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上调RI对小鼠黑色素瘤B16-F10细胞EMT及转移的影响
目的 研究核糖核酸酶抑制因子基因表达对小鼠黑色素瘤B16-F10细胞EMT及转移的影Ⅱ向.方法 构建RI真核表达质粒pIRES2-EGFP-RI,稳定转染B16-F10细胞.RT-PCR 、Western blot和免疫荧光检测RI的表达;HE染色及相差显微镜观察细胞形态;FITC标记的鬼笔环肽染色,激光共聚焦观察细胞骨架;黏附实验、划痕实验和Transwell法检测细胞黏附、迁移和侵袭能力的变化;Western blot检测EMT及转移相关蛋白的表达;分别将各组B16-F10细胞眼眶静脉注射到c57/BL小鼠,建立肺转移动物模型,注射3周后处死小鼠.取肺称重,在解剖镜下计数肺转移结节数;肺组织切片HE染色观察肿瘤细胞转移;免疫组化检测肺转移瘤组织中转移及EMT相关蛋白的表达.结果 RI表达上调后,细胞由间质型向上皮型转换,细胞骨架重排;B16-F10-RI细胞组黏附、迁移和侵袭能力下降;与对照组相比,B16-F10-RI细胞中MMP2、MMP9、snail、slug、vimentin、twist和N-cadherin的表达明显降低,而E-cadherin,nm23-H1蛋白的表达明显增加(P＜0.01或P＜0.01).实验组与对照组比小鼠肺的转移结节明显减少,同时EMT及转移相关蛋白在瘤组织中表达与体外细胞一致.结论 上调核糖核酸酶抑制因子能够显著抑制B16-F10细胞EMT及侵袭、转移,RI可望作为治疗黑色素瘤的靶蛋白.
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核糖核酸酶抑制因子在肺癌中的表达
目的:通过核糖核酸酶抑制因子(ribonuclease inhibitor,RI)基因在人肺癌及同体癌旁正常肺组织中的表达的检测,进一步探讨RI与恶性肿瘤细胞生长的关系.方法:应用Western blotting方法检测人肺癌组织中RI的蛋白表达量;应用RT-PCR的方法检测人肺癌组织中RI的mRNA的表达量.采用χ2检验(chi-square test)分析获得的数据,用SPSS10.0统计软件进行处理.结果:人肺癌组织中RI的蛋白及mRNA的表达均明显低于同体癌旁正常肺组织.结论:核糖核酸酶抑制因子(RI)在肺癌中的表达下调,肺癌的生长可能与RI表达的下调有关.
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人参皂甙Rg3和核糖核酸酶抑制因子转基因对小鼠黑色素瘤的抑制作用研究
目的观察人参皂甙Rg3和核糖核酸酶抑制因子(RI)转基因对小鼠B16黑色素瘤肺转移的抑制作用和影响,探讨人参皂甙Rg3和RI抗肿瘤生长和转移作用的分子机制.方法制备转RI基因的B16黑色素瘤肺转移小鼠模型,对野生型对照组(W组)、空质粒转染组(B组)和RI转基因组(RI组)以及给予Rg3的野生型对照组(Rg3/W组)、空质粒转染组(Rg3/B组) 和RI转基因组(Rg3/RI组)中,荷瘤小鼠肺重量、肿瘤转移灶数目、生存期和肿瘤组织微血管密度进行检测和分析.结果 Rg3和RI转基因使荷瘤小鼠肺重量降低,肿瘤转移灶数目减少,其肺重量降低和肿瘤转移灶数目减少的程度以Rg3/RI组明显,Rg3/B组、Rg3/W组和RI组次之,与W组和B组差异有显著性(P<0.01),Rg3和 RI有一定的协同性.Rg3和RI可延长荷瘤小鼠的生存期, Rg3/RI组小鼠在观察期(1.5个月)内均存活, W组和B组小鼠全部死亡(至26 d), 且出现死亡的时间较早.经HE染色和第Ⅷ因子相关抗原的免疫组化分析显示, Rg3和RI使肺内瘤组织的微血管密度降低, 降低的程度为Rg3/RI组>Rg3/B组>Rg3/W组>RI组>B组>W组.结论人参皂甙Rg3可增强RI转基因对小鼠黑色素瘤肺转移的抑制作用,人参皂甙Rg3和RI基因在抗肿瘤生长、转移及血管生成方面有协同作用.
