创伤弧菌溶细胞素对小鼠肝脏CD4+T细胞线粒体数量及CD62L表达的影响

目的：研究重组创伤弧菌溶细胞素(rVvhA)对小鼠肝脏 CD4+T 细胞的细胞毒活性及其对线粒体数量和 CD62L 表达中的作用,了解其对肝脏不同类型 CD4+ T 细胞存活率的影响。方法利用大肠埃希菌表达系统重组表达创伤弧菌溶细胞素,体外作用 C57BL/6小鼠的肝脏单个核细胞,采用流式细胞术结合 CD4、CD44、CD62L、Live/ Dead、MitoTracker Red 和 JC-1等荧光抗体(或探针)检测分析 rVvhA 对肝脏 CD4+ T 细胞及其亚群的存活率、线粒体数量和线粒体膜电位的影响。结果rVvhA 体外作用6 h 后,小鼠肝脏 CD4+T 细胞的存活率下降,rVvhA 对 CD4+初始 T 细胞和效应性 T 细胞均有杀伤作用,且 CD4+T 细胞 CD62L 的表达明显下调,此外,CD4+T 细胞的线粒体数量减少,线粒体膜电位显著下降。结论重组创伤弧菌溶细胞素对 CD4+T 细胞的细胞毒活性可能与 CD62L 表达、抑制线粒体数量和膜电位有关。

Caspase-1介导糖原合酶激酶-3β促进D-氨基半乳糖联合脂多糖诱导的小鼠急性肝衰竭肝损伤

目的：研究半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白水解酶-1(caspase-1)在 D-氨基半乳糖(D-GalN)联合脂多糖(LPS)诱导的小鼠急性肝衰竭(ALF)中的作用及其可能机制。方法以 C57BL/6小鼠为研究对象,通过腹腔注射溶于生理盐水的 D-GalN(450 mg/ kg)联合 LPS(10μg/ kg)构建小鼠ALF 模型；将小鼠分为对照组、氟甲基酮( caspase-1抑制剂,Z-WEHD-FMK)单独处理组、ALF 组、Z-WEHD-FMK 干预组。组织病理学分析及血清转氨酶活性测定观察肝组织损伤严重程度；Western blot 检测肝脏组织中 caspase-1以及糖原合激酶-3β(GSK-3β)磷酸化的表达；qRT-PCR 检测细胞炎症因子基因表达。结果 caspase-1 mRNA 和蛋白水平在急性肝衰竭疾病进展过程中活性升高。给予Z-WEHD-FMK 抑制 caspase-1活性后,可显著改善肝脏病例损伤并且降低血清 ALT、AST 水平[ALT：Z-WEHD-FMK 干预组(479.2±39.5) U/ L,ALF 组(998.5±60.4) U/ L,P<0.05；AST：Z-WEHD-FMK干预组(478.5±28.6) U/ L,ALF 组(1180.7±91.4) U/ L,P<0.05]；此外,Z-WEHD-FMK 干预组炎症因子 TNF-α、 IL-1β、 IL-18、 IL-33的 mRNA 水平表达下调； Western blot 显示 Z-WEHD-FMK 抑制caspase-1活性后,GSK-3β发生磷酸化而活性受抑制。结论急性肝衰竭疾病进展过程中,caspase-1活化提高了 GSK-3β活性,促进炎症反应的发生并导致肝脏组织的损伤。

