慢性 HCV 感染者外周血中 CD56＋T 细胞频数、表型和体外细胞毒功能研究

目的探讨慢性HCV感染者外周血中CD56＋T细胞的频数、表型和体外细胞毒功能特征。方法采用流式细胞术检测33例慢性HCV感染者及21例健康对照者外周血CD56＋T细胞的频数和细胞表面活化性受体NKG2C、CD16、NKp46和抑制性受体CD158a、NKG2A的表达水平；检测体外未刺激及K562细胞刺激作用下CD 56＋T细胞毒效应（ CD107a）和细胞因子分泌水平（ IFN-γ和TNF-α），并分析上述3种CD56＋T细胞功能指标之间的关联性。结果与健康对照相比，慢性HCV感染者外周血中CD56＋T细胞在淋巴细胞中的比例明显降低（ P＝00．18）。 CD56＋T细胞表面的活化性受体 NKG2C（P＝0．015）、CD16（P＝0．036）、NKp46（P＝0．001）均有不同程度降低，而抑制性受体CD158a、NKG2A未发现有统计学意义的差异（P＞0．05）。体外未刺激情况下，慢性HCV感染者CD56＋T细胞分泌细胞因子IFN-γ和TNF -α均显著弱于健康对照组（P ＜0．0001）；在K562细胞刺激作用下，慢性HCV感染者 CD56＋T细胞CD107 a水平及分泌细胞因子IFN-γ和TNF-α均呈显著降低趋势（ P＜0．0001），且3种功能指标表达水平密切关联（r＞0．80， P＜0．0001）。结论慢性HCV感染者CD56＋T 细胞频数降低，细胞毒能力和重要细胞因子分泌能力均明显减弱。该结果提示显著受损的CD56＋T细胞功能可能与HCV慢性持续性感染有关。

HTLV-1 Tax 蛋白对T细胞中HMGB1调控的影响

目的探讨人T淋巴细胞白血病1型病毒（human T-cell leukemia virus 1，HTLV-1）Tax蛋白对人高迁移率族蛋白1（ high mobility group box 1，HMGB1）基因转录调控的影响。方法提取TaxN和TaxP细胞总RNA和蛋白质，通过real-time PCR和Western blot分析HMGB1 mRNA和蛋白质的表达情况；利用脂质体介导方法，将6个含有不同长度HMGB1调控序列的pGL3-HMGB1-luc瞬时转染至TaxN 和 TaxP 细胞，观察 HMGB1基因在不同 T 细胞中的转录活性；pCMV-Tax 与 pGL3-HMGB1-luc瞬时共转染至Jurkat细胞，观察Tax蛋白对HMGB1基因的转录调控影响；染色体免疫共沉淀（ ChIP）找寻Tax蛋白影响HMGB1基因转录调控的区段。结果 TaxP细胞中HMGB1 mRNA和蛋白质表达水平高于TaxN细胞。 TaxN和TaxP细胞中HMGB1调控趋势基本相似，均表现出3号质粒（pHLuc3，含有-504～＋83 HMGB1区段）的相对荧光素酶活性（HMGB1/neo）高，但是6号质粒（含有-1163～＋83 HMGB1区段）却表现出 TaxP 细胞 HMGB1的转录活性明显高于 TaxN 细胞。pCMV-Tax与pGL3-HMGB1-Luc报告基因共转染到Jurkat细胞也显示，6号质粒（pHLuc6）中Tax促进HMGB1基因的转录。 ChIP分析证实了Tax蛋白可能富集在HMGB1的-1163～-1043区段。结论-504～-383可能是HMGB1基因转录激活的关键启动子区，Tax蛋白可能富集在HMGB1的-1163～-1043区段促进HMGB1基因转录。

