肿瘤细胞／糖脂类分子联合 TLR 9配体治疗小鼠结肠癌的效果研究

目的构建肿瘤细胞/糖脂类复合物联合TLR9配体的肿瘤疫苗，并探讨上述肿瘤疫苗对小鼠结肠癌的治疗效果。方法运用慢病毒转染GFP-CD1d至MC38肿瘤细胞构建CD1d-MC38细胞系，并加载α-Galcer（α-galactosylceramide ，α-GC）至上述细胞系制备CD1d-MC38/α-Galcer复合物。利用RT-PCR、流式细胞术检测MC38细胞系CD1d的表达情况以及对于α-Galcer结合效率。后建立小鼠MC38结肠癌皮下肿瘤模型，观察肿瘤细胞/糖脂类复合物联合TLR9配体的肿瘤疫苗（ CD1d-MC38/α-GC＋CpG1826）对于小鼠肿瘤的治疗作用，免疫组化方法检测肿瘤组织中CD4＋T和CD8＋T细胞浸润情况。结果成功构建了表达CD1d分子的CD1d-MC38细胞系，CD1d阳性的CD1d-MC38细胞比例为（98．10±2．53）％；且该细胞系能有效结合α-Galcer，随着α-Galcer浓度升高和加载时间的延长，其结合效率逐渐上升；CD1d-MC38/α-GC＋CpG1826肿瘤疫苗能有效延缓小鼠皮下肿瘤生长（与其余各组比较，P＜0．01），延长荷瘤小鼠生存时间（与CD1d-MC38/α-GC组比较，P＜0．05；与其余各组比较，P＜0．01）；肿瘤组织免疫组化显示，实验组肿瘤组织中有更多的CD4＋T细胞和CD8＋T细胞浸润，与CD1d-MC38/α-GC组比较，差异无统计学意义（P＞0．05），与其余各组比较，差异有统计学意义（P＜0．01）。结论肿瘤细胞/糖脂类复合物联合TLR9配体的肿瘤疫苗能抑制小鼠肿瘤生长，延长荷瘤小鼠生存期，发挥抗肿瘤作用有赖于CD4＋T细胞和CD8＋T细胞。

S1P受体激动剂FTY720抑制小鼠体内成熟DC的分布并减轻急性GVHD

目的探讨S1P受体激动剂FTY720在异基因造血干细胞移植后急性移植物抗宿主病（acute graft-versus-host disease，aGVHD）进程中的作用及其可能的机制。方法 BALB/c （H2d）受体鼠接受750 cGy全身性致死性辐照，4 h后通过尾静脉注射的方法输注1×107个C57BL/6（H2b）小鼠来源的骨髓细胞和5×106个全脾细胞，建立aGVHD模型。从移植前第1天（ day 1）至移植后第4天（day 4）每天给小鼠腹腔注射FTY720（3 mg/kg）或等体积对照组溶剂，观察小鼠生存。移植后第4天采用流式细胞术检测两组小鼠的脾脏、肝脏、肺和小肠4个脏器中的免疫细胞的表型。结果FTY720能显著延长异基因造血干细胞移植后aGVHD的相关存活；流式细胞术结果发现FTY720能显著抑制肺和小肠中成熟DC的分布。结论 FTY720能显著抑制肺和小肠中成熟DC分布，从而减轻aGVHD。

河南省2012至2013年6株风疹病毒分离株E1区基因特征分析

目的：了解河南省风疹病毒分离株的基因特征，为制定风疹的预防和控制策略提供依据。方法分离病毒，RT-PCR获取风疹病毒E1基因扩增产物，核苷酸序列测定，进行E1基因核苷酸与氨基酸特征分析。结果河南省风疹病毒分离株以1 E基因型为主，1 F基因型仅在2002年出现，2 B基因型自2013年开始出现；E1基因核苷酸序列同源性为87．8％～100％，氨基酸序列同源性为67．0％～100％，血凝抑制位点和中和位点等重要抗原位点均未发生变化，抗原性稳定，1 E基因型的第338位氨基酸发生Leu到Phe的改变。结论河南省风疹病毒分离株以1 E基因型为主。