降脂益生菌对非酒精性脂肪肝大鼠胆汁酸代谢的影响及机制

目的：探讨降脂益生菌 DM9054(鼠李糖乳杆菌)联合86066(植物乳杆菌)对非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)胆汁酸代谢的影响及其可能机制。方法21只雄性 SD 大鼠随机分为对照组、模型组及益生菌干预组。高脂饮食20周建立大鼠 NAFLD 模型,造模同时给予干预组大鼠鼠李糖乳杆菌联合植物乳杆菌灌胃,对照组及模型组给予生理盐水灌胃。干预结束后,我们检测了各组大鼠甘油三酯、胆固醇水平以及血清 CK18-M30水平。并使用 real-time PCR 评估了胆固醇7α-羟化酶(CYP7A1)、纤维生长因子受体4(FGFR4)、法尼醇受体( FXR) mRNA 以及回肠 FXR、ASBT、纤维生长因子15( FGF15) mRNA表达水平。 Western blot 检验肝脏 CYP7A1、FXR 及回肠 ASBT 蛋白表达水平。免疫组织化学法分析肝脏 FXR 及肠道 FXR 蛋白表达水平。结果与模型组相比,降脂益生菌干预可显著改善肝脏脂质沉积及损伤,上调肝脏 CYP7A1表达水平,抑制肝脏 FXR,激活肠道 FXR-FGF15通路,降低 ASBT 表达,且差异均有统计学意义(P<0.05),虽然降脂益生菌可使肝脏 FGFR4 mRNA 表达下调,但差异无统计学意义(P>0.05)。结论降脂益生菌可能通过抑制肝脏 FXR 通路及肠道 ASBT 负反馈上调 CYP7A1的表达,并激活肠道 FXR-FGF15通路,促进胆汁酸代谢,从而起到改善非酒精性脂肪肝的作用。

社区获得性血流感染产 ESBLs 大肠埃希菌与肺炎克雷伯菌流行情况及危险因素初步分析

目的：了解我院社区获得性血流感染大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)的发生率、危险因素、基因型分布及流行情况,评价针对产 ESBLs 细菌感染对常用抗生素的敏感性。方法收集四川省人民医院2013年1月至2014年12月42例社区获得性血流感染大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌进行 ESBLs 确证试验；琼脂稀释法测定产 ESBLs 株对13种抗菌药物的敏感性；采用 PCR 法确定产 ESBLs 株基因分布情况；利用多位点序列分型(MLST)了解产 ESBLs 株的流行情况；多因素 Logistic 回归分析产 ESBLs 株患者的临床资料,以确定感染的危险因素。结果42例社区获得性血流感染大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌产 ESBLs 率分别为56.3%、20.0%；20株产 ESBLs 菌株的药敏结果显示对亚胺培南、美罗培南、厄他培南、呋喃妥因和拉氧头孢均敏感；对阿米卡星、哌拉西林/他唑巴坦和磷霉素耐药率低,分别为95%、90%、85%；对头孢噻肟、左氧氟沙星、环丙沙星、头孢吡肟耐药率较高,分别为100%、80%、80%、75%；20株产 ESBLs 菌株基因扩增结果显示有7株仅携带1种 CTM 基因,13株同时携带两种基因主要为 TEM+CTM-M-14、TEM+CTM-15；18株产 ESBLs 大肠埃希菌共发现10种 ST 型,以 ST131型菌株多；其次是 ST10和 ST38。恶性肿瘤可能是本研究的危险因素。结论本地区社区获得性血流感染产 ESBLs 大肠埃希菌流行情况严峻,恶性肿瘤可能是大肠埃希菌与肺炎克雷伯菌产 ESBLs 的危险因素；产 ESBLs 菌株基因型主要为 TEM+CTM-M-14,主要流行克隆为 ST131型。碳青霉烯类及酶抑制复合剂是治疗社区获得性血流感染产 ESBLs 大肠埃希菌与肺炎克雷伯菌的理想药物。本次研究的标本数量较少,有待扩大菌株数量做进一步研究。

甘磷酸胆碱对霍乱弧菌转录调控因子 AphB 活性的影响

霍乱(Cholera)是一种急性、烈性的腹泻性疾病,霍乱弧菌(Vibrio cholerae)为该病的病原体。霍乱弧菌对毒力基因进行调控依赖于复杂的调控系统[1],ToxR 是该系统中重要的调控因子,系统中还需要重要的膜蛋白 TcpP 的参与。研究表明,tcpP 的表达受 AphB 蛋白的影响[2],该蛋白也可结合ToxR 的启动子区[3],进而调控毒力基因的表达。 AphB 同时作用于多个关键因子[4],可见其在调控系统中发挥着重要作用。 AphB 属于 LysR 家族转录调控因子,该家族蛋白与辅助诱导物结合后构象发生变化,变化后的蛋白调控能力更强。有研究者推测[5],AphB 的调控作用可能需要与辅助诱导物结合,但目前为止还没有关于上述辅助诱导物的相关报道。本研究拟用化合物甘磷酸胆碱(L-A-glycerophosphorylcholine, GPC)来研究其对转录调控因子 AphB 活性的影响。