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核糖核酸酶抑制因子的研究进展
核糖核酸酶抑制因子(RI)是一种存在于胞浆中的酸性糖蛋白,它广泛存在于哺乳动物的组织器官中,以人胎盘组织中含量丰富.目前,对于RI的应用已越来越受到人们的关注.本文对近年来所研究的核糖核酸酶抑制因子的结构、功能、作用机制及其应用进行综述.
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逆转录病毒载体介导hRI在小鼠模型中抑制黑色素瘤生长的研究
目的 以C57BL/6J小鼠皮下接种B16黑色素瘤为模型,研究载有抗血管生成序列的逆转录病毒载体的基因治疗系统,对黑色素瘤的抗肿瘤效应及其对血液的近期影响.方法 携带hRI的cDNA序列的重组转录病毒pLNCX-hRI颗粒被浓缩和纯化后,以空载体病毒颗粒及生理盐水为对照,静脉注射于肿瘤模型小鼠体内.检测目的基因在小鼠体内各脏器的表达水平,其对肿瘤生长的抑制作用,以及血液生化和细胞指标.结果 转染后hRI基因的表达抑制了肿瘤生长,同时在观察期内无血液指标的改变.结论 携带hRI基因的逆转录病毒载体基因治疗系统,可以在体内实现对B16黑色素瘤的抑制作用.
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间接ELISA法测定转基因小鼠血清中核糖核酸酶抑制因子的表达
[目的] 建立间接ELISA法测定血清中核糖核酸酶抑制因子(ribonuclease inhibitor,RI)含量的方法,并测定在转RI基因小鼠血清中RI的表达情况.[方法] 用血清样品包被酶标板,兔抗人 RI抗体为一抗,辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG为二抗,建立血清RI定量检测的间接ELISA法;取转染了RI基因的小鼠的血清,用上述建立的间接ELISA法测定不同时相小鼠血清中RI的表达水平.[结果] 定量检测血清RI的间接ELISA法适反应条件为一抗佳稀释度为1∶4000,二抗的佳稀释浓度为1∶2000.转基因小鼠第2、3周血清中RI含量较低(0.556±0.080),1个月左右达到高值(0.836±0.113),3个月时明显下降(0.640±0.100).[结论] 间接ELISA法可以用于测定血清中的RI抗原含量.
关键词： 核糖核酸酶抑制因子 间接酶联免疫吸附试验 血管生长因子 -
核糖核酸酶抑制因子的提纯及抗血清制备
核糖核酸酶抑制因子(Ribonuclease Inhibitor，RI)是一种存在于胞浆中的酸性糖蛋白，分子量为50 kDa。RI是核糖核酸酶(RNase)的抑制剂，它与RNase紧密结合，形成马蹄形的立体结构。在RI的结构中，有11对二硫键和8个游离的巯基。巯基是RI的活性必需集团，巯基的氧化会导致RI的失活。作为RNase的抑制剂，RI在体外实验中可以保护mRNA免受RNase的降解。近关于RI的研究又有新的报道，血管形成因子(angiogenin)是RNase超家族的一员，RI可以与其结合，并抑制其促进血管形成的活性，从而抑制实体瘤的血管新生和实体瘤的生长[1]。
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间接酶联免疫吸附试验测定恶性肿瘤血清中核糖核酸酶抑制因子表达的研究
目的:探讨间接酶联免疫吸附试验(ELISA)检测核糖核酸酶抑制因子(RI)在恶性肿瘤患者血清中的表达.方法:建立检测血清RI含量的间接ELISA法,检测和比较正常人、恶性肿瘤患者(乳腺癌、胃癌、肺癌、肝癌)、乳腺良性肿瘤患者血清中RI的表达水平.结果:所建立的间接ELISA法特异性高;恶性肿瘤患者血清中RI表达均明显低于正常人(P＜0.05),乳腺癌亦明显低于乳腺良性肿瘤(P＜0.05).结论:RI表达的降低可以作为肿瘤良、恶性鉴别的指标之一.