妊娠诱导的调节性T细胞对na?ve T细胞抑制作用的体外研究

目的研究调节性T细胞（ Treg）及妊娠诱导的调节性T细胞（ piTreg）对na?ve T细胞增殖的体外抑制，评价其抑制率的差异。方法对孕12．5 d（E12．5d）异基因交配孕鼠C57/B6（♀）× BALB/c（♂）的piTreg和未孕雌鼠C57/B6鼠的 Treg 进行流式细胞术检测，观察piTreg 和Treg 在CD4＋T细胞中比例及其胞内Foxp3表达变化；采用羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯（ CFSE ）标记的na?ve T作为效应细胞和丝裂霉素C灭活的CD4-T细胞作为刺激细胞的单向混合淋巴细胞培养体系，比较piTreg和Treg对效应细胞的体外抑制强度。结果 piTreg水平明显高于Treg（P＜0．001），且这些细胞均表达高水平的Foxp3；piTreg 在体外实验中对na?ve T细胞的抑制效应明显高于Treg （ P＜0．006），并受其细胞数量的影响。结论妊娠诱导的调节性T细胞较来自于非孕鼠的Treg对na?ve T细胞有更明显的抑制作用，这一现象很可能是由妊娠中父系抗原刺激诱导的CD4＋CD25＋Treg活性差异造成。

金黄色葡萄球菌重组蛋白AtlM的体外抗菌效应初步探讨

目的通过基因工程技术获取金黄色葡萄球菌（ ATCC25923）自溶素片段AtlM重组蛋白（ rAtlM），初步探讨其体外抗菌效应。方法根据GenBank 中金黄色葡萄球菌atlM基因序列（ AC：D17366）设计合成特异引物，采用PCR技术扩增相应的序列并构建重组表达质粒pET-32а（＋）/atlM，经由IPTG诱导后通过等电点洗脱技术获取纯化的rAtlM；采用微量肉汤稀释法测定rAtlM对ATCC25923及其苯唑西林诱导耐药株的低抑菌浓度（ minimal inhibitory concentration ，MIC）；体外试验测定rAtlM对ATCC25923菌株及其耐药株的抗菌活性。结果成功构建了原核表达载体pET-32а（＋）/atlM，表达的重组蛋白AtlM对ATCC25923标准株和耐药株的MIC分别为8μg/ml和64μg/ml。体外抑菌试验显示rAtlM作用于ATCC25923标准株和耐药株1 h后即对细菌生长具有抑制作用（ P值分别为0．004和0．026），对标准株作用持续到5 h测定点（P＝0．012），对苯唑西林耐药株作用持续到3 h测定点（P＝0．001），5 h后与未加药物的对照组相比差异无统计学意义（P＝0．102）。结论50μg/ml的rAtlM对金黄色葡萄球菌（ ATCC25923）及苯唑西林耐药株初步显示出一定的抑菌作用，具有作为抗菌药物的可能性。

显色培养基联合简单生化试验鉴定常见氧化酶阴性革兰阴性杆菌的能力验证

目的对显色培养基联合简单生化反应鉴定常见氧化酶阴性革兰阴性杆菌的方案进行能力验证。方法以VITEK 2Compact全自动微生物分析系统鉴定细菌作为参考方法，计算联合应用科玛嘉定位显色培养基、吲哚试验、鸟氨酸脱羧酶试验、赖氨酸脱羧酶试验鉴定临床标本中常见氧化酶阴性革兰阴性杆菌的敏感度、特异性、似然比、约登指数、Kappa值等参数并进行McNemar检验，分析这一方案的真实性、与参考方法的一致性并比较经济成本。结果通过对8个属10个种共318株氧化酶阴性革兰阴性杆菌鉴定结果的分析表明，黏质沙雷菌、嗜麦芽窄食单胞菌、鲍曼不动杆菌的敏感度和特异性均为100％，大肠埃希菌、产气肠杆菌、肺炎克雷伯杆菌的敏感度和特异性均大于90％，阴沟肠杆菌、产酸克雷伯杆菌、弗劳地枸橼酸杆菌和奇异变形杆菌的特异性均大于90％，但灵敏度为75％～90％；除了弗劳地枸橼酸杆菌的Kappa值为0．5947外，其余均大于0．85；McNemar检验P值均大于0．05；本研究方案成本只有参考方法的10％。结论显色培养基联合简单生化试验可快速经济有效地鉴定数种常见氧化酶阴性革兰阴性杆菌。

儿童梅毒血清学检测方法学评价

梅毒属于苍白螺旋体引起的一种严重危害人类健康的性传播疾病，临床表现较为复杂，儿科更不易发现。梅毒检测方法主要分为病原体检测、血清学筛选试验及血清学确证试验，临床实验室多采用血清学筛选试验。