新生隐球菌毒力差异菌株的全基因组测序及毒力相关基因的筛选

目的：了解及分析新生隐球菌格鲁比变种(Cryptococcus neoformans var grubii)两组毒力差异明显的多位点微卫星型(multilocus microsatellite typing,MLMT)菌株的全基因组序列,筛选出引起其毒力差异的相关基因。方法选取毒力差异为明显的不同基因型菌株各1株进行全基因组重测序,运用比较基因组学方法全面分析测序结果,使用非同义 SNPs(non-synonymous SNPs,nsSNPs)、无义突变 SNPs、产生移码突变 InDels 的策略广泛筛选差异基因。对筛选出的基因在所有实验菌株中进行 DNA 测序验证,并提取总 RNA,采用快速扩增5′和3′cDNA 末端(rapid amplification of 5′ and 3′cDNA ends,RACE)技术,克隆后测序获得对应基因的完整 cDNA 全长序列信息。结果通过全基因组重测序,环境株 IFM56731和临床株 IFM56800均分别获得127倍和111倍覆盖率的有效数据。分别对 SNPs 和 InDels 数据进行统计分析,应用无义突变 SNPs 和产生移码突变的 InDel 分别筛选出3个差异基因。对筛选出的6个基因在所有实验菌株中进行扩增测序,并对其中3个基因进行 cDNA的测序分析,终确定基因 CNAG_01032的转录序列位置和结构,并验证了预测的无义突变位点存在于实际的 mRNA 中。结论本研究通过全基因重测序数据分析证明,应用无义突变 SNPs 和产生移码突变的 InDels 进行差异基因筛选的策略具有较好针对性,并筛选出6个潜在与毒力相关的基因,通过对所有实验菌株的测序和对全长 cDNA 的测序验证,终筛选出基因 CNAG_01032为可能引起菌株毒力差异的基因。

胃癌患者外周血 CD14bright CD16bright 亚群及其临床意义

目的：检测胃癌(gastric cancer, GC)患者外周血 CD14bright CD16bright亚群并分析其临床意义。方法选取124例胃癌确诊患者,以慢性胃炎患者和正常献血员为对照,采用流式细胞术检测外周血 CD14bright CD16bright亚群,通过秩和检验分析3组之间差异。采用受试者工作特征曲线(ROC 曲线)分析外周血 CD14bright CD16bright 亚群是否为胃癌诊断的有效生物标志物之一,多元相关分析CD14bright CD16bright亚群与临床参数的相关性及意义。结果胃癌患者 CD14bright CD16bright亚群占外周血和占 CD14bright 单核细胞中位数百分率分别为0.38%(0.23%~0.52%)和6.61%(4.23%~9.56%),均显著高于慢性胃炎患者[0.11%(0.07%~0.15%)和5.08%(3.35%~6.42%)]及正常献血员[0.05%(0.03%~0.07%)和5.09%(4.20%~7.40%)]( P <0.01)。外周血 CD14bright CD16bright亚群诊断胃癌疾病的 ROC 曲线下面积为0.934(95% CI：0.900~0.968),其诊断价值远高于甲胎蛋白(alpha fetoprotein,AFP)、癌胚抗原(cacino-embryonic antigen,CEA)、糖类抗原 CA199。通过Logistic 模型将 CD14bright CD16bright亚群与血清肿瘤标志物进行联合使用,其 ROC 曲线下面积为0.947(95% CI：0.920~0.973)。多元相关分析表明 CD14bright CD16bright亚群与淋巴细胞比率呈负相关(P<0.01)。结论胃癌患者外周血 CD14bright CD16bright亚群显著增加,可能是胃癌诊断的有效生物标志物之一。