关键词： 核糖核酸酶抑制因子 间接酶联免疫吸附试验 恶性肿瘤 -
RI基因稳定转染的SKOV3细胞系的建立及其对细胞增殖的作用
目的:建立稳定表达RI基因的卵巢癌SKOV3细胞系,并观察外源基因对细胞体外增殖的作用.方法:以脂质体为介导,将携有RI基因的重组载体pLNCX-ri转染SKOV3细胞,实验分3组,RI基因转染组(SKOV3/RI组)、空质粒转染组(SKOV3/Neo组)和空白对照组(SKOV3组).采用G-418筛选获得稳定转染的细胞系后,通过RT-PCR技术和免疫细胞化学染色方法鉴定各组细胞中RI基因的表达;通过MTT、细胞周期分析、细胞凋亡检测方法观察该基因对细胞生长的影响.结果:外源性RI基因已整合于细胞基因组中,并获得稳定表达.转染RI基因后的细胞生长速度减慢,明显低于对照组,差异有统计学意义.细胞周期分析显示,实验组G1期细胞增至69.23%,S期细胞降至24.34%,与另外两组相比差异有统计学意义(P<0.05).细胞凋亡检测表明SKOV3/RI组细胞凋亡率为58.25%,与SKOV3组(17.97%)及SKOV3/Neo组(21.42%)比较,差异有统计学意义(P<0.05).结论:通过脂质体介导,可以建立RI基因稳定表达的卵巢癌细胞系,且RI基因对SKOV3细胞的体外增殖有抑制作用.
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RI与TACE联合栓塞对大鼠Walker-256肝移植模型肿瘤细胞增殖和凋亡的影响
目的 研究核糖核酸酶抑制因子(RI)与TACE联合栓塞Walker-256肝移植模型对肿瘤细胞增殖和凋亡的影响.方法 将60只Walker-256荷瘤大鼠于移植后第14天随机分成肝动脉灌注化疗栓塞组(TACE组)、RI与TACE联合栓塞组和对照组,每组20只.各组分别经肝动脉注入:超液态碘油0.5 ml加5-Fu20 mg/kg;RI 200单位加5-Fu 20mg/kg加超液态碘油0.5 ml;生理盐水0.5 ml.于术后第7天用TUNEL法检测肿瘤细胞的凋亡率,用免疫组化法检测肿瘤细胞PCNA增殖率、平均染色强度.结果 PCNA增殖率和平均染色强度TACE组为44.98±7.92,168741.41±25410.37;联合栓塞组为45.02±8.42,168539.41±19675.98;对照组为35.43±6.75,137313.01±17380.59.TACE组、联合栓塞组PCNA增殖率和染色强度显著高于对照组(P＜0.01),而联合栓塞组与TACE组差异无统计学意义(P＞0.05).肿瘤细胞凋亡率TACE组为16.88±2.48;联合栓塞组为23.50±5.33;对照组为11.70±2.76,TACE组、联合栓塞组显著高于对照组(P＜0.01),联合栓塞组显著高于TACE组(P＜0.01).结论 RI与TACE联合栓塞与TACE相比可显著提高肿瘤细胞的凋亡率.
关键词： 核糖核酸酶抑制因子 化疗栓塞 增殖 凋亡 Walker-256肝移植模型 -
RI与TACE联合栓塞Walker-256肝移植模型肿瘤组织中Bcl-2、P53的表达
目的研究核糖核酸酶抑制因子(RI)与TACE联合栓塞Walker-256肝移植模型对肿瘤组织Bcl-2、P53表达的影响.材料与方法将60只Walker-256荷瘤大鼠于移植后第14天随机分成肝动脉灌注化疗栓塞组(TACE组)、RI与TACE联合栓塞组和对照组,每组20只.各组分别经肝动脉注入:超液态碘油0.5ml加5-Fu 20mg/kg;RI 200单位加5-Fu 20 mg/kg加超液态碘油0.5 ml;生理盐水0.5ml.于术后第7天用免疫组化的方法检测各组肿瘤组织中Bcl-2、P53的表达.结果 Bcl-2阳性率TACE组为35%(7/20);联合栓塞组为30%(6/20);对照组为25%(5/20),各组无显著性差异(P＞0.05).P53阳性率TACE组为50%(10/20),联合栓塞组为45%(9/20),对照组为60%(12/20),各组无显著性差异(P＞0.05).结论 RI与TACE联合栓塞与TACE相比,肿瘤组织中Bcl-2,P53的蛋白表达无明显差异.