尿路致病性大肠杆菌ppk1基因缺失株的构建及其生物学特性研究

目的构建尿路致病性大肠杆菌CFT073的聚磷酸盐激酶1（ polyphosphate kinase ， PPK1）基因敲除株，并初步探索其体外生物学特性。方法以CFT073株为研究对象，利用Red同源重组技术敲除CFT073的ppk1基因，构建敲除株△pk1；通过细胞实验即以人膀胱癌上皮细胞5637为体外模型对CFT073野生型菌株、敲除菌株的黏附及侵袭能力进行比较；采用96孔板结晶紫染色法分析CFT073 ppk1基因敲除对其生物膜形成能力的影响。结果成功构建了CFT073 ppk1基因敲除株；敲除ppk1后，细菌对膀胱癌上皮细胞的黏附、侵袭能力较野生株都明显减弱；△pk1在各时间点570 nm处结晶紫吸光度值均较野生株的低。结论利用Red同源重组技术可成功敲除CFT073的ppk1基因，ppk1在尿路致病性大肠杆菌黏附、侵袭尿路上皮及生物膜形成过程中可能发挥了重要作用。

组织原位记忆T细胞的研究进展

黏膜部位是诸多病原体入侵的门户，近些年来新发的传染病大部分都是通过黏膜部位传播，如人类免疫缺陷病毒Ⅰ型（ human immunodeficiency virus，HIV-1）、流感等。面对各种外来病原体的不断入侵，免疫系统在黏膜部位也采取了多样的抵御措施［1］，如分泌防御素、黏蛋白以及趋化抗原特异性免疫记忆细胞的归巢［2］。在黏膜部位诱导抗原特异性的免疫记忆是近些年来黏膜免疫的重要目标。记忆T细胞是免疫记忆的主要载体之一，其形成经历了抗原特异性克隆的增殖、收缩和记忆3个时相，只有少数细胞终成为长效记忆性T细胞。与初始T细胞相比，记忆T细胞活化阈值很低，不需要专职抗原提呈细胞的协助；其维持与效应T细胞不同，不需要抗原的持续存在［3］。根据能否产生速发性效应功能以及归巢受体的表达，可将记忆性CD8＋T 细胞分为两群：中心记忆 T 细胞（ central memory T cell， TCM ）和效应记忆 T 细胞（ effector memory T cell， TEM ）。 TCM（表达CCR7和 CD62L分子），主要分布于淋巴结和脾，介导反应性记忆，再次接触抗原时迅速增殖，不直接行使效应功能；而TEM不表达归巢到淋巴结的分子CCR7和CD62L，主要存在于脾和淋巴组织以外的器官和组织［4］，不断参与周身循环［5］，可迁移至外周炎症组织显示速发性效应功能，增殖能力较低，介导保护性记忆。目前大部分对于记忆T细胞的理解主要是来源于对位于血液循环以及淋巴组织中的T细胞的研究。近年研究发现一种分化更为完全的记忆T细胞，因其长期存在于病原体感染过的组织部位而被命名为组织原位记忆T细胞（ tissue-resident memory T cells ， TRM ）。 TRM不参与血液循环以及淋巴循环［4］，在感染早期建立，其维持不需要外周循环中的TEM以及TCM的补充，并且为局部组织提供免疫保护。与TEM相比其在表型、功能特征以及组织分布上具有较大的异质性。实验表明这群定居在外周组织中的记忆T细胞在对抗局部感染的过程中起着重要作用，本文将就TRM的发现、定位、功能以及诱导与维持机制等方面的研究进展进行综述。

三种呼吸道病毒实验室检测方法比较

目的在3种呼吸道多病原检测方法中筛选出敏感的实验室检测方法。方法以73份上呼道感染病例咽拭子标本作为检测对象，利用3种呼吸道多病原病毒检测方法，对17种呼吸道病毒检测指标进行平行检测，根据不同呼吸道病毒检测指标检出率，评价3种试剂检测效果。结果自建RT-PCR及PCR检测方法共检出56个阳性指标，市售多重RT-PCR检测试剂盒共检出41个阳性指标，市售多重实时荧光RT-PCR检测试剂盒共检出87个阳性指标。结论多重实时荧光RT-PCR检测试剂盒具有更高的检出率，可用于呼吸道多病原病毒的实验室检测。