贵阳地区153例哮喘患儿 IL-13G+2044A 和IL-13A-1512C 基因多态性研究

目的：探讨白细胞介素13(interleukin-13,IL-13)基因外显子4区 G+2044A 和启动子A-1512C 的单核苷酸多态性与贵阳地区儿童支气管哮喘的相关关系。方法用 Sequenom MassArray质谱阵列技术平台定制 SNP 芯片技术检测153例哮喘组儿童[男性89例,女性64例,平均年龄为(5.68±3.33)岁]和103例对照组儿童[男性65例,女性38例,平均年龄为(4.85±3.69)岁]IL-13G+2044A 和 IL-13A-1512C 的基因型分布。结果 IL-13G+2044A 在哮喘组和对照组儿童中均存在 GG、GA、AA 三种基因型,此位点的基因型频率分布在两组间的差异具有统计学意义(P<0.05)。 IL-13G+2044A 位点的 A 变异等位基因携带者患病危险性高于非携带者,差异有统计学意义(P<0.01)。在哮喘组和对照组 IL-13A-1512C 均存在3种基因型：AA、AC、CC,两组的基因型和等位基因频率,差异有统计学意义(P<0.01)。结论 IL-13G+2044A 和 IL-13A-1512C 多态性位点可能与贵阳地区儿童哮喘呈相关关系。 IL-13G+2044A 位点的变异等位基因 A 可能是贵阳地区儿童哮喘的重要易感因素。 IL-13A-1512C 位点的变异等位基因 C 可能是贵阳地区哮喘患儿的保护性因素。

以流式细胞术同时检测 caspase-1与碘化丙啶或 AnnexinⅤ分析小鼠骨髓巨噬细胞的炎性死亡

目的：明确以流式细胞术同时检测 caspase-1与碘化丙啶或 AnnexinⅤ的方法测定小鼠骨髓巨噬细胞炎性死亡的可行性。方法从野生型(wild type,WT) C57BL/6小鼠和/或 C57BL/6背景的 caspase-1-/-小鼠分离骨髓细胞,巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor, M-CSF)刺激分化7 d 成为骨髓巨噬细胞后,分别进行磷酸盐缓冲液(PBS)、脂多糖(LPS)、LPS+ATP (三磷酸腺苷)处理。蛋白印迹法(Western blot)和酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测细胞和上清中的 IL-1β和 caspase-1的切割成熟及分泌情况；乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)检测试剂盒检测细胞上清 LDH 的释放量；以3种流式细胞染色法：TMR red+caspase-1、PI(propidium iodide)+caspase-1和 AnnexinⅤ+caspase-1检测小鼠骨髓巨噬细胞的炎性死亡。结果 LPS+ATP 处理后,NLRP3炎症小体被激活(细胞和上清中有 IL-1β和 caspase-1的切割成熟和分泌)；WT 即 C57BL/6组细胞上清 LDH 的释放量多于 caspase-1-/-组,表明诱导发生的细胞死亡中存在依赖于 caspase-1的炎性死亡方式；流式细胞术同时检测 caspase-1与 PI 或 AnnexinⅤ,结果显示 LPS+ATP 处理组炎性死亡的百分比显著高于 PBS 组和 LPS 组,与已报道的流式检测 caspase-1+TMR red 方法的结果类似。结论流式细胞术同时检测 caspase-1与 PI 或 AnnexinⅤ的方法可用于确定小鼠骨髓巨噬细胞的炎性死亡。与已有的流式检测 caspase-1+TMR red 方法一样,这两种基于流式细胞术的炎性死亡的检测方法,为小鼠骨髓巨噬细胞的炎性死亡提供了更加直观精准的检测手段。

中国大陆地区乙型脑炎病毒一步法 TaqMan 荧光定量RT-PCR 检测方法的建立

流行性乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)是黄病毒科黄病毒属的单股正链 RNA 病毒,三带喙库蚊是其主要的传播媒介,感染人体后可引起流行性乙型脑炎(乙脑)。人群对本病普遍易感,15岁以下儿童发病率较高。大多数人感染后不会出现任何症状或只会引起一些轻微的症状；若治疗不及时,少部分感染者会发展为急性脑炎,病死率为20%~30%,30%~50%的康复者会留下严重的神经系统损伤后遗症,以儿童多见[1]。本病主要流行于亚洲地区,中国是乙脑的主要流行区域,每年都有病例报道。2013年,乙脑在山东省暴发流行,造成11人死亡。因此建立一种快速、准确的 JEV 特异检测方法对该病的早发现、早诊断、早治疗仍具有重要意义。 TaqMan 荧光定量 RT-PCR 具有敏感性高、特异性强、快速定量检测等优点。因此,本研究针对中国大陆地区已上传的91株乙脑全基因组序列进行比对分析,选取保守的区域设计引物及探针,利用荧光定量技术建立乙型脑炎病毒的一步法 TaqMan qRT-PCR 检测方法,并对该方法的灵敏性、特异性及重复性进行验证。