关键词： 核糖核酸酶抑制因子 化疗栓塞 Walker-256肝移植模型 Bcl-2 P53 -
RI基因siRNA干扰质粒的构建及其对人膀胱癌细胞迁移和侵袭能力的影响
目的 构建核糖核酸酶抑制因子(RI)基因siRNA干扰质粒,并检测其对人膀胱癌细胞BIU-87迁移和侵袭能力的影响.方法 设计并构建针对RI基因mRNA的2个特异性siRNA表达载体和1个无同源性的阴性对照载体,经酶切和DNA测序鉴定后,转染BIU-87细胞,通过RT-PCR、Western blot和免疫细胞化学法检测干扰的有效性.光镜及HE染色观察细胞形态的改变,黏附试验、划痕试验和Transwell法检测细胞黏附、迁移和侵袭能力的变化,激光共聚焦显微镜观察细胞骨架微丝结构.结果 酶切和测序结果证明干扰质粒构建正确;转染特异性siRNA表达载体的BIU-87细胞RI蛋白的表达水平明显降低,对照组未发生明显改变;转染干扰质粒的细胞堆叠严重,细胞黏附能力显著降低,迁移和侵袭能力显著提高,细胞骨架微丝聚集,伸展出片状伪足.结论 已成功构建RI基因siRNA干扰质粒,其可显著提高膀胱癌细胞的迁移和侵袭能力,说明RI可作为抑制肿瘤迁移和侵袭的有效靶点.
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核糖核酸酶抑制因子与整合素连接激酶相互作用通过ILK/AKT/mTOR通路抑制 膀胱癌体内外生长
背景与目的:蛋白质相互作用控制着细胞信号转导、跨膜转运、DNA合成及转录调控等生命过程,在生命活动中发挥重要作用.前期运用GST蛋白沉降技术与免疫共沉淀等已证明核糖核酸酶抑制因子(ribonuclease inhibitor,RI)与整合素连接激酶(intergrin-linked kinase,ILK)在体内外直接结合.该研究旨在探讨RI与ILK相互作用对ILK/AKT/mTOR通路与膀胱癌体内外生长的影响.方法:采用免疫荧光观察RI与ILK在膀胱癌EJ细胞中的共定位.采用荧光共振能量转移技术(lfuorescence resonance energy transfer,FRET)验证RI与ILK的相互作用.构建过表达RI或ILK的EJ细胞系.采用蛋白[质]印迹法(Western blot)检测细胞中RI、ILK及ILK/AKT/mTOR通路相关蛋白的表达.采用细胞计数试剂盒(cell counting kit-8,CCK-8)与流式细胞术分析细胞增殖与细胞周期.构建膀胱癌裸鼠移植瘤模型,观察过表达RI或ILK对移植瘤生长的影响.采用免疫组织化学与免疫荧光分析瘤组织中RI、ILK及ILK/AKT/mTOR通路相关蛋白的表达.结果:EJ细胞中RI与ILK存在共定位的现象且RI与ILK存在相互作用.过表达RI抑制EJ细胞增殖并导致细胞周期阻滞于S期(P<0.05),阻碍膀胱癌移植瘤的生长(P<0.05),并抑制体内外ILK/AKT/mTOR通路的活化(P<0.05).而过表达ILK促进细胞增殖与移植瘤的生长(P<0.05),促进体内外ILK/AKT/mTOR信号通路的激活(P<0.05).结论:RI通过与ILK相互作用阻碍ILK/AKT/mTOR通路激活并抑制膀胱癌体内外的增殖生长.