利用深度测序技术发现新疆库蚊黄病毒

目的：对我国新疆地区蚊虫携带的病毒类群进行调查，并快速发现医学重要的蚊媒病毒。方法利用Illumina深度测序技术筛查野生库蚊体内的病毒源性RNA，利用RT-PCR进行验证，通过序列比对分析病毒亲源关系。结果深度测序技术共检出144条库蚊黄病毒特异性读序，拼接获得7个不连续的病毒基因组重叠群片段。 RT-PCR扩增产物能够覆盖重叠群间隙序列。在此基础上，重构获得病毒基因组5′和3′末端片段（约678 nt、411 nt）。对5′末端序列比对分析结果表明，新疆库蚊黄病毒属于北美/亚洲基因亚型，与国内发现的库蚊黄病毒共同形成一个独立分支，核苷酸序列同源性为98．2％～99．5％，氨基酸序列同源性高于95．5％。结论深度测序技术成功应用于新疆地区虫媒病毒的快速甄测，首次从新疆地区发现库蚊黄病毒，为虫媒病毒监测提供了一条新途径。

转录因子 Sp1在人肾小球系膜细胞 IP3 R1表达中的作用

目的探讨转录因子Sp1在肿瘤坏死因子（ TNF-α）上调人肾小球系膜细胞（ HMCs ） IP3R1表达中的作用，进一步阐明肝肾综合征（ HRS）肾小球滤过率（ GFR）下降的分子机制。方法用实时定量PCR和免疫印迹检测TNF-α刺激HMCs后，IP3R1 mRNA、IP3R1蛋白及Sp1蛋白表达的情况，重组质粒PGL3-IP3R1 promoter瞬时转染HMCs，应用荧光素酶报告基因检测TNF-α对IP3R1启动子活性的影响；应用Sp1和DNA结合抑制剂光辉霉素（ Mithramycin A ）及Sp1-siRNA质粒瞬时转染预处理HMCs后，检测IP3R1蛋白表达的变化。此外，免疫印迹法检测肿瘤坏死因子受体（ TNFR）对Sp1的活化及IP3R1蛋白表达的影响。结果 TNF-α作用HMCs后，IP3R1 mRNA、IP3R1蛋白和Sp1蛋白表达均明显增加，TNF-α显著增强IP3R1基因启动子的活性，Mithramycin A呈剂量依赖性阻断TNF-α诱导IP3R1蛋白表达上调，Sp1-siRNA预处理HMCs后，IP3R1蛋白表达明显下降。 TNFR1抗体＋TNF-α组和TNFR2抗体＋TNF-α组，IP3R1蛋白表达均有不同程度的下降。 TNFR1抗体＋TNF-α组Sp1蛋白表达明显下降，而TNFR2抗体＋TNF-α组，Sp1蛋白表达无明显变化。结论 TNF-α能上调人系膜细胞IP3R1的表达，TNF-α可能通过TNFR1/Sp1上调IP3R1的表达。

慢性阻塞性肺疾病患者 Th17／Treg 细胞失衡与肺功能相关性研究

目的研究慢性阻塞性肺疾病（ COPD）患者Th17细胞和Treg细胞介导的免疫应答变化及免疫失衡与肺功能下降程度的可能内在联系。方法选择2009年1月-2012年12月在本院门诊及住院治疗的COPD中重度、极重度患者和肺功能正常的吸烟者及不吸烟的正常对照者作为研究对象，分别测定肺功能，并采集外周血和诱导痰。采用流式细胞仪技术测定外周血中Th17细胞和Treg细胞比例，ELISA方法测定血清及诱导痰上清液相关细胞因子，荧光定量 PCR方法测定相应的转录因子ROR-γt 和Foxp3表达水平，并分析Th17/Treg细胞平衡与肺功能下降程度的相关性。结果与肺功能正常组和正常对照组相比，COPD患者外周血Th17细胞比例、相关细胞因子IL-1β、IL-6、IL-17 A、TGF-β及转录因子ROR-γt表达水平升高，且重度和极重度患者升高更加明显；而Treg细胞比例、细胞因子IL-10及转录因子Foxp3表达水平则明显降低。诱导痰上清液相关细胞因子变化趋势与外周血Th17和Treg细胞的变化趋势一致。 Th17/Treg细胞比值与FEV1、FVC和FEV1/FVC呈显著负相关。结论 Th17/Treg细胞平衡失调与COPD患者的肺功能下降密切相关，可能参与了COPD的疾病进展过程。