Carba NP 试验用于检测产碳青霉烯酶菌株的研究

耐碳青霉烯类抗菌药物的菌株是目前全球抗感染治疗的大威胁[1]，因其编码碳青霉烯酶的基因大多数由质粒介导，可在细菌之间水平转移，导致了菌株耐药基因的进化，使其在多个国家和地区之间暴发流行，并且部分产酶菌株低抑菌浓度(MIC)值达不到耐药水平，仅表现为对碳青霉烯类抗菌药物敏感性减低，容易引起人们的忽视。应用改良Hodge 试验[2]耗时长且对部分碳青霉烯酶敏感度低，已不能满足临床感染监控的需要。美国临床和实验室标准协会(CLSI)2015年药敏标准引入Carba NP 试验[3]的概念，以其操作简便、快速、灵敏度和特异度高的特点，很大程度上提高了产碳青霉烯酶菌株的检出率。本研究对比分析 Carba NP试验和改良 Hodge 试验检测碳青霉烯酶之间的差异，为临床实验室提供参考。

远程投稿系统作者常见问题

问题1：作者如何投稿？
　　(1)注册网站会员，邮箱获得登录名和密码；(2)申请成为杂志作者，需要给哪个杂志投稿，就申请成为哪个杂志的作者，一个作者可以同时申请成为多个杂志的投稿作者；(3)进入系统，点击左侧菜单栏【期刊管理系统】，点击之后系统会列出期刊系统作者的所有功能，点击【作者投稿】，按步骤一步步往下操作，后点击【投稿】，完成投稿操作。

本刊使用的医学缩略语

为了精简文字，使文章读起来更简练易懂，现将本刊常用且基础医学领域中所熟知的专业名词缩略语公布如下(按英文首字母顺序排列)，本刊在论文中将不再注释。

新关注--寨卡病毒

非洲的埃博拉疫情还没有完全结束，美洲就出现了一种虫媒病毒的暴发流行，这种虫媒病毒为寨卡病毒(Zika Virus)。2014年2月，智利在复活节岛发现了寨卡病毒感染的首位本土病例。2015年5月，巴西开始出现寨卡病毒感染疫情。截止2016年1月26日，有24个国家和地区有疫情报道，其中22个在美洲，目前欧洲多国也有报道，有蔓延全球之势。

《中华微生物学和免疫学杂志》征订启事

本刊启用稿件远程管理系统

为顺应当今期刊网络化、数字化的发展趋势，更好地为广大作者、读者提供高质量的服务，中华医学会杂志社开发了稿件远程管理系统。该系统根据中华医学会系列杂志稿件处理流程、编辑加工规范、审稿制度、管理规范等业务需求设计，采用先进的数据库及网络技术，具有强大的数据处理和分析能力。稿件远程管理系统将协助作者、编辑、审稿专家、编委、定稿会专家、总编等相关人员多位一体地进行稿件业务处理，解决编辑部对稿件网络化流程管理的需要，并实现各类查询功能。2009年9月，本刊正式启用稿件远程管理系统，访问中华医学会网站(http：// www. cma. org. cn)首页上方“业务中心”进行稿件处理操作。