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核糖核酸酶抑制因子基因在人乳腺癌中的表达及突变分析
目的通过核糖核酸酶抑制因子(ribonuclease inhibitor,RI)基因在人乳腺癌中的表达及其是否突变的分析,进一步探讨RI与肿瘤细胞生长的关系.方法采用Western blotting方法检测人乳腺癌组织中RI的表达量;采用SSCP的方法分析肿瘤细胞RI基因中是否有突变.结果人乳腺癌组织中RI的表达明显低于同体癌旁正常组织,但用Mbo I酶切及SSCP分析未发现人乳腺癌组织中RI基因有突变.结论乳腺癌的生长可能与RI表达的下降有关,从而可能使癌组织周边新血管的形成未受到有效抑制的结果.
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转染人核糖核酸酶抑制因子对乳腺癌细胞增殖的抑制作用
目的:利用脂质体转染技术上调乳腺癌MDA-MB-231细胞中核糖核酸酶抑制因子(ribonuclease inhibitor,RI)水平,探讨Rl对乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖及细胞周期的影响.方法:采用脂质体转染法,将RI基因转入乳腺癌MDA-MB-231细胞.经G418筛选后获得稳定高表达RI的亚克隆细胞系MDA-MB-231/pLNCX-RI.RT-PCR、Western-blot等方法鉴定RI在转染细胞中的表达;四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测细胞生长情况,流式细胞术检测细胞周期变化.结果:成功构建了稳定高表达RI的亚克隆细胞系MDA-MB-231/pLNCX-RI;MTT结果显示,转染的Rl基因能抑制细胞恶性增殖(P<0.01);细胞周期分析显示转染的RI基因使细胞停留在G0/G1期,S期细胞明显减少(P<0.01).结论:RI能抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231的恶性增殖.
关键词： 核糖核酸酶抑制因子 乳腺癌细胞MDA-MB-231 细胞增殖 细胞周期 -
核糖核酸酶抑制因子与人乳腺癌细胞恶性增殖的相关性研究
目的:探讨核糖核酸酶抑制因子(ribonuclesae inhibitor,RI)的表达与人乳腺癌细胞MCF-7、MDA-MB-231、SKBR-3恶性增殖之间的关系.方法:四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞增殖情况,流式细胞术检测细胞周期分布,RT-PCR检测RI基因表达水平,细胞免疫化学技术检测RI蛋白表达情况.结果:人乳腺癌细胞MCF-7细胞增殖速度、S期所占比例均小于人乳腺癌细胞MDA-MB-231、SKBR-3(P<0.05~P<0.01),且MCF-7细胞中RI基因表达水平、蛋白表达水平明显高于MDA-MB-231、SKBR-3细胞(P<0.01).结论:RI与人乳腺癌细胞恶性增殖生长有一定的相关性.
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融合蛋白GST-hRI的可溶性表达及对CCl4引起的急性肝损伤的保护作用
目的:观察可溶性表达的融合蛋白GST-hRI对CCl4引起的急性肝损伤的保护作用.方法:构建pGEX-6p-1-hri表达质粒.在0.5 mol/L IPTG浓度下,调整温度诱导目的融合蛋白的大可溶性表达.用Western Blotting栓测GST-hRI的表达,用亲和层析法时GST-hRI进行分离纯化.将纯化后的GST-hRI腹腔注射给BALB/c小鼠,预先保护7d后,再腹腔注射CCl4造成急性肝损伤.检测小鼠血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶水平和肝脏的超氧化物歧化酶、黄嘌呤氧化酶、丙二醛,谷胱甘肽、谷胱甘肽过氧物酶指标,并在光镜下检测肝细胞的损伤程度.结果:0.5 mmol/L IPTG,26℃诱导表达8 h,超声破碎菌体所得到的上清中可溶性GST-hRl的表达量约占超声离心后上清总蛋白4.5%,与沉淀中的比例约为27%.与CCl4损伤组相比,GST-hRI治疗组的谷丙转氨酶、谷草转氨酶和丙二醛水平明显下降(P<0.05),谷胱甘肽过氧化物酶、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽水平明显增加(P%0.05),黄嘌呤氧化酶水平基本没有变化.与hRI治疗组相比,GST-hRI治疗组的各项指标差异有统计学意义(P<0.05).与维生素C处理组相比,GST-hRI处理组的各项指标差异无统计学意义(P>0.05).结论:可溶性表达的融合蛋白GST-hRI具有对抗CCl4对小鼠肝损伤的作用,这为hRI的应用提供了实验基础.
