1后细胞凋亡率增加,细胞周期阻滞在G0/G1期;划痕实验及Tran-swell侵袭实验显示,敲低HMGB1后细胞迁移(P＜0.05)以及侵袭[穿膜细胞数:(16.33±1.45)vs(35.00±1.53)、(34.00±2.08)个,均P＜0.05]能力减弱;Western blotting结果显示敲低后E-钙黏着蛋白表达上调(P＜0.05),N-钙黏着蛋白、波形蛋白、基质金属蛋白酶(metrix metalloproteinase,MMP)-2、MMP-9、细胞周期蛋白D1、c-Myc、β-联蛋白表达下调(均P＜0.05).结论:HMGB1可通过促进膀胱癌细胞EMT进而增强其恶性生物学行为,其机制可能是通过β-联蛋白信号通路介导.
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同步培养对提高细胞DNA电泳检测效果的影响
目前,对细胞凋亡检测的方法主要有细胞凋亡的形态学研究方法;细胞凋亡的生物化学研究方法;细胞凋亡的组织化学研究方法和细胞凋亡的分子生物学研究方法.生物化学研究方法中的琼脂糖凝胶电泳法是检测细胞凋亡较常用又经济快捷的检测方法[1～3].本实验用同剂量的茶多酚(tea polyphenols)诱导体外培养的膀胱癌EJ细胞凋亡,用琼脂糖凝胶电泳法为检测手段,比较同步法和非同步法培养EJ细胞凋亡后DNA的"梯形"带纹的检测效果有何不同,结果表明,同步培养可明显提高"梯状电泳"(DNA ladder)的质量.
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吐温80合并温热对EJ细胞PCNA和CyclinD1表达的影响
目的观察吐温80合并温热对人膀胱癌EJ细胞的PCNA和CyclinD1表达的影响.方法应用免疫细胞化学和Western-印迹法等方法,检测EJ细胞经吐温80合并41℃温热作用后不同时间(0 h、16 h)PCNA和CyclinD1表达的改变.结果免疫细胞化学和Western-印迹法检测结果显示,PCNA和CyclinD1在对照组均为强阳性;加热组和加药组表达略有减少;而吐温80合并温热作用后,人膀胱癌EJ细胞的PCNA和CyclinD1表达均受到显著的抑制.结论吐温80合并温热可显著降低人膀胱癌EJ细胞的增殖能力.
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p53基因质粒联合反义 c-myc 基因质粒治疗人膀胱癌作用机理的研究
目的：探索 p53基因质粒联合反义 c-myc 基因质粒治疗人膀胱癌的作用机理。方法将可在真核细胞表达 P53蛋白的质粒 pCEP4p53和表达反义 c-myc 基因的质粒 pCEP4ASCMH，以转染剂 FuGENE6为介导，同时转染到人膀胱癌 T24细胞中，经 DNA 测序、PCR-异双聚体 PAGE 电泳、Southern 印迹杂交、蛋白质印迹法、ELISA、Caspase-3活性检测等方法分析实验结果。结果DNA 测序结果表明，转染所用的 p53基因和反义 c-myc 基因的序列与文献报道一致，没有突变或失活等异常；PCR-异双聚体 PAGE 电泳证明 T24细胞的 p53基因发生了点突变；Southern 印迹杂交实验确证 p53基因和反义 c-myc基因经 FuGENE6介导转入靶细胞；蛋白质印迹法方法检测野生型 p53基因在靶细胞内表达 P53蛋白；ELISA 方法检测瘤细胞内 c-myc 基因表达产物的含量水平下降；Caspase-3活性检测结果表明其活性增加，表现为典型的凋亡特征。结论p53基因质粒联合反义 c-myc 基因质粒转染人 T24膀胱癌细胞能诱导典型的凋亡，为膀胱癌的基因治疗提供了新途径。
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血小板源性生长因子-DD通过Akt信号通路促进膀胱癌T24细胞增殖
目的 研究外源性血小板源性生长因子-DD( PDGF-DD)对膀胱癌T24细胞增殖及Akt信号转导通路的影响,阐述factor其诱导细胞增殖的机制.方法 外源性PDGF-DD蛋白作用T24细胞,采用MTT法分析细胞的增殖；流失细胞仪检测细胞周期的变化；Western blot法观测膀胱癌T24细胞Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR以及核因子NF-κB蛋白表达的变化.结果 PDGF-DD促进T24细胞的增殖,并且具有浓度依赖性；DNA合成前期(G0/G1期)细胞比例下降,合成期(S期)细胞比例上升；Akt、mTOR表达变化不明显,而p-Akt、p-mTOR及NF-KB p65的表达均上调.LY294002抑制P13 K/Akt及其下游靶位蛋白磷酸化；雷帕霉素和PDTC分别抑制p-mTOR和NF-κBp65的表达.结论 外源性PDGF-DD刺激T24细胞的增殖,其机制可能是通过Akt/mTOR和Akt/NF-κB两条独立的信号通路实现的.
