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消栓通络有效成分组对氧糖剥夺损伤原代培养神经元的保护作用
研究消栓通络有效成分组(XECG)对原代培养皮质神经元氧糖剥夺(OGD)损伤的保护作用,并探讨其可能的作用机制.采用3日龄SD大鼠皮质制备原代培养神经元;将细胞随机分为正常对照组、OGD模型组和XECG组(1、3及10 mg·L-1);四甲基偶氮唑盐(MTT)法测定细胞存活率;酶标法试剂盒测定乳酸脱氢酶(LDH)漏出量;Hoechst染色检测细胞凋亡;RT-PCR检测JAK2、STAT3 mRNA表达变化;Western blotting检测Bcl-2、Bax、p-JAK2、p-STAT3蛋白表达变化.结果显示,XECG能明显改善OGD对神经元的损伤,提高细胞存活率,减少LDH的释放量,抑制缺氧缺糖引起的细胞凋亡;能提高缺糖缺氧神经元Bcl-2/Bax比值,增加JAK2、STAT3基因和蛋白的表达.以上结果表明,XECG对OGD损伤的原代培养神经元具有明显保护作用,其机制可能与激活JAK2/STAT3通路、影响凋亡相关基因Bcl-2及Bax的表达有关.
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甘松新酮对缺糖缺氧损伤原代培养神经元的保护作用
观察甘松新酮对缺糖缺氧损伤原代培养神经元的保护作用.采用孕14天小鼠胚胎皮层制备原代培养神经元;MTT法确定甘松新酮对原代培养神经细胞的安全剂量,并观察其对缺糖缺氧神经元的保护作用；采用Western blotting法观察药物对缺糖缺氧损伤神经元以及正常培养神经元蛋白激酶A(PKA)和细胞外信号调节激酶(ERK)通路关键蛋白表达的影响.结果显示,甘松新酮(50和100 μmol·L-1)能够增加缺糖缺氧损伤神经元的存活率(P＜0.01,与OGD组比较)；同时,能增加缺糖缺氧神经元PKA、小分子G蛋白Ras的相关蛋白1(Rap1)、丝裂原激活的蛋白激酶的激酶1(MEK1)及磷酸化的ERK 1/2 (p-ERK 1/2)的表达,且此作用呈剂量依赖趋势.对正常培养神经元研究结果显示,甘松新酮(50、100和200 μmol·L-1)也能增加其PKA、Rap1、MEK1及p-ERK1/2的表达(P＜ 0.01).以上结果表明,甘松新酮对缺糖缺氧损伤的原代培养神经元有明确保护作用,该作用可能与药物激活PKA和ERK通路有关.
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银杏内酯诱导原代培养神经元低氧诱导因子1α的表达及与ERK通路的关系
目的:研究银杏内酯(Gin)对氯化钴(CoCl2)诱导的化学性缺氧原代培养神经元低氧诱导因子-a(HIF-1α)表达的影响及其与细胞外信号调节激酶(ERK)信号通路之间的关系.方法:以CoCl2(125 μmol/L)诱导的原代培养胚胎小鼠大脑皮层神经元为缺氧模型,观察Cin(终浓度37.5 mg/L)对神经细胞形态和活力的影响,Western blot HIF-1α和磷酸化ERK(p-ERK)的表达.运用ERK特异性抑制剂PD98059观察HIF-1α表达与ERK通路之间的关系.结果:Gin能明显提高CoCl2处理的神经细胞的活力.在正常培养的皮层神经元中HIF-1α和p-ERK的表达水平较低,CoCl2处理4 h后表达水平明显上调;Gin预处理24 h其表达强度进一步提高.PD98059能部分抑制CoCl2诱导的HIF-1α的表达,显著抑制p-ERK的表达;预加Gin能完全阻止该抑制作用.结论:Gin对CoCl2诱导的化学性缺氧损伤神经元有保护作用,该作用与HIF-1α表达上调、ERK通路的激活有关.