基于全病毒颗粒的中东呼吸综合征冠状病毒抗体检测方法的建立

目的：建立基于全病毒颗粒的中东呼吸综合征冠状病毒(Middle East respiratory syn-drome coronavirus,MERS-CoV)感染的抗体检测方法,并将该方法用于 MERS 相关病例血清抗体(IgG与 IgM)的检测。方法采用基于灭活 MERS-CoV 颗粒作为检测用靶抗原,建立酶联免疫检测方法(ELISA),选取10份新生儿血清和40份正常成年人血清标本,确定 MERS-CoV IgM 和 IgG 抗体检测界值；在此基础上对我国第1例 MERS 感染病例的5份系列血清标本抗 MERS-CoV 抗体进行检测。结果全病毒灭活颗粒抗原与正常成人或儿童血清不存在明显交叉反应,可确定 MERS-CoV 抗体IgM 和 IgG 检测界值 A450分别为0.32和0.42。我国输入性 MERS 病例入院初期血清 IgM 和 IgG 抗体滴度均为1︰40,入院2周后 IgM 和 IgG 抗体阳转,滴度均有4倍以上升高,入院4周后 IgG 滴度可达到1︰640。结论建立了基于灭活全病毒颗粒的 MERS-CoV 特异性抗体的 ELISA 检测方法,该方法可用于 MERS 病例血清抗体(IgG 与 IgM)的检测。

小鼠抗中东呼吸综合征冠状病毒刺突蛋白受体结合区单克隆抗体的筛选

目的：制备抗中东呼吸综合征冠状病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus, MERS-CoV)刺突蛋白(S)受体结合区(receptor binding domain,RBD)的单克隆抗体(单抗),并对其特性进行鉴定。方法将昆虫-杆状病毒表达的 MERS-CoV S 蛋白 RBD 片段纯化后免疫 BALB/ c 小鼠,取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞 Sp2/0融合,通过有限稀释法筛选阳性克隆,用酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫印迹法(Western blot)和 MERS-CoV 假病毒中和试验对所获得的细胞克隆进行筛选和鉴定。结果共筛选出12株杂交瘤细胞,ELISA 证实其分泌的单抗与 MERS-CoV S 蛋白 RBD 片段有特异反应；双抗体夹心法鉴定其中两株单抗2E4和2F3为免疫球蛋白 IgM 型,其余10株均为 IgG1型；MERS-CoV 假病毒中和试验结果显示4株单抗：1F1、2E4、3C3、3E6有中和活性；Western blot 分析表明单抗1F1、2E4、3C3、3E6能特异识别 MERS-CoV S 蛋白,而不与 SARS-CoV S 蛋白的 RBD 反应。结论我们制备了12株针对 MERS-CoV S 蛋白 RBD 的鼠源单抗,所获杂交瘤细胞株特异性强,分泌抗体性能稳定,其中4株具有中和活性。

中东呼吸综合征冠状病毒流行病学进展

中东呼吸综合征(Middle East respiratory syndrome, MERS)是由中东呼吸综合征冠状病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus, MERS-CoV)引起的一种严重呼吸道传染病。本文将对 MERS 病原学特征与流行病学特征及研究进展进行简要综述。

中东呼吸综合征冠状病毒刺突蛋白受体结合区蛋白的原核表达纯化及鉴定

目的：对中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)刺突蛋白受体结合区(RBD)蛋白进行原核表达、纯化与鉴定及抗原性初步研究。方法人工合成密码子优化的 MERS-CoV RBD 编码基因,克隆至 pET30a(+)载体,构建重组表达质粒,转化至 BL21(DE3)。利用 IPTG 诱导,探索优化表达条件,并用镍离子亲和层析纯化,SDS-PAGE 和 Western blot 进行鉴定,并采用间接 ELISA 对原核表达的 RBD 进行抗原活性和特异性初步分析。结果重组 RBD 蛋白主要以包涵体形式表达,以37℃0.5 mmol/ L IPTG 诱导4 h 表达量高；变性复性后纯化获得了较纯的重组 RBD 蛋白,相对分子质量大小约为29×103,与预期一致；Western blot 表明其能与感染 MERS-CoV 的小鼠血清发生特异性反应；间接 ELISA 显示原核表达 RBD 蛋白在检测正常和 MERS-CoV 感染患者血清方面表现出较好的抗原活性和特异性。结论本研究首次利用原核表达系统成功表达并纯化获得重组 MERS-CoV RBD 蛋白,为 MERS-CoV 的免疫学检测及疫苗学研究提供了基础。

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