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苯丙素甙对MKN45细胞端粒酶活性的抑制机制
目的:探讨苯丙素甙对肿瘤细胞端粒酶活性的调控作用.方法:应用端粒酶PCR ELISA法,Sourthern blot杂交及流式细胞技术对苯丙素甙(verbascoside)在体外作用MKN45细胞的端粒酶活性、端粒长度及细胞周期进行检测分析.结果:苯丙素甙在一定浓度范围内(12.5-27mg@L-1)抑制端粒酶活性,但不能直接抑制细胞上清中的端粒酶活性.用端粒酶半抑制浓度剂量作用细胞后,细胞出现端粒长度缩短(约1.1 kb)、G1亚u倍体峰(0.25)及G2/M阻滞(0.08).结论:苯丙素甙诱导肿瘤细胞分化、凋亡可能是受端粒-端粒酶-细胞周期的依赖性调节,提示端粒酶抑制、端粒缩短及G2/M阻碍滞可作为肿瘤抑制靶向筛选的重要指标.
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端粒酶抑制剂与肝癌治疗的研究进展
端粒、端粒酶与肿瘤的关系十分密切,近年来大量文献报道,端粒酶的激活虽然不是引起细胞癌变的早因素,但确实是一个维持肿瘤生长的继发性因素.目前抑制端粒酶活性已成为抗癌新靶点,许多种端粒酶抑制剂已问世,现对端粒酶抑制剂及其治疗肝癌的研究进展介绍如下.
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010酰基鞘氨醇抑制端粒酶活性的分子机制
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小分子干扰核糖核酸抑制乳腺癌细胞端粒酶逆转录酶表达提高阿霉素化疗的敏感性
人端粒酶逆转录酶(bTERT)是端粒酶活性的限速酶[1].抑制hTERT表达可有效抑制端粒酶活性[2],增加化、放疗的敏感性[3].本研究旨在研究hTERT基因表达被干扰后,阿霉素化疗敏感性的变化.
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hTR反义寡核苷酸对人胰腺癌细胞Panc-1生物特性及端粒酶活性的影响
端粒酶持续激活导致恶性肿瘤细胞获得无限增殖能力,人端粒酶RNA组分(hTR)对端粒酶活性维持具有重要作用,破坏端粒酶RNA组分的模板功能,即可抑制端粒酶活性[1].我们针对hTR模板区设计合成反义寡核苷酸(ASODN),观察其对Panc-1端粒酶活性及细胞生长的影响,为胰腺癌基因治疗提供新的实验依据.
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端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸对人肝癌细胞生长抑制的研究
本实验旨在探讨端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸(ASODN-t)抑制端粒酶活性[1],诱导肝癌细胞凋亡,从而抑制肝癌细胞生长的作用[2],为肝癌基因治疗提供依据,现将结果报道如下。 一、材料和方法 1. ASODN-t对细胞抑制作用的观察: 取2×107个/L对数生长期肝癌细胞(肝癌细胞株SM MC -7721 引自中国科学院上海细胞生物研究所细胞库)接种于96孔的细胞培养板中,每孔100 μl,设3个复孔。分别加入ASODN-t(上海生工生物工程公司合成,序列为5’-CT CAGTTAGGGTTAGACA-3’,调节其终浓度分别为1、2、3、4、5 μmol/L)、无关寡聚核苷酸(N-ODN,上海生工生物工程公司合成,序列为5’-CATTTCTTGCTCTCCACG- 3’,终浓度为3 μmol/L),培养24、48、72、96 h,于结束前4 h加入质量分数为0. 5%四唑蓝(MTT)20 μl,继续培养4 h,再加入SDS溶液100 μl,终止反应。37 ℃培养箱过夜,用酶联免疫检测仪检测各孔在波长570 nm的吸光度A值。 2.形态学观察: 在培养状态下,倒置显微镜观察细胞生长状况及形态学改变,并将5 μm ol/L的ASODN-t处理3 d的细胞在荧光显微镜下观察凋亡细胞的形态。 3.DNA抽提及电泳: 将1×109个/L肝癌细胞经5 μmol/L ASODN-t处理3 d后按试剂盒方法抽提DNA,取抽提好的DNA 5 μl,在质量分数为2.0%琼脂糖凝胶,80 V电压条件下电泳 3 h,紫外光透射仪下观察电泳条带并拍照。 4.流式细胞仪分析: 将1×109个/L肝癌细胞与5 μmol/L ASODN-t共同孵育3 d,磷酸盐缓冲液(PBS)清洗2次,加无水乙醇固定24 h,随后清洗细胞,与含有质量分数为1.0% RNA 酶的Tris-HCl 缓冲液(pH 7.4)共同孵育10 min,碘化丙啶DNA染色后上机检测。 5.