关键词： 血小板源性生长因子-DD 膀胱癌细胞 Akt信号通路 -
高侵袭力及稳定高表达增强型绿色荧光蛋白的膀胱癌细胞株的建立
目的:建立具有高侵袭力及稳定高表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的膀胱癌细胞株. 方法:通过构建侵袭小室,以穿透人工基底膜、聚碳酸脂膜能力为依据,筛选从人膀胱癌细胞系EJ中筛选具有体外高侵袭能力的膀胱癌细胞亚系(EJ-m3).用pEGFP-C1转染人膀胱癌细胞系EJ及其高侵袭力亚系,经G418抗性筛选和96孔板有限稀释获得稳定高表达EGFP的单克降细胞株.并用流式细胞术检测EGFP表达率,通过细胞周期、生长曲线和体外侵袭实验,对转染和未转染EGFP的细胞生物学行为进行综合分析. 结果:筛选出了具有高侵袭力的膀胱癌细胞EJ-m3,并获得了稳定高表达EGFP的细胞株EJ- GFP和EJ-m3-GFP.该两株细胞EGFP的表达率均为99.9%,增殖指数、生长曲线和体外侵袭力与未转染前相似(P>0.05). 结论:用改良侵袭实验筛选膀胱癌细胞系的高侵袭力亚系的方法是可靠的.转染EGFP的细胞其生物学行为并未发生改变.所获得的具有高侵袭力和稳定高表达EGFP的膀胱癌细胞为膀胱癌侵袭及转移的研究提供了良好的实验平台.
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猪苓多糖对膀胱癌细胞钙离子浓度的影响
目的观察猪苓多糖对人T24膀胱癌细胞内钙离子(Ca2+)浓度的影响,探讨猪苓多糖抗癌机理.方法体外培养人T24细胞经钙荧光指示剂(calcium crimson-AM)负载后,用激光扫描共聚焦显微镜测定猪苓多糖作用前后细胞内Ca2+随时间的变化.结果猪苓多糖低剂量(0.2 mg*L-1)使T24细胞内Ca2+降低,高剂量(>1 mg*L-1)使T24细胞内Ca2+升高,后维持在高钙水平上.猪苓多糖主要促进细胞核内Ca2+升高,细胞浆Ca2+无明显改变.结论猪苓多糖可引起T24细胞内Ca2+水平的显著变化,而且这种变化主要表现在细胞核内,提示猪苓多糖可能有诱导细胞凋亡的作用.
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顺铂对T24膀胱癌细胞Keap1-Nrf2通路的影响
目的:探讨顺铂对人膀胱移行癌细胞(T24细胞)Keap1-Nrf2信号通路的影响.方法:分别将对照溶媒及浓度为0.1、1、10、30、90μg/mL顺铂溶液加入T24细胞进行培养24 h,用MTT法检测顺铂对T24细胞增殖抑制作用及半数抑制浓度IC50;对顺铂处理24 h后T24细胞胞质蛋白和细胞核蛋白进行提取,Western blotting分析T24细胞核内Nrf2蛋白表达情况,胞质Keap1蛋白表达情况和胞质典型二相酶GSTP1、NQO1的表达情况.结果:顺铂可明显抑制T24细胞增殖,半数抑制浓度IC50为37.74μg/mL;加入顺铂共培养后的T24细胞胞质Keap1蛋白表达量降低,核内Nrf2蛋白质、胞质内二相酶GSTP1、NQO1的表达量升高.结论:顺铂可激活Keap1-Nrf2信号通路,使T24细胞内Nrf2介导典型二相酶的表达升高.