关键词： 银杏内酯 低氧诱导因子-1α 原代培养神经元 磷酸化细胞外信号调节激酶 -
前列地尔对原代培养神经元类缺血再灌注损伤后线粒体解耦联蛋白4表达的影响
目的:探讨线粒体解耦联蛋白4(UCP4)在原代培养神经元类缺血再灌注损伤后不同时间点的表达变化及前列地尔对其影响.方法:以原代培养神经元为研究对象,建立类缺血再灌注损伤模型,应用免疫细胞化学方法观察类缺血再灌注后3 h,6 h,12 h时UCP4的表达变化.实验组为在缺血期及再灌期均给予0.01 mg/mL前列地尔,观察前列地尔对UCP4表达的影响.结果:UCP4阳性细胞随类缺血再灌注时间的延长,阳性神经元胞浆的灰阶值数值变大,染色变浅,反映神经细胞内UCP4蛋白表达量减少.在再灌注3 h时UCP4的表达即降低;再灌注6 h时UCP4的表达明显降低,再灌注12 h时其表达仍在下降.在再灌注后3 h,6 h,12 h组与正常对照组比较,差异具有显著性意义(P＜0.05),实验组UCP4阳性细胞胞浆的灰阶值在再灌注后3 h,6 h,12 h时均低于类缺血再灌注模型组,差异有显著性(P＜0.05).结论:UCP4在类缺血再灌注后不同时间点的表达呈动态变化,提示UCP4可能参与了脑缺血再灌注损伤的病理过程;而前列地尔可上调UCP4的表达,从而发挥保护神经细胞的作用.
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GM-1对原代培养神经元类缺血再灌注损伤的影响
目的 观察类缺血再灌注对大鼠皮质神经元细胞损伤的影响及神经节苷脂(GM1)对受损神经细胞的保护作用.方法 制备培养原代神经元类缺血再灌注损伤模型,应用 GM1分别于再灌注后不同时间进行MTT,凋亡流式细胞检测等.结果 进行类缺血再灌注后,任一时间点的缺血组、实验组的细胞活性均低于正常组,凋亡率高于正常组.1 h时缺血组与实验组的细胞活性和凋亡细胞染色无明显差别,而流式细胞仪检测细胞凋亡率显示实验组低于缺血组;在随后的不同时间点实验组的细胞活性显著高于缺血组,凋亡率显著低于缺血组.结论 GM1可保护类缺血再灌注后大鼠皮质神经元的损伤,作用从再灌后1 h即可出现,6 h～24 h时这种作用逐渐加强;GM1可减轻类缺血再灌注诱导的大鼠皮质神经元细胞凋亡,增加神经元的存活率,从而对损伤神经元细胞具有保护作用.
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丁苯酞注射液对原代培养神经元类缺血再灌注损伤的影响
目的:探讨丁苯酞注射液对原代培养神经元类缺血再灌注损伤的影响.方法:原代培养大鼠神经元建造实验模型,并随机分为对照组、缺血组(类缺血后再灌注)、实验组(类缺血再灌注后加丁苯酞),造模后鉴定培养细胞为神经元,分组后检测神经元细胞活性、神经元细胞凋亡率.结果:与对照组相比,缺血组的细胞存活率下降,细胞凋亡率增高.实验组细胞存活率高于缺血组,而细胞凋亡率低于缺血组.结论:丁苯酞注射液可显著增加类缺血再灌注神经元细胞再灌注后细胞的存活率,这种神经保护机制在一定程度上是通过其减少神经细胞凋亡而实现的.
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锰对神经元细胞内SNARE复合物蛋白及突触囊泡的影响
目的 研究锰干扰神经递质释放的分子机制,重点观察锰对神经元细胞内SNARE复合物蛋白及突触囊泡的影响.方法 利用体外培养的神经元,用0～400 μmol/L锰处理24 h后,观察细胞活力及培养液中LDH的释放量.根据结果挑选剂量为0、12.5、50、200 μmol/L的氯化锰处理神经元24 h,测定SNARE复合物相关蛋白的基因及蛋白表达,以及活动性突触囊泡的数量.结果 随着锰处理浓度的增加,神经元损伤逐渐加重;与对照组比较,Syntaxin 1A的基因及蛋白表达均未见明显改变,SNAP 25的基因和蛋白表达均逐渐下降,VAMP2的基因和蛋白表达均逐渐升高,进而导致SNARE复合物蛋白形成下降,同时活动性突触囊泡的数量明显减少.结论 锰通过干扰SNARE复合物相关蛋白的表达,减少了神经元细胞内SNARE复合物蛋白的形成,进而导致活动性突触囊泡减少,造成神经递质释放紊乱.