TIPE2-shRNA慢病毒载体的构建、病毒包装及功能检测

TIPE2（ TNFAIP8L-2， tumor necrosis factor-a induced protein-8-like 2）2008年作为新型免疫调节因子被首次鉴定出来［1］，它由184个氨基酸构成，具有与死亡受体结构域（ DED ）相似的结构域和6个保守的α螺旋结构，隶属于TNFAIP8家族。 TIPE2是一种胞质蛋白，高表达于髓系和淋巴系的免疫细胞。研究表明， TIPE2是炎症反应及免疫自稳过程中不可或缺的调控因子，可通过负调T cell receptor （ TCR）和Toll-like receptor （ TLR）信号通路来达到抗炎的目的，TIPE2缺失的老鼠可表现出脾脏肿大、体重减轻、多器官功能衰竭等［1］。近有研究发现，肝癌患者中 TIPE2蛋白水平明显降低，敲除TIPE2后Ras 下游Ral 及AKT等信号分子显著活化，从而拮抗细胞死亡，增强细胞迁移能力［2］，这就提示TIPE2可能具有除免疫调节之外的更多功能。本研究旨在构建针对TIPE2的特异性shRNA 慢病毒表达载体，包装高效的慢病毒颗粒，为深入探索TIPE2功能奠定良好的基础。

HCMV IE2蛋白调控功能研究新进展

人巨细胞病毒（ human cytomegalovirus ， HCMV）属于β疱疹病毒亚科，是人类疱疹病毒中大的一组病毒。在人群中，HCMV感染相当普遍，大多数感染呈临床隐性感染或潜伏感染；但在新生儿、免疫抑制或免疫功能低下的人群中则可引起临床显性感染，出现明显症状，甚至发生致死性疾病。而在孕妇，则可发生垂直传播，导致死胎、畸形以及婴幼儿神经系统发育障碍、智力低下等。 HCMV基因组全长超过240 kb的双链DNA，整个基因组含有250个开放阅读框（ ORF ）。在病毒感染过程中， HCMV基因的表达表现一定的时序性，可分为早早期（ IE ）、早期（ E）和晚期（ L）基因。病毒穿入细胞后， IE基因被宿主细胞因子激活并早表达，编码两种重要的调控蛋白 IE1（ IE72）和 IE2（ IE86）。其中 IE2（ IE86）蛋白是从 HCMV 基因组的开放阅读框UL122上翻译过来的，是一种重要的反式激活因子并在HCMV感染中发挥了重要作用。已有研究表明，IE2（ IE86）能反式激活细胞周期蛋白cyclinE启动子，并能延缓宿主细胞进入S期［1-2］。近年有资料证实，IE2（ IE86）调节许多与控制细胞周期相关的因子。 IE2（ IE86）是一种重要的病毒蛋白质，而缺少IE2（ IE86）的HCMV子代突变体不能进行复制。下面主要就IE2（ IE86）蛋白对病毒蛋白表达调控的作用作一综述。

2011年乌鲁木齐地区腹泻患儿中7种病毒性病原分子流行病学调查

目的通过分子流行病学调查，了解乌鲁木齐地区2011年度5岁以下腹泻患儿中7种病毒性病原的感染情况。方法2011年1月至2011年12月，采集新疆维吾尔自治区人民医院住院和门诊5岁及5岁以下腹泻患儿粪便标本315份， PCR 法检测腺病毒（ AdV ）， RT-PCR 法检测轮状病毒（RV）、爱知病毒（AIV）、人双埃可病毒（HPeV）、杯状病毒（HuCV）、肠道病毒（EV）、星状病毒（AstV）。结果315份粪便标本中7种病毒的检出率分别为RV 27．30％（86/315），AIV 18．41％（58/315），HPeV 12．38％（39/315），HuCV 12．06％（38/315），EV 5．08％（16/315），AdV 3．81％（12/315），2种及2种以上病毒混合感染达17．14％（54/315），未检出AstV。上述病毒感染均以2岁以下婴幼儿为主。 RV感染主要集中在秋冬季，AIV感染主要集中在下半年，HPeV、HuCV及EV感染主要集中在夏季，AdV感染成全年散发，无明显季节性。结论 RV感染是导致乌鲁木齐地区婴幼儿腹泻的主要病原，其次是AIV、HPeV及HuCV，EV和AdV感染在婴幼儿腹泻中的致病原作用也不容忽视。

