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D-siRNAs抑制A549细胞COX-2表达
目的 长片段双链COX-2 RNA(dsRNAs)在体外经Dicer酶消化获得小RNA(D-siRNAs)抑制A549细胞COX-2的表达.方法 (1)IL-1β5 g/L干预A549细胞,Western blot法观察其COX-2蛋白表达的时间依赖性.(2)Trizol法抽提A549细胞总RNA,RT-PGR扩增COX-2基因.(3)设计两端带T7 promoter,SP6 promoter的COX-2 cDNA的PCR引物,通过PCR方法,获得两端带,T7及SP6 promoter的COX-2 DNA.(4)用RiboMAX Large Scale RNA Produc-tion Systems-SP6 and T7试剂盒体外将COX-2 DNA转录为RNA.(5)长片段COX-2 RNA经Dicer酶消化为小RNA(D-siRNAs).(6)用TransMessenger Transfection Reagent将D-siRNAs转染A549细胞.(7)COX-2 mRNA表达用RT-PCR检测,细胞培养上清液中PGE2含量用ELISA测定.结果 (1)IL-1β干预A549细胞9 haCOX-2表达到高峰.(2)在体外,长片段COX-2 dsRNAs经Dicer酶消化获得D-siRNAs.(3)D-siRNAs可有效抑制A549细胞COX-2的表达并降低PGE2的分泌.结论 长片段双链COX-2 RNA(dsRNAs)在体外经Dicer酶消化获得小RNA可有效抑制A549细胞COX-2的表达.
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抑制A549细胞COX-2表达的D-siRNAs的合成
目的:利用长片段双链RNA(dsRNAs)在体外经Dicer酶消化获得小RNA(D-siRNAs)的方法合成抑制A549细胞COX-2表达的siRNAs,以期获得治疗气道炎症和肿瘤的一种新思路.方法:用RiboMAX Large Scale RNA Production Systems-SP6 and T7试剂盒体外将COX-2 DNA转录为RNA.长片段COX-2 RNA经Dicer酶消化为小RNA,纯化并获取小RNA(D-siRNAs).结果:在体外,长片段双链A549细胞COX-2的RNA经Dicer酶消化后可成功获得抑制A549细胞COX-2表达的小RNA.结论:在体外,长片段dsRNAs经Dicer酶消化可成功获得21～23个碱基的小RNA.