IL-22诱导类风湿关节炎患者滑膜成纤维细胞分泌 IL-6促进 Th17细胞分化的研究

目的：探讨白细胞介素-22（IL-22）刺激类风湿关节炎滑膜成纤维细胞（RASF）产生白细胞介素-6（IL-6）的水平，及间接调控IL-17＋CD4＋T（Th17）细胞分化的能力。方法分离RASF 6例，建立体外培养体系，IL-22刺激RASF，qRT-PCR及ELISA检测IL-6的表达；IL-22R1封闭抗体及抑制剂实验检测IL-6产生所涉及的特异性受体及其下游信号通路；建立RASF与健康志愿者CD4＋T细胞共培养体系和Transwell 体系，流式细胞术检测体系中各组 Th17细胞比例。结果 IL-22刺激RASF呈时间和剂量依赖性产生IL-6（P＜0．05），且IL-6产生依赖于IL-22R1及其下游的p38和JAK2通路（P＜0．05）；共培养体系和Transwell体系中发现IL-22预刺激RASF组较未刺激组Th17细胞比例增加，阻断IL-22R1或IL-6均能降低Th17细胞比例。结论 IL-22刺激RASF产生IL-6，进而促进Th17细胞分化，中和IL-22是RA治疗的有效策略。

hMSH2参与Vγ9δ2T细胞介导的胃癌细胞株杀伤作用

目的：探讨Vγ9δ2 T细胞识别的肿瘤相关内源性新蛋白质配体MutS同源蛋白2（hMSH2）在胃癌免疫中的作用与意义。方法通过特异性抗体阻断胃癌细胞膜异位表达的hMSH2分子，观察Vγ9δ2 T细胞杀伤功能变化及IFN-γ和TNF-α分泌情况；使用肿瘤组织芯片（ TMA）免疫组化染色分析hMSH2在胃癌中的亚细胞分布。结果 hMSH2在胃癌细胞中存在较高水平的膜异位表达；anti-hMSH2抗体封闭后， Vγ9δ2 T 细胞对胃癌细胞的杀伤效率显著降低， IFN-γ分泌减少， TNF-α分泌则增多；hMSH2在不同类型、不同分期的胃癌组织中均呈异常的细胞膜、细胞质分布，但细胞核表达并未明显减低或缺失，作为非癌对照的浅表性胃炎组织标本hMSH2表达亦明显增强。结论异位表达的hMSH2可作为内源性应激性配体促进Vγ9δ2 T细胞杀伤胃癌细胞及分泌IFN-γ，在胃癌固有免疫中具有重要意义。

HLA-G 与慢性炎症性疾病的研究进展

非经典人类白细胞抗原G（ human leukocyte an-tigen-G， HLA-G）是机体内重要的免疫耐受分子，经选择性剪切可产生4种膜结合型 HLA-G 蛋白（ mHLA-G，HLA-G1～G4）和3种可溶型HLA-G蛋白（ sHLA-G， HLA-G5～G7）。相对于 HLAⅠ类分子，HLA-G具有有限的基因多态性，且存在多个位点和sHLA-G表达水平显著相关，其中研究多的是14 bp插入／缺失等位基因多态性（14 bp＋／-多态性）。当HLA-G基因为14 bp插入纯合子时，外显子8起始区的一个92 bp片段将被剪切，从而有助于HLA-G mRNA转录水平更稳定。但HLA-G转录水平与蛋白表达存在不均一性，中国汉族人种基因型为14 bp＋／＋人群外周血 sHLA-G 较14 bp＋／-、14 bp-／-人群外周血sHLA-G分泌水平显著降低，进一步提示HLA-G 14 bp＋／-多态性在sHLA-G分泌过程中发挥了至关重要的作用［1］。

CaN／NFAT信号途径对诱导性CD4＋CD25＋Foxp3＋调节性T细胞的影响

钙调神经磷酸酶依赖的活化T细胞核因子信号（ calcineurin／nuclear factor of activated T-cells， CaN／NFAT signaling ）是免疫系统中重要的免疫调节信号，通过对Foxp3＋iTreg、生长因子、细胞因子及细胞间相互作用的影响，广泛发挥免疫调节作用，对T细胞耐受的诱导和维持具有重要的作用。其异常可以导致外周免疫耐受缺失，引起多种免疫相关性疾病，本文就这方面的研究进展作一综述。

