首页 > 文献资料
-
金黄色葡萄球菌PGRP的原核表达及生物信息学分析
目的 构建金黄色葡萄球菌PGRP基因片段的原核表达,对表达产物进行生物信息学分析. 方法 根据GenBank中收录的金黄色葡萄自溶素(autolysin,AtlA)基因序列(AC:D17366),设计其中pgrp基因片段的特异性引物,并通过NCBI Blast,在收录的所有金黄色葡萄球菌菌株中对相应的基因序列进行保守性分析.提取金黄色葡萄球菌(ATCC25923)的全基因组DNA为模板,采用PCR技术扩增pgrp基因序列,构建该基因的克隆载体pEASY-T1/pgrp及表达载体pET-32a(+)/pgrp,通过IPTG诱导表达重组蛋白PGRP.利用生物信息学相关软件(ProtParam、ProtScale、SignalP 4.1 server、Signal-3L、TMpred、DAS、NetPhos 2.0 Server)分析rPGRP蛋白的理化性质、信号肽、跨膜域及磷酸化位点等生物学信息. 结果 成功构建重组质粒pEASY-T1/pgrp及表达载体pET-32a(+)/pgrp,构建的克隆质粒测序结果与GenBank中金黄色葡萄自溶素AtlA基因序列(AC:D17366)的相似性为95.7％.获得的rPGRP分子质量单位约为20×103.生物信息学方法分析rPGRP片段由155个氨基酸组成,分子质量单位(Mr)为17.440 95×103,理论pI为5.45,是一种稳定的亲水性蛋白,该蛋白无信号肽且为非跨膜蛋白,属于胞外蛋白. 结论 成功构建金黄色葡萄球菌自溶素酰胺酶PGRP的原核表达系统.获得的约20×103肽聚糖识别蛋白片段为稳定的亲水性胞外蛋白.
-
肺炎链球菌重组蛋白LytA体外抗菌效应探讨
目的 构建肺炎链球菌(ATCC49619)自溶素lytA基因的原核表达载体,并在大肠埃希菌表达系统中表达,获取LytA重组蛋白(rLytA),初步探讨其体外抗菌效应. 方法 根据GenBank中的肺炎链球菌M66菌株lytA基因序列(FN549899.1)设计合成特异性引物,采用PCR技术从肺炎链球菌ATCC49619标准株基因组中扩增lytA基因序列,分别构建克隆载体PGM-T/lytA和表达载体pET32a(+)/lytA,将pET32a(+)/lytA转化至感受态细胞E coli BL21(DE3),经IPTG诱导后用透析袋等电点洗脱技术纯化目的蛋白rLytA;采用微量肉汤稀释法测定rLytA和青霉素G对肺炎链球菌及其青霉素G耐药株的低抑菌浓度(MIC),动态测定肺炎链球菌及其耐药株对rLytA和青霉素G的药物敏感性,评价rLytA的体外抗菌活性. 结果 成功构建了原核表达载体pET32a(+)/lytA,获得的rLytA对肺炎链球菌标准株和青霉素G耐药株的MIC分别为8μg/ml和16 μg/ml;以rLytA对标准株及耐药株MIC的3倍浓度,分别作用于标准株及耐药株,与未加药物的对照组相比,rLytA作用于标准株3h后细菌数显著减少(P＜0.05),且效果持续至7 h(P＜0.05);对青霉素G耐药株作用3h时显示具有抑菌效果(P＜0.01),且抑菌作用持续至7 h(P＜0.01). 结论 一定浓度的rLytA对肺炎链球菌标准株和耐药株均显示出抑菌作用,且持续时间长,具有作为抗菌药物的可能性.
-
肺炎链球菌自溶素LytA研究进展
自溶素是一种内源性酶,广泛存在于细菌表面,参与细菌分裂、细胞黏附、细菌自溶以及细胞壁的更新等重要生理活动.本文对肺炎链球菌自溶素LytA结构、功能、调控及应用研究现状进行了综述.
-
金黄色葡萄球菌重组蛋白AtlM的体外抗菌效应初步探讨
目的通过基因工程技术获取金黄色葡萄球菌（ ATCC25923）自溶素片段AtlM重组蛋白（ rAtlM），初步探讨其体外抗菌效应。方法根据GenBank 中金黄色葡萄球菌atlM基因序列（ AC：D17366）设计合成特异引物，采用PCR技术扩增相应的序列并构建重组表达质粒pET-32а（＋）/atlM，经由IPTG诱导后通过等电点洗脱技术获取纯化的rAtlM；采用微量肉汤稀释法测定rAtlM对ATCC25923及其苯唑西林诱导耐药株的低抑菌浓度（ minimal inhibitory concentration ，MIC）；体外试验测定rAtlM对ATCC25923菌株及其耐药株的抗菌活性。结果成功构建了原核表达载体pET-32а（＋）/atlM，表达的重组蛋白AtlM对ATCC25923标准株和耐药株的MIC分别为8μg/ml和64μg/ml。体外抑菌试验显示rAtlM作用于ATCC25923标准株和耐药株1 h后即对细菌生长具有抑制作用（ P值分别为0．004和0．026），对标准株作用持续到5 h测定点（P＝0．012），对苯唑西林耐药株作用持续到3 h测定点（P＝0．001），5 h后与未加药物的对照组相比差异无统计学意义（P＝0．102）。结论50μg/ml的rAtlM对金黄色葡萄球菌（ ATCC25923）及苯唑西林耐药株初步显示出一定的抑菌作用，具有作为抗菌药物的可能性。
-
单核细胞增生李斯特菌自溶素的功能与调控
单核细胞增生李斯特菌（ Listeria monocytogenes）是一种在环境中普遍存在的革兰氏阳性菌，无芽孢结构、兼性厌氧，能引起人和动物严重的食源性感染。食用被该菌污染的食物后，病原菌可经胃到达小肠，若突破肠屏障，可引起发热性肠胃炎，患者或携带者的排泄物经土壤又可能再次污染食物。若病原菌转移至肝脏，可引发隐形肝炎。对免疫功能低下或不全的个体，还可能导致败血症、脑膜炎及孕妇流产等病症，其致死率高达30％～40％［1］。
自溶素（ autolysin ）是一类能够降解细菌自身细胞壁的肽聚糖水解酶，在细菌中普遍存在［2］。自溶素与细菌的多种生物学功能有关，如降解细胞壁、促使细胞分离及调节细胞壁更新。在感染宿主时自溶素可以协助细菌黏附并入侵宿主细胞，影响细菌在胞内及胞间的扩散力并诱导免疫细胞产生细胞因子。自溶素的生物学