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β-catenin特异的shRNA干扰对K562细胞作用的初步研究
本研究在探讨β-联蛋白(β-catenin)序列特异的小发夹RNA(shRNA)干扰其表达后对K562细胞生长的影响.采用脂质体介导方法,将含编码β-联蛋白特异的shRNA的质粒转入K562细胞,经G418筛选提高细胞阳性率,用实时定量PCR和Western blot分别检测干扰后β-联蛋白转录水平及蛋白水平的表达变化,通过绘制生长曲线、MIT测定及集落培养等方法观察干扰后细胞生长能力的差别.结果发现:与对照组相比,转染后72小时干扰质粒可有效降低K562细胞β-联蛋白mRNA水平的表达(p＜0.05),但短期培养对蛋白水平的表达未发现明显影响.经G418长期筛选后,对照组可见细胞阳性率逐渐提高,并可筛选到几近100%阳性的细胞克隆,而干扰组细胞则逐渐死亡.在G418存在下,干扰组与对照组K562细胞短期增殖曲线及MIT结果显示两组间无明显差异,但集落培养发现,干扰组细胞无论集落形成率(p＜0.001)还是形成的集落大小均明显低于对照组,说明干扰质粒可影响细胞的集落形成能力.结论:β-联蛋白特异的shRNA干扰可以有效降低K562细胞中β-catenin基因的表达,降低细胞集落形成能力;K562细胞的生长依赖于β-联蛋白的存在,针对β-联蛋白的RN Ai治疗或其它靶向治疗可能对CML治疗有效.
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无翅型MMTV整合位点家族成员3在大鼠牙囊及牙囊细胞成骨分化中的表达
目的 研究无翅型MMTV整合位点家族成员3(wingless-type MMTV integration site family,member 3,Wnt3)在大鼠体内外牙囊中的表达,检测成骨诱导后Wnt3在大鼠牙囊细胞中的表达变化,探讨Wnt3在牙囊成骨分化中的作用.方法 取出生后1、3、5、7、9、11、13 d的SD仔鼠各1只,引颈处死,切取下颌骨,取出生后各时间点的组织切片各3张作为实验组,阴性对照组以磷酸盐缓冲液代替一抗,滴加在出生后11d的组织切片上,其余处理同实验组.免疫组化检测Wnt3在大鼠体内牙囊中的表达.间接免疫荧光检测Wnt3在牙囊细胞内的表达和分布.茜素红染色检测成骨诱导后矿化结节的形成.蛋白质印迹法检测成骨诱导1、2、3周后牙囊细胞中Wnt3和β-联蛋白(β-catenin)表达的变化.结果 Wnt3在出生后第1、3天的大鼠牙囊组织内无明显表达,第5天开始出现阳性表达,并持续表达至第13天.免疫荧光检测显示Wnt3在牙囊细胞胞质中表达.成骨诱导后牙囊细胞分化为成骨细胞,形成矿化结节,茜素红染色阳性.成骨诱导第1周Wnt3蛋白表达(2.60±0.04)较阴性对照组(1.00±0.00)显著增加(P＜0.05),并随着诱导时间的延长Wnt3表达逐渐减少,至第3周Wnt3在成骨诱导组表达水平(1.00±0.05)与阴性对照组基本相等,差异无统计学意义(P＞0.05).β-联蛋白在成骨诱导1、2、3周后表达增加(分别为1.95±0.05、9.77 ±0.65、1.75±0.21),与阴性对照组(1.00 ±0.00)相比差异均有统计学意义(P＜0.05),并在第2周达峰值(9.77±0.65),后逐渐降低.结论 Wnt3在体内外大鼠牙囊中表达,成骨诱导早期牙囊细胞中Wnt3表达明显增加,提示Wnt3可能参与牙囊细胞的早期成骨向分化；Wnt3和β-联蛋白在成骨诱导过程中表达水平的差异提示Wnt3可能与其他因子或信号通路成分相互作用,调控β-联蛋白的表达,参与牙囊细胞的成骨向分化.