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新型雌激素受体ER-α36在新生与成年大鼠海马和皮层中表达的比较
ER-α36是一种新型雌激素受体亚型,广泛分布于乳腺、子宫、消化道、呼吸道等组织和细胞中.本文旨在研究ER-α36在中枢神经系统中的表达和分布情况.采用免疫细胞/组织化学方法和蛋白质免疫印迹杂交比较ER-α36在新生(1日龄)与成年(12周龄)Sprague-Dawley (SD)大鼠海马及皮层区的表达和分布情况.研究显示,ER-α36在成年大鼠海马及皮层区均有表达,主要分布于锥体神经元.ER-α36在新生大鼠海马和皮层神经元中均定位于细胞膜.新生大鼠皮层神经元ER-α36蛋白表达高于海马,而成年大鼠皮层神经元ER-α36蛋白表达低于海马.与新生大鼠相比较,成年大鼠海马和皮层神经元ER-α36表达均显著提高.以上结果提示,ER-α36参与介导神经元膜雌激素信号通路的调节,且在大鼠出生后海马及皮层发育中发挥着重要作用.因此,ER-α36可能为学习记忆、神经系统退行性疾病等的防治提供潜在的药物靶点.
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神经生长因子对CoCl2诱导原代培养神经元缺氧损伤的保护作用
目的:研究神经生长因子(nerve growth factor,NGF)对氯化钴(CoCl2)诱导原代培养神经元缺氧损伤的保护作用.方法:利用CoCl2(125 μmol/L)诱导的原代培养小鼠大脑皮层神经元,观察系列实验指标:光镜观察NGF(终浓度为100 ng/ml)对细胞形态的影响,MTT比色法观察NGF对细胞活力的影响,检测细胞外液LDH释放量观察NGF对细胞膜稳定性的影响.结果:NGF能明显提高CoCl2诱导的神经细胞的活力,降低其LDH释放量,稳定细胞膜.结论:NGF对CoCl2诱导神经元缺氧损伤有明显的保护作用.
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感觉和运动神经源性雪旺细胞与神经元共培养神经生长因子mRNA的表达
临床上修复神经缺损使用自体神经移植体时，神经感觉功能恢复较运动功能好，这可能与移植神经取自感觉神经有关，这种神经特异性再生的机制目前认为有多种机制参与［1］，而神经损伤后初雪旺细胞是远段神经的唯一成分，而且雪旺细胞被证实可以分泌包括神经生长因子(NGF)在内的多种神经营养因子［2］，因此我们以感觉和运动神经来源的雪旺细胞为研究对象，以NGF为指标，研究两种雪旺细胞与神经元共培养后NGF mRNA的表达是否有差异，探讨这种差异对神经特异性再生的作用。 一、材料和方法 1.雪旺细胞和神经元的体外培养：感觉性和运动性雪旺细胞、感觉和运动神经元的体外共培养参考文献［3，4］的方法。简要步骤如下：无菌条件下，分别取5 d龄SD乳鼠的背根神经(感觉性雪旺细胞)和股神经肌支(运动性雪旺细胞)，14 d龄SD胚鼠背根神经节(感觉神经元)和脊髓前角(运动神经元)，剪碎成糊状；分别置入离心管中，加入0.125%胰蛋白酶+0.03%Ⅳ型胶原酶(Sigma公司)，消化30～40 min；1 500 r/min离心5 min；用DMEM/F12(Gibco公司)培养基将沉淀混悬成悬液，接种到培养皿中；37 ℃，体积分数为5%CO2细胞培养箱中孵育；雪旺细胞在48 h添加阿糖胞苷(5×10 -8 μg/L)，抑制成纤维细胞，第4天按1×109个/L的密度传代接种到6孔培养板盖玻片上，2 d后接种原代培养神经元细胞，这样就获得感觉性雪旺细胞和感觉神经元、运动性雪旺细胞和运动神经元的共培养。 2.共培养细胞NGF mRNA的表达：NGF mRNA表达的检测采用武汉博士德公司原位杂交检测试剂盒(MK1032型)提供的方法进行。