TIPE2对固有免疫应答的调控及信号通路

免疫系统在进化过程中建立了复杂而精细的调控机制，以产生适度的免疫应答来维持机体免疫系统平衡，使之既能清除异物抗原或病原微生物，又不因免疫过强而损伤机体正常组织。这种免疫自稳功能是免疫系统特有的，通过维持一定数量的免疫细胞以预防过强的炎症反应的能力。研究表明有两类分子对免疫系统维持内环境稳定是必需的，第一类具有限制免疫细胞激活和扩张强度的功能，包括：（1）抑制性细胞因子如TGF-β、IL-10［1-2］；（2）抗原受体信号和Toll样受体信号的负调节子如细胞毒T淋巴细胞相关抗原（ CTLA-4）、核因子-κB 抑制子（IκB）、细胞因子信号抑制子（ Socs1）等［1-3］；（3）抑制性转录因子如Foxp3［1-3］。第二类分子具有调控细胞凋亡的功能，包括凋亡相关因子（ Fas）、凋亡调节蛋白（ Bim ）、Bcl-2相关X蛋白（ Bax ）和caspase-8，caspase-10等［1，3-4］。当这些分子在免疫系统中被耗竭时，免疫稳态失衡，可导致炎症性疾病、组织器官的坏死，威胁生命安全。肿瘤坏死因子α诱导蛋白8样分子2（ tumor necrosis factor-induced protein 8 like-2，TIPE2）是新近发现的对维持免疫系统的稳定起重要作用的分子，归属于肿瘤坏死因子α诱导蛋白8（ TNFAIP8）家族［3］。通过TIPE2基因敲除、敲低以及转染等一系列实验证实TIPE2是细胞免疫功能的负调节者，可调控固有免疫和适应性免疫，阻止免疫系统的高反应性，维持机体免疫系统的平衡［3］，在炎症性疾病、自身免疫性疾病、肿瘤等疾病中发挥重要作用。下面主要就TIPE2在固有免疫中的进展作一综述。

乙脑病毒包膜蛋白可溶性表达及纯化

目的：通过原核表达载体对乙脑病毒包膜蛋白进行可溶性表达和纯化。方法筛选不同的表达载体、宿主菌株、表达条件，以获得可溶性的目的蛋白表达。采用镍柱和凝胶过滤层析对表达蛋白进行纯化。结果对不同的载体、菌株、表达条件筛选后，终发现PBCX载体与乙脑病毒包膜蛋白E406基因连接后的质粒，在低温诱导后获得可溶性E蛋白表达，且表达量较高。表达量占可溶性蛋白总量的23％。通过镍柱和凝胶过滤层析纯化后，目的蛋白纯度较高，达85％，满足试验需求。结论本研究获得了可溶性表达的乙脑病毒E蛋白，方法简单高效，为深入研究该蛋白生物学特性和功能，解析乙脑病毒的致病机制、乙脑减毒活疫苗毒株的减毒机制及其质量控制，乙脑诊断试剂开发，奠定了技术基础。

实时荧光定量法和PCR-DGGE技术研究大肠癌患者肠道微生态特征

大肠癌是常见的恶性肿瘤之一，随着我国经济发展以及人群膳食结构、生活方式的转变，其发病率逐年升高。长期以来，大肠癌的早期诊断基本靠传统的肠镜检查，对被检查者有一定的诊疗风险和痛苦，不易于推广。研究发现，哺乳动物肠道中有多达1000余种、1014个以上的细菌与之共存。肠道菌群的生态状况、其代谢产物及产生的抗原可通过与机体代谢和免疫的相互作用对宿主产生巨大的影响，与肠癌的发生密切相关［1］。了解大肠癌患者和健康人群之间肠道菌群的异同，探索肠道菌群检测在大肠癌早期筛查中的可行性具有潜在意义［2］。本研究采用实时荧光检测（ real-time q-PCR）及变性梯度凝胶电泳（ denatured gradient gel electrophoresis ， DGGE）技术分别从定量、定性角度对大肠癌和正常个体粪便样品进行检测，以期发现大肠癌患者与健康人群肠道菌群的异同，找到肠道微生物的指示菌群，为疾病的预防和早期监测提供一定的理论依据。

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