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喹啉酸对PC12细胞自噬发生及相关信号通路蛋白表达的影响
目的：探讨喹啉酸（QA）是否引起大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤PC12细胞自噬的发生及其与糖原合酶激酶-3β（GSK-3β）/β-联蛋白相关信号通路的关系。方法用不同浓度QA（2.5，5和10 mmol·L-1）处理PC12细胞24 h，MTT法测定细胞存活，免疫荧光法观察微管相关蛋白1轻链3（LC3）荧光斑点标记的自噬体形成，Western蛋白印迹法检测细胞GSK-3β、β-联蛋白、LC3和Beclin 1的表达。结果 QA作用24 h，可浓度依赖性地降低PC12细胞存活率，IC50为8.7 mmol·L-1。QA作用24 h，与正常对照组比较，PC12细胞内LC3荧光斑点标记的自噬体增多，自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值和Beclin 1表达增高（P<0.01）；同时PC12细胞内GSK-3β的表达增加（P<0.05，P<0.01），β-联蛋白的表达降低（P<0.05，P<0.01）。结论 QA可诱导PC12细胞自噬的发生，其机制可能与GSK-3β/β-联蛋白相关的信号通路激活有关。
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人类表皮生长因子受体2和β-联蛋白在食管癌中的表达及其意义
目的：探讨人类表皮生长因子受体2（HER2）和β-联蛋白（β-catenin）在食管癌中的表达及意义。方法用免疫组织化学方法检测食管癌组织、远癌组织中 H ER2和β-catenin的蛋白表达。结果 H ER2在食管癌组织中未见强阳性表达，β-catenin在食管癌组织中呈异常表达，二者在食管癌中的表达无明显相关关系。结论HER2在食管癌组织中有表达，但其表达强度未达到赫赛汀靶向治疗的标准；β-catenin在食管癌中有异常表达，提示其有可能在食管癌的发生发展中发挥重要作用，并可能成为判断食管转移及预后的指标之一，两者在食管中表达无明显相关性。
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支气管肺泡灌洗液中β-联蛋白、转化生长因子β1、Clara细胞分泌蛋白16、Ⅱ型肺泡细胞表面抗原6在支气管肺发育不良中的表达及意义
目的 探讨β-联蛋白、转化生长因子β1(TGF-β1)、Clara细胞分泌蛋白16(cc16)、Ⅱ型肺泡细胞表面抗原6(KL-6)在支气管肺发育不良(BPD)患儿支气管肺泡灌洗液(BALF)中的表达及其意义.方法 机械通气早产儿70例,其中40例诊断为BPD的患儿作为观察组,30例非BPD患儿作为对照组.采用酶联免疫吸附试验法检测两组患儿机械通气1、24、48、72 h BALF中β-联蛋白、TGF-β1、cc16、KL-6水平.结果 观察组平均胎龄及出生体质量显著低于对照组,差异有统计学意义(P＜0.05),吸氧时间及机械通气时间显著长于对照组,差异有统计学意义(P＜0.01).随机械通气时间的延长,观察组cc16水平呈逐渐降低趋势,而β-联蛋白、TGF-β1、KL-6水平呈逐渐升高趋势,且48、72 h时均与1h时各指标水平差异有统计学意义(P＜0.01).对照组TGF-β1、cc16于机械通气72 h时与1h时水平差异有统计学意义(P＜0.01),而β联蛋白、KL-6水平在各时间点的差异均无统计学意义(P＞0.05).观察组机械通气各时间点β-联蛋白、TGF-β1水平均显著高于对照组各相应时间点指标水平,cc16显著低于对照组水平,差异有统计学意义(P＜0.05),而KL-6在机械通气48、72 h时高于对照组相应时间点,差异有统计学意义(P＜0.05),余时间点差异无统计学意义(P＞0.05).各时间点比较,BPD中重度组β-联蛋白、TGF-β1、KL-6水平均显著高于轻度组,差异有统计学意义(P＜0.05),而cc16水平显著低于轻度组,差异有统计学意义(P＜0.05).多元逐步回归分析结果显示,机械通气时间、吸氧时间的延长及低cc16水平是BPD发生的危险因素(P＜0.01).结论 机械通气早产儿BPD的发生与机械通气、吸氧时间的延长及低cc16水平密切相关,通过监测早产儿初始机械通气BALF中β-联蛋白、TGF-β1、cc16水平可对早产儿BPD的发生提供预测依据.