简要步骤如下(以下溶液中均含有0.1%焦炭酸二乙酯)： 4%多聚甲醛固定液30 min；磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗涤3次；甲醇(含体积分数为0.03%过氧化氢)30 min；PBS洗涤3次；灭菌水洗涤3次；蛋白酶K，37 ℃，10 min；灭菌水洗涤3次；地高辛标记的cDNA探针和无关序列在杂交液内首先经过100 ℃，8 min的变性处理，然后置于碎冰中3 min，滴加到盖玻片上，上面覆以专用盖片(Sigma公司)；37 ℃孵育20 h；2 5 ℃的2×SSC(氯化钠17.4 g，柠檬酸钠8.8 g溶于1 000 ml水中)洗涤2次；37 ℃的0.1 ×SSC洗涤1次；加入封闭液，不洗；加入抗地高辛抗体，34 ℃孵育30 min；TBS(氯化钠30 g，三羟甲基氨基甲烷1.2 g，纯乙酸0.5 ml溶于1 000 ml水中)洗涤；加入酶标二抗， 34 ℃孵育20 min；TBS洗涤；加入显色液，34 ℃显色30 min；灭菌水洗涤，中止反应。显微镜下观察、比较。 二、结果 感觉和运动雪旺细胞与相应神经元混合培养后，第3天分别进行NGF mRNA原位杂交，图1为运动性雪旺细胞NGF mRNA表达染色，图2为感觉性雪旺细胞的表达，图3为空白对照，图中黑褐色染色颗粒的多寡即代表NGF mRNA表达量的多少。由图中可见，感觉性雪旺细胞NG F mRNA的表达颗粒明显较运动性雪旺细胞密集，而运动性雪旺细胞的表达接近于空白对照。
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锰暴露不同时长对神经元细胞突触囊泡及其相关蛋白的影响
目的 研究锰暴露不同时长对神经元细胞突触囊泡及其相关蛋白的影响.方法 将体外培养的神经元,分别用100 μM锰处理0、6、12、18、24 h后,观察细胞活力及培养液中LDH的释放量,测定SNARE复合物相关蛋白的基因及蛋白表达,以及活动性突触囊泡的释放.结果 神经元细胞用100 μM锰暴露不同时长后,神经元损伤逐渐加重(P＜0.01);与对照组比较,Svntaxin 1A的基因及蛋白表达均未见明显改变(P＞0.05),SNAP 25的基因和蛋白表达均逐渐下降(P＜0.05),VAMP 2的基因和蛋白表达均逐渐升高(P＜0.01),进而导致SNARE复合物蛋白形成先升高后下降的趋势,同时活动性突触囊泡的释放也出现相应改变.结论 锰暴露可以时间依赖性的干扰SNARE复合物相关蛋白表达,减少了神经元细胞内SNARE复合物的形成,进而导致活动性突触囊泡减少,造成神经递质释放紊乱.
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烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶1基因对原代培养小鼠神经元活力的影响
目的 评价烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶1(NMNA T1)基因对原代培养小鼠神经元活力的影响.方法 取原代培养神经元,分成正常对照组、过表达NMNA T1慢病毒感染组、RNA干扰慢病毒感染组,后两组分别感染小鼠NMNA T1基因的过表达和RNA干扰慢病毒颗粒以上调和下调NMNA T1基因的表达水平.应用MTT染色观察各组原代培养小鼠神经元活力的变化.结果 与正常对照组原代培养小鼠神经元活力比较,过表达NMNA T1慢病毒感染组神经元的细胞活力显著增强,而RNA干扰慢病毒感染组神经元的细胞活力受到严重干扰,差异有统计学意义(P=0.025,P=0.027).结论 NMNA T1基因在神经元发育过程中起重要作用,其缺失可能导致中枢神经系统的神经退化.