端粒酶活性测定:同上法肝细胞孵育3 d,按试剂盒要求处理细胞,取反应管,各加入45 μl反应混合物、2 μl已处理的标本,混匀,加入30 μl液体石蜡,置25 ℃水浴保温 30 min,在聚合酶链反应(PCR)仪上循环,94 ℃120 s,94 ℃30 s,48 ℃30 s,72 ℃90 s ,72 ℃300 s。循环35次。循环结束后,在微孔板各孔中加入杂交反应液,再加入扩增产物 25 μl混匀,设立阴阳及空白对照,置37 ℃恒温反应60 min。加入显色剂,37 ℃避光显色 10 min,加入终止液,终止反应。在波长450 nm读取A值。 二、结果 1.ASODN-t对细胞生长的影响(图1): 不同浓度ASODN-t与2×107个/L肝癌细胞共同孵育后,细胞生长受到抑制,这一抑制作用随浓度的升高及作用时间的延长而加强。N-ODN(对照组)对肝癌细胞无作用。 2.细胞形态学变化: 倒置显微镜下可见N-ODN作用的细胞及不加药组细胞呈上皮型贴壁生长,细胞轮廓清楚,细胞间结构紧密,细胞生长旺盛;而ASODN-t组细胞有部分变圆浮起,细胞间接触变松,增殖减慢,细胞中颗粒增多,随药物浓度增高,细胞周围碎片增多,并将5?μmol/L?ASODN-t处理3?d的细胞在荧光显微镜下观察,细胞核染色质深染,聚积于核膜下呈新月形,膜突起呈小泡样,小泡脱落形成含核小体片段的凋亡小体。而N-ODN(对照组)作用的细胞及不加药细胞无明显形态学变化。 3.DNA电泳结果: 5?μmol/L?ASODN-t作用3?d后,肝癌细胞DNA电泳呈明显凋亡带,对照组则无凋亡带。 4.流式细胞仪分析结果: 流式细胞仪检测5 μmol/L ASODN-t作用3 d的肝癌细胞在G1 期前出现亚二倍体凋亡峰,对照组未见凋亡峰。 5.端粒酶活性: 5 μmol/L ASODN-t作用3 d后,肝癌细胞端粒酶活性明显受到抑制(A 值:0.06),不加药的肝癌细胞及N-ODN作用的细胞粒酶活性很高(A值:0.13、0.14) 。
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端粒酶应用于诊断肺癌的研究进展
端粒(telomere)是真核细胞线形染色体末端的DNA序列,含有TTAGGG简单的重复结构,它能防止染色体发生降解、端-端融合、重组和染色体丢失,起到稳定染色体的作用。随着细胞分裂次数的增多,端粒DNA逐渐缩短,终导致细胞死亡。端粒酶是由RNA和蛋白质组成的核糖核蛋白体,具有逆转录活性,能以自身RNA为模板从头合成端粒序列,以补偿细胞分裂时染色体末端的缩短[1]。近期研究表明,端粒酶与细胞增生、分化和不死性有着极为密切的关系,端粒长度的缩短和端粒酶活化是细胞获得永生和癌症发生的重要因素。自从1989年Morm首次在人的癌细胞系中发现端粒酶以来,利用端粒酶作为肿瘤的特异性标记物用以诊断和评估预后,并通过抑制端粒酶活性来治疗肿瘤已成为近年肿瘤研究的热点。端粒酶可作为肺癌诊断的标记物,其活性的测定对诊断肺癌恶性程度和病理分期具有重要价值。
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反义核苷酸抑制端粒酶活性与肿瘤的治疗
反义技术是根据碱基互补原则,用人工合成或生物体自身表达的特定序列的短片段核苷酸与靶基因或其mRNA配对结合,阻断靶基因表达的技术.自1978年,Zamecnick等首次用反义技术抑制病毒基因表达获得成功后,其应用前景就日益广阔.现主要用于分子生物学基础研究,肿瘤、遗传病、病毒感染的基因治疗,动、植物品种的改良等.
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质粒介导的RNAi抑制端粒酶活性
为了探讨靶向人端粒酶反转录酶(hTERT)基因的小干扰RNA(siRNA)表达载体是否具有抑制HeLa细胞端粒酶活性的能力,人工合成2条64个核苷酸(nt)的片段,其中19nt与hTERT基因1789-1807位碱基同源,将其退火、连接到质粒pSUPER中,构建pSUP-hTE.在pSUP-hTE基础上,把该质粒的启动子和64nt插入片段酶切、克隆到质粒pEGFP-C1中生成pEGFP- hTE,从而获得新霉素抗性筛选质粒.将pEGFP- hTE用脂质体转染HeLa细胞,G418筛选后获得抗性克隆并将其收获、传代,用不同方法检测hTERT的mRNA和蛋白表达水平、HeLa细胞的端粒酶活性以及细胞的增殖能力.结果显示,pEGFP-hTE转染的HeLa细胞与对照组比较,hTERT的mRNA水平下降及蛋白表达减少、细胞端粒酶活性降低38%,但细胞增殖能力没有明显改变.以上结果表明, pEGFP-hTE能通过RNA干扰(RNAi)途径特异性抑制HeLa细胞hTERT基因的表达,从而有效抑制细胞端粒酶活性,这可能将为肿瘤生物治疗提供一条新的途径.
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抗端粒酶活性治疗肿瘤研究进展
端粒酶与恶性肿瘤密切相关,90%以上的肿瘤中端粒酶活性增高,而在正常体细胞中一般为阴性.因此,通过抑制端粒酶活性治疗肿瘤成为一个非常诱人的新途径.本文就抗端粒酶活性治疗肿瘤的研究进展作一综述.