关键词： 顺铂 Keap1-Nrf2通路 膀胱癌细胞 二相酶 -
二氯乙酸对膀胱癌细胞株T24增殖、凋亡的影响及其机制探讨
目的 观察二氯乙酸(DCA)对膀胱癌细胞株T24增殖、凋亡的影响,并探讨其相关机制.方法 培养T24细胞并随机分成4个组,其中实验1组、实验2组和实验3组分别加入含5、10、20 mmol/L DCA的培养基,对照组加入等量含0.1%DMSO的培养基.分别于给药24、48、72 h后采用MTT法检测细胞增殖能力.给药48 h后,行Hoechst33258荧光染色观察并计数凋亡细胞,采用JC-1染色法检测细胞线粒体膜电位,采用Western blotting法检测各组细胞中的Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白.结果 实验1、2、3组给药24、48、72 h细胞增殖能力均低于对照组,且随着DCA作用时间浓度增大、给药时间延长,细胞增殖抑制越明显(P均<0.05).实验1、2、3组凋亡细胞数均高于对照组,线粒体膜电位均低于对照组(P均<0.05).实验1、2、3组细胞中Bax、Caspase-3相对表达量高于对照组,Bcl-2相对表达量低于对照组(P均<0.05).结论 DCA可抑制膀胱癌细胞株T24的增殖并诱导其凋亡,推测作用机制与线粒体膜电位降低、Bcl-2表达下调及Bax、Caspase-3表达上调有关.
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Rv0652蛋白对膀胱癌细胞T24、J82、RT4增殖与凋亡的影响
目的 观察结核杆菌属PE_PGRS蛋白家族成员Rv0652对膀胱癌细胞T24、J82、RT4增殖与凋亡的影响.方法 在96孔板中接种膀胱癌T24、J82、RT4细胞悬液,每孔100 μL,含相应膀胱癌细胞5 000个.设空白组、Rv0652蛋白组和卡介苗组,分别加入DMEM培养液100 μL、含Rv0652 10 μg,/mL的DMEM培养液、含卡介苗1mg/μL的DMEM培养液,12、24、36、48 h采用CCK-8试剂盒测定OD值,计算细胞增殖率.另取膀胱癌T24、J82、RT4细胞接种于10 cm培养皿中,设空白组、Rv0652蛋白组和卡介苗组,分别加入DMEM培养液10 mL、含体外重组Rv0652 10 μg/mL的DMEM培养液、含卡介苗1 mg/μL的DMEM培养液,培养24 h后采用PI和FITC-AnnexinV双染色,流式细胞仪观察细胞凋亡情况.结果 随着培养时间延长,Rv0652蛋白组、卡介苗组膀胱癌细胞RT4、J82、T24增殖率逐渐下降(P均＜0.05);相同培养时间Rv0652蛋白组、卡介苗组细胞增殖率相比,P均＞0.05.Rv0652蛋白组、卡介苗组RT4、J82、T24细胞凋亡率均高于对照组(P均＜0.05);Rv0652蛋白组、卡介苗组相比,P均＞0.05.结论 Rv0652蛋白能抑制膀胱癌细胞T24、J82、RT4增殖,诱导细胞凋亡,效果与卡介苗类似.
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和厚朴酚促膀胱癌细胞周期停滞及诱导细胞凋亡的机制研究
目的:研究和厚朴酚对膀胱癌细胞的生长抑制作用.方法:采用人类膀胱癌细胞BIU87,以和厚朴酚进行细胞毒性实验,设定不同药物浓度,经过24、48、72 h药物作用,观察细胞生长和死亡状态;药物作用24 h,进行流式细胞术检测,观察细胞在不同药物浓度作用下的细胞生长周期变化;细胞经过药物作用72 h,观察细胞在不同药物浓度作用后克隆细胞团数量;细胞加入荧光标记物,选取不同浓度药物各作用1h,采用流式细胞仪检测该药物是否促进细胞产生氧自由基以杀伤肿瘤细胞;提取经不同药物浓度作用后的细胞蛋白质,采用蛋白质印迹法检测细胞凋亡蛋白和信号通路的蛋白表达变化情况.结果:该药物对细胞有明显的生长抑制作用;随着浓度的增高,细胞G1期和SubG1期比例逐渐增高,细胞克隆团数量呈递减趋势;细胞在药物作用下有明显的Caspase3、PARP、CyclinD1、Cdk2、P21、P27、Bax/Bcl-2、Bcl-xL的趋势性表达,同时和厚朴酚促进细胞产生活性氧自由基,激活细胞内MAPK信号通路的转导,导致肿瘤细胞死亡.结论:和厚朴酚对人类膀胱癌细胞BIU87具有明显的生长抑制作用,该药可使细胞生长在G1期停滞并诱导细胞凋亡,并通过产生活性氧自由基,激活MAPK信号通路相关蛋白的表达,抑制肿瘤细胞生长.