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大鼠VGLUT2基因shRNA慢病毒载体的构建和鉴定
目的:构建可以表达针对2型囊泡膜谷氨酸转运体(VGLUT2)shRNA的慢病毒载体,特异性下调中枢神经系统内VGLUT2的表达,从而为研究VGLUT1和VGLUT2的功能差异提供有力的工具.方法:首先在体外合成四对互补并靶向作用于编码大鼠VGLUT2序列四个位点的特异性短发卡RNA(short hairpin RNA)序列和一个阴性对照的寡核苷酸,克隆到pGCSIL-GFP质粒(经AgeI和EcoRl双酶切)载体内,经酶切及测序鉴定正确后,将该质粒与辅助质粒pHelper1.0以及pHelper2.0共转染T293细胞,包装得到病毒颗粒.各组病毒载体转染原代培养的大鼠皮层神经元后,运用免疫荧光和Western Blot检测各组蛋白的表达水平.结果:pGCSIL-GFP质粒克隆得到的VGLUT2 shRNA序列正确,包装得到的病毒可以有效转染原代培养的皮层神经元,Western Blot检测结果显示:VGLUT2 shRNA-1与VGLUT2 shRNA-2病毒组的VGLUT2表达水平与空白组相比有显著性差异(P＜0.05),分别为空白组的63.9 ±5.82％,73.8 ±3.18％:VGLUT2 shRNA-3与VGLUT2 shRNA-4病毒组的VGLUT2表达水平与空白组相比同样有显著性差异(P＜0.05),分别为空白组的39.1 ±1.99％,35.1±1.72％:VGLUT2shRNA-1与VGLUT2 shRNA-2病毒组相比无显著性差异(P＞0.05);但VGLUT2 shRNA-3与VGLUT2 shRNA-4病毒组与VGLUT2 shRNA-1和VGLUT2 shRNA-2病毒组相比有显著性差异(P＜0.05).表明VGLUT2 shRNA-3与VGLUT2 shRNA-4组病毒能较为高效的下调培养的皮层神经元VGLUT2的表达,下调效率超过60％.结论:本研究成功构建出表达针对大鼠VGLUT2基因shRNA的慢病毒载体,并可有效下调VGLUT2的表达,为进一步研究VGLUT2的功能及其与VGLUT1之间的功能差异提供了有力的工具.
关键词： VGLUT2:RNA干扰 慢病毒载体 原代培养神经元 大鼠 -
PKAc促进成年大鼠背根神经节神经元突起生长及其机制的研究
观察慢病毒载体介导PKA催化亚单位PKAc转染促进成年大鼠原代培养的背根神经节(DRG)神经元突起生长及其机制的研究.我们运用三质粒系统共转染293T细胞合成慢病毒载体LV/PKAc-IRES-GFP和对照病毒LV/GFP,原代分离培养成年大鼠DRG神经元,应用免疫组织化学染色和Western blot等方法检测cAMP/PKA信号通路下游关键转录因子cAMP反应元件连接蛋白(CREB)磷酸化水平,图像分析经组织化学染色后的神经元突起长度和有突起神经元的百分比.结果观察到,慢病毒能介导外源基因在哺乳动物原代培养的神经元中表达,转染LV/PKAc-IRES-GFP的PC12细胞和DRG神经元均能表达外源基因并激活CREB,克服CNS髓鞘蛋白的抑制,促进突起生长.以上实验结果表明拯救成年大鼠神经元cAMP/PKA水平可有效改变神经元内在生长能力,从而改变它们对抑制环境的敏感性,进而促进突起生长.
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钾离子浓度改变对培养中神经元的影响
前言K+是细胞维持正常生理功能必需的离子.在生理状态下,多数细胞的[K+]o=5.4 mmol/L,[k+]i=140 mmol/L.在含[K+]的培养基中("正常培养"),原代培养神经元可以生存并保持正常形态.但有一些神经细胞在[K+]相对较高(如25 mmol/L、30 mmol/L、50 mmol/L)的培养基中生长时("高钾培养"),其形态、存活等与正常培养相比有显著的改善.