关键词： 急性肝损伤 核糖核酸酶抑制因子 融合蛋白GST-hRI CCl4 抗氧化作用 -
核糖核酸酶抑制因子抑制碱烧伤后角膜新生血管
目的制作兔碱烧伤后角膜新生血管(CNV)模型,结膜下注射核糖核酸酶抑制因子(RI),以探讨RI对碱烧伤后CNV的抑制效果.方法每只兔双眼均制成碱烧伤后CNV模型.自身双眼对照,实验眼结膜下注射RI,对照眼用等量生理盐水结膜下注射.根据烧伤范围和烧伤时间,16只兔随机分成4组,各组给药量相应改变.两周后,摄片分析CNV面积.结果实验眼组较对照眼组,CNV被抑制了27.38%,P＜0.01.组1的抑制率为35.26%,P＜0.01;组2的抑制率为48.32%,P＜0.05;组3的抑制率为8.01%,P＜0.01;组4的抑制率为34.84%,P＜0.01.结论 RI能够抑制碱烧伤后CNV的发生.
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核糖核酸酶抑制因子联合化疗栓塞对Walker-256移植性肝癌微血管密度的影响
目的研究核糖核酸酶抑制因子(RI)与肝动脉化疗栓塞(TACE)联合栓塞对Walker-256移植性肝癌微血管密度(MVD)及坏死面积的影响.材料与方法将30只Walker-256荷瘤大鼠于种植后第14 d随机分成TACE组、RI与TACE联合栓塞组和对照组,每组10只.各组分别经肝动脉注入:5-Fu 20 mg/kg体重加超液态碘油0.4 ml;RI 200U加5-Fu20mg/kg体重加超液态碘油0.4 ml;生理盐水0.4 ml.结果在栓塞后7 d TACE组、联合栓塞组和对照组肿瘤MVD的平均值分别为89.60±40.43、21.16±29.47和84.78±28.40.联合栓塞组MVD明显少于TACE组和对照组(P＜0.01).肿瘤坏死面积TACE组、联合栓塞组明显大于对照组(P＜0.01),TACE组、联合栓塞组无明显差别(P＞0.05).结论RI与TACE联合栓塞可使肿瘤的MVD明显减少,但对坏死的影响与TACE无明显差别.
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核糖核酸酶抑制因子联合化疗栓塞治疗大鼠Walker-256移植性肝癌的实验研究
目的评价核糖核酸酶抑制因子(RI)联合化疗栓塞(TACE)治疗大鼠Walker-256移植性肝癌的疗效.材料与方法45只Walker-256荷瘤大鼠于移植后第14 d随机分成RI+碘油栓塞组(RI栓塞组,10只);5-氟尿嘧啶(5-Fu)+碘油栓塞组(TACE组,12只);RI+5-Fu+碘油栓塞组(联合栓塞组,13只);对照组(生理盐水组,10只).各组分别经肝动脉左支注入栓塞剂和药物,RI用量为200U,超液态碘油为0.4ml,5-Fu为20 mg/kg体重,生理盐水为0.4ml.用MR分别于栓塞后第7 d、第13 d、第18 d测量肿瘤横径并计算体积.于术后第18 d检测肝转移结节数.观察RI的系统毒性.结果栓塞后7～18 d各治疗组肿瘤体积均明显小于对照组(P＜0.05),以联合栓塞组体积小.在栓塞后第13 d,联合栓塞组肿瘤的体积组明显小于RI栓塞组(P＜0.05);第18 d TACE组亦明显小于RI栓塞组(P＜0.05).肝脏转移结节数各治疗组明显少于对照组(P＜0.05),联合栓塞组明显少于RI栓塞组和TACE组(P＜0.05).RI无明显系统毒性.结论联合栓塞与单纯TACE相比,可明显抑制大鼠Walker-256移植性肝癌的生长和减少肝转移,提高了TACE的疗效.经肝动脉给药后,RI对Wistar大鼠无明显系统毒性.
关键词： 动物 实验 核糖核酸酶抑制因子 化疗栓塞 Walker-256移植性肝癌