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LAMP1在膀胱癌细胞中的表达及对肿瘤细胞迁移的影响
目的:探讨溶酶体膜相关蛋白LAMP1(Lysosomal-associated membrane proteins 1,CD107a)在膀胱癌细胞系和正常膀胱上皮细胞系中表达情况,检测其与膀胱癌细胞迁移关系,推测其对膀胱癌进展的影响.方法:采用RT-PCR检测正常膀胱上皮细胞系和膀胱癌细胞系LAMP1表达;免疫荧光明确其蛋白表达定位;采用RNAi方法对LAMP1敲减,然后通过划痕实验检测其对肿瘤细胞迁移影响.结果:膀胱癌细胞系5637和UM-UC3均表达LAMP1,正常移行上皮细胞系SV-HUC-1不表达;LAMP1蛋白定位在肿瘤细胞胞浆中;LAMP1敲减后膀胱癌细胞迁移减慢.结论:LAMP1参与膀胱癌发生发展过程,促进癌细胞迁移.
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膀胱癌细胞染色质重塑异常与基因组不稳定性研究进展
膀胱癌是泌尿系统常见的恶性肿瘤之一.在我国,其发病率和死亡率均居泌尿系统肿瘤首位.近十多年来,我国膀胱癌的发病呈现出逐年上升和年轻化的趋势[1].许多患者就诊时已属中晚期,术后复发率高,对放疗及化疗敏感性差,生存期短,导致治疗效果不佳的主要原因是膀胱癌的发病机制尚未完全明确[2].染色质重塑是指细胞在生长和增殖过程中,由于表观遗传改变导致的染色质位置和结构的变化,其过程异常与肿瘤的发生及发展密切相关.肿瘤是随着关键基因的突变逐步发展的,体细胞突变频率很低,并不容易积累足够使细胞发生癌变的突变.因此,基因组不稳定是肿瘤发生过程早期的重要事件.近年来,染色质重塑异常与基因组不稳定性及其在肿瘤发生和发展过程中的作用机制已逐渐成为研究的热点.本文就膀胱癌中染色质重塑相关基因的突变及其与基因组不稳定的关系等方面的研究进展作一综述.
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吡柔比星通过抑制雷帕霉素信号通道的哺乳动物靶点引发人膀胱癌细胞自体吞噬反应
目前吡柔比星广泛用于膀胱灌注治疗膀胱癌,但是其疗效因耐药性会受到一定的影响,目前吡柔比星的作用机制还没得到完全的阐述。本研究通过吡柔比星、siRNA 和3-甲基腺嘌呤或羟氯喹处理膀胱癌细胞 EJ、J82,采用细胞活力分析仪和流式细胞仪分别检测膀胱癌细胞的增殖和凋亡。处理前后通过免疫印迹法评估自体吞噬情况,同时检测雷帕霉素的磷酸化哺乳动物靶点、p70核糖体蛋白 S6激酶和真核起始因子4E 结合蛋白,旨在研究自体吞噬在膀胱癌吡柔比星灌注治疗中的作用。
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siRNA沉默DNA甲基转移酶1基因对膀胱癌细胞T24细胞周期、增殖及凋亡的影响
膀胱癌的发生与抑癌基因的失活有关,抑癌基因甲基化是其失活的萤要机制之一.DNA甲基转移酶1(DNMT1)的表达直接影响着DNA甲基化状态.我们应用RNAi技术将针对DNMT1基因的siRNA转染入膀胱癌细胞T24内,观察其对DNMT1基因的沉默作用以及对T24细胞周期、增殖和凋亡的影响,探讨DNMT1基因与膀胱癌发生之间的关系.
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磷酸酶基因上调BIU-87细胞中p53蛋白表达水平并增强其对化疗药物的敏感性
张力蛋白同源、第10号染色体丢失的磷酸酶基因(PTEN)失活是否参与了化疗耐药的形成,目前报道尚少.本研究通过脂质体介导法将野生型PTEN基因(WT-PTEN)与两种突变型PTEN基因:G129E-PTEN(无脂质磷酸酶活性而保留蛋白磷酸酶活性)、C124A-PTEN(无磷酸酶活性)分别导入携带野生型p53基因的人膀胱癌细胞株BIU-87,研究PTEN在膀胱癌细胞中的作用.
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血管内皮生长因子siRNA联合丝裂霉素诱导膀胱癌细胞凋亡的研究
血管内皮生长因子(VEGF)是目前发现强效的促血管生长因子,也是目前肿瘤治疗的理想靶点[1,2].本研究旨在观察利用小干扰RNA技术下调VEGF表达与丝裂霉素(MMC)联合应用对膀胱癌细胞增殖和凋亡的影响.
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重组转化生长因子-毒素蛋白对膀胱癌的作用及机制
基因重组转化生长因子α-绿脓杆菌外毒素融合蛋白(TGFα-PE40,简称TP140)对人膀胱癌细胞的生长具有剂量、时间依赖性抑制作用[1].本研究旨在探讨该抑制作用的机制.