扩张型心肌病患者血清中的β1-肾上腺素受体自身抗体通过β1-肾上腺素受体抑制CD4＋T淋巴细胞的增殖作用

目的探讨扩张型心肌病患者血清中针对β1-肾上腺素受体细胞外第二环（ the second extracellular loop of β1-adrenoceptor ，β1-AR-ECⅡ）功能表位肽段的自身抗体（β1-AA）对大鼠CD4＋T淋巴细胞增殖能力的影响。方法采用亲和柱纯化试剂盒提纯扩张型心肌病（ DCM）患者血清中的β1-AA；利用免疫磁珠分选技术分离出大鼠外周血单核细胞中的CD4＋T淋巴细胞，流式细胞技术检测CD4＋T细胞的阳性率；采用CCK-8试剂盒检测细胞增殖能力；流式细胞术检测CD4＋/CD8＋T淋巴细胞的比值。结果经免疫磁珠分选后CD4＋T淋巴细胞的阳性率为97．7％；β1-AA可浓度依赖性抑制CD3/CD28刺激的CD4＋T淋巴细胞增殖；β1-AA被β1-AR-ECⅡ中和后，该效应消失；β1-AR特异性阻断剂美托洛尔可完全阻断该抑制效应；β1-AA作用于总T淋巴细胞24 h后，CD4＋/CD8＋T淋巴细胞比值没有发生明显改变。结论从DCM患者血清中提取的β1-AA可能通过CD4＋T淋巴细胞表面的β1-AR途径，导致该细胞增殖能力下降。提示β1-AA可能会直接减少T淋巴细胞的数量，使得T淋巴细胞功能下降，进而导致免疫系统紊乱，参与DCM的发生发展。

血清可溶性 CTLA-4表达与重症肌无力的相关性研究

目的探讨血清可溶性细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4（CTLA-4）表达与福建地区重症肌无力（ myasthenia gravis ，MG）患者的相关性。方法 ELISA法检测福建地区80例MG患者（ MG患者分为激素未治疗组及激素治疗组，且激素治疗组进一步分为免疫抑制剂治疗组和胸腺切除组）和80例正常对照组血清可溶性CTLA-4（ sCTLA-4）水平。结果 MG激素未治疗组、激素治疗组的sCTLA-4均高于正常对照组[（6．03±3．58） ng/ml、（3．44±2．36） ng/ml vs （0．49±0．95） ng/ml]，它们之间的差别具有统计学意义（χ2＝100．67，P＜0．001）；其中激素治疗组sCTLA-4表达水平高于正常对照组（Z＝-9．03，P＜0．001），而 MG激素未治疗组sCTLA-4表达高于激素治疗组（Z＝-3．37，P＝0．001）；并且激素未治疗组激素治疗前后血清sCTLA-4水平差异有统计学意义（t＝3．10，P＝0．005）；胸腺切除术后sCTLA-4低于手术前（Z＝-2．21，P＝0．04），而免疫抑制剂治疗前后差异却没有统计学意义（Z＝-1．26，P＝0．21）。结论 sCTLA-4参与MG的发病机制，激素治疗、胸腺切除治疗减少sCT-LA-4表达。

人 IFN-λ1重组腺病毒对胃癌细胞增殖的影响及其机制研究

目的探讨Ad-hIFN-λ1重组腺病毒对胃腺癌细胞SGC-7901增殖的影响及其机制。方法分别用Ad-hIFN-λ1重组腺病毒、Ad-LacZ 空质粒及PBS对照组作用于人胃腺癌细胞SGC-7901，MTT法测定细胞增殖情况，RT-PCR检测胃癌SGC-7901中IFN-λ1 mRNA的表达，免疫荧光法检测hIFN-λ1蛋白的表达，Tunel、流式细胞术检测细胞凋亡。结果 Ad-hIFN-λ1转染胃腺癌细胞SGC-7901后，肿瘤细胞生长明显抑制，细胞中hIFN-λ1 mRNA、蛋白高效表达，细胞凋亡率明显高于Ad-LacZ组、PBS空白对照组。结论 Ad-hIFN-λ1重组腺病毒转染至胃腺癌细胞SGC-7901后表达IFN-λ1，Ad-hIFN-λ1能够显著抑制人胃腺癌SGC-7901细胞生长，并可能通过诱导其凋亡而起作用。

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