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β-联蛋白在恶性胸膜间皮瘤组织的表达及其对肿瘤的抑制作用
目的:探讨β-联蛋白在恶性胸膜间皮瘤组织的表达及其对肿瘤抑制作用.方法:应用AnnexinV和TUNEL法分别检测转染野生型β-联蛋白(β-CAT-V5-FP)和突变型β-联蛋白(β-CAT-S37C-V5-FP)诱导恶性胸膜间皮瘤NCI-H28细胞凋亡;采用体外细胞培养法,研究β-联蛋白基因对肿瘤的抑制作用.结果:转染野生型β-联蛋白和突变型β-联蛋白的细胞凋亡率与转染空白载体组比较均有明显的增高.转染羧基端缺失的β-联蛋白基因也可导致细胞凋亡,但与转染野生型β-联蛋白(β-CAT-V5-FP)和突变型β-联蛋白(β-CAT-S37C-V5-FP)的细胞相比明显减少.结论:β-联蛋白基因在非上皮性肿瘤--恶性胸膜间皮瘤中也可诱导细胞凋亡.
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分泌型卷曲相关蛋白/β-联蛋白信号通路对脂肪形成的影响
目的:探讨分泌型卷曲相关蛋白(sFRP5)和经典Wnt信号通路在脂肪细胞形成中的作用及机制.方法:诱导3T3-L1前体脂肪细胞分化,用过表达sFRP5的携带绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒(Ad-sFRP5-GFP)感染3T3-L1细胞并诱导成熟,利用实时荧光定量PCR检测经典Wnt下游靶基因和脂肪分化相关基因mRNA水平的变化.3T3-L1细胞分化成熟后,进行油红染色,观察过表达sFRP5对脂滴形成的影响;提取核浆蛋白,用蛋白质印迹法检测sFRP5对β-联蛋白核转位的影响.结果:3T3-L1细胞分化成熟后期,sFRP5 、CCAAT增强子结合蛋白α(C/EBPα)、过氧化物酶体增殖物活化受体γ2 (PPARγ2)表达均显著增加,同时,细胞周期蛋白D1表达显著下调.而诱导分化成熟后,过表达sFRP5的3T3-L1细胞周期蛋白D1无显著改变.与空载对照组相比,过表达sFRP5的3T3-L1细胞脂滴形成无明显变化.给予3T3-L1细胞重组小鼠sFRP5直接刺激或感染Ad-sFRP5-GFP,均未明显改变β-联蛋白核转位.结论:sFRP5的表达随着脂肪细胞分化而显著增加,但不影响体外脂肪细胞分化,sFRP5在体外不直接通过拮抗Wnt/β-联信号通路的方式发挥作用.
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siRNA干扰HMGB1表达对膀胱癌T24株细胞恶性生物学行为的影响及其可能的机制
目的:探讨高迁移率族蛋白1(high-mobility group box 1,HMGB1)对膀胱癌T24株细胞的增殖、凋亡及恶性生物学行为的影响及其潜在作用机制.方法:收集2014年12月至2016年1月期间重庆医科大学附属第一医院泌尿外科病区手术切除的20例膀胱癌以及相应癌旁组织,免疫组化方法检测膀胱癌和癌旁组织HMGB1表达差异;应用RNAi处理T24细胞并分为空白对照组(Blank)、阴性对照组(NC)和干扰组(siHMGB1);CCK-8、流式细胞术、划痕实验和Transwell侵袭实验分别检测HMGB1敲低后对T24细胞增殖、凋亡、周期、迁移以及侵袭能力的影响;Western blotting检测不同膀胱癌细胞株BIU-87和T24细胞的HMGB1表达水平以及敲低HMGB1对T24细胞恶性生物学行为相关蛋白的影响.结果:与癌旁组织相比,HMGB1在膀胱癌组织处于高表达状态[(67.33±4.91)vs (12.00±3.79),P＜0.05].与NC组和Blank组相比,siHMGB1组细胞增殖受抑制(P＜0.05);流式细胞术提示敲低HMGB1后细胞凋亡率增加,细胞周期阻滞在G0/G1期;划痕实验及Tran-swell侵袭实验显示,敲低HMGB1后细胞迁移(P＜0.05)以及侵袭[穿膜细胞数:(16.33±1.45)vs(35.00±1.53)、(34.00±2.08)个,均P＜0.05]能力减弱;Western blotting结果显示敲低后E-钙黏着蛋白表达上调(P＜0.05),N-钙黏着蛋白、波形蛋白、基质金属蛋白酶(metrix metalloproteinase,MMP)-2、MMP-9、细胞周期蛋白D1、c-Myc、β-联蛋白表达下调(均P＜0.05).结论:HMGB1可通过促进膀胱癌细胞EMT进而增强其恶性生物学行为,其机制可能是通过β-联蛋白信号通路介导.
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川芎嗪激活Wnt信号通路改善阿尔茨海默病大鼠脑组织炎性研究
目的：探讨川芎嗪是否能通过激活Wnt信号通路改善阿尔茨海默病（AD）大鼠脑组织炎性，并探讨其作用机制。方法采用β淀粉样肽25-35（Aβ25-35）双侧海马注射造阿尔茨海默病大鼠模型，观察川芎嗪对AD大鼠海马tau蛋白上部分磷酸化位点及β淀粉样蛋白（Aβ）前体APP水平的影响，Wnt途径中β-联蛋白（β-catenin）和糖原合成激酶3β（GSK-3β）水平，同时采用免疫组化技术测定4组AD大鼠海马Aβ沉积程度。结果模型组大鼠单侧大脑皮质区Aβ沉积明显，镜下可见细胞间隙呈褐色改变。而经川芎嗪干预后，褐色成分逐渐减少，川芎嗪可显著抑制Aβ沉积，显著抑制tau磷酸化，抑制GSK-3活性，减少β-catenin降解。结论 TMP通过对AD大鼠海马组织GSK-3β阳性表达的抑制、导致β-catenin降解下降，从而抑制tau蛋白过度磷酸化，并可激活Wnt信号通路抑制Aβ蛋白引起神经毒性，从而发挥神经细胞保护作用。
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β-catenin和WT1在子宫间叶性肿瘤中的表达和临床意义
目的 探讨β-联蛋白(β-catenin)和WT1在子宫间叶性肿瘤中的表达及其临床意义.方法 采用免疫组织化学EnVision染色法对25例子宫内膜间质肉瘤、9例平滑肌肉瘤、16例平滑肌瘤(包括7例高度富于细胞平滑肌瘤)、8例正常子宫肌壁和6例正常子宫内膜中的β-catenin和WT1的蛋白表达水平进行检测.结果 β-catenin在子宫内膜间质肉瘤细胞核表达的阳性率高于平滑肌肉瘤(P=0.004)和平滑肌瘤(P<0.001).正常子宫肌壁平滑肌细胞细胞核中无β-catenin表达.WT1阳性表达见于正常子宫内膜的间质细胞、子宫肌壁的平滑肌细胞和平滑肌瘤细胞.WT1在平滑肌肉瘤和子宫内膜间质肉瘤的肿瘤细胞中的表达强度较平滑肌瘤细胞减弱(P分别为0.007和0.002).结论 β-catenin和WT1表达可能与子宫恶性间叶性肿瘤,尤其是子宫内膜间质肉瘤的发生和发展有关.细胞核的β-catenin蛋白表达有助于子宫内膜间质肉瘤与平滑肌肿瘤的鉴别诊断.
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RNAi对波动性葡萄糖诱导的人脐静脉内皮细胞糖原合成酶激酶-3β、β-联蛋白作用的研究
目的 构建糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase 3β,GSK-3β)特异的RNAi腺病毒表达载体,感染原代人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC),观察其对波动性浓度葡萄糖溶液诱导的HUVEC Wnt信号通路中GSK-3β、β-联蛋白(β-catenin)的影响.方法 设计合成针对GSK-3βmRNA不同位点的短发荚RNA(short hairpin RNA,shRNA)编码序列,重组RNAi腺病毒表达载体.实验分为3组,空白对照组、阴性对照组、实验组.空白对照组使用波动性浓度葡萄糖溶液(5.5 mmol/L和30.5 mmol/L两种浓度的葡萄糖溶液每日交替培养,模拟血液中葡萄糖浓度的波动)培养HUVEC;阴性对照组使用波动性浓度葡萄糖溶液培养HUVEC,并使用无携带GSK-3β 基因的腺病毒感染培养的HUVEC;实验组使用波动性浓度葡萄糖溶液培养HUVEC,并GSK-3β 特异的RNAi腺病毒感染培养的HUVEC.Western印迹法波动性浓度葡萄糖溶液干预前及干预后72小时3组的GSK-3β、β-联蛋白水平.结果 波动性浓度葡萄糖溶液干预72小时后,实验组的GSK-3β 表达水平(0.1068±0.0034)较空白对照组、阴性对照组低,差异有统计学意义(F=10886.388,P=0.000);实验组的 β-联蛋白水平表达水平(0.6653±0.0167)较空白对照组、阴性对照组低,差异有统计学意义(F=315.96,P=0.000).结论 构建的RNAi腺病毒感染HUVEC后可以抑制高糖诱发的GSK-3β 蛋白表达、增加细胞内 β-联蛋白的蛋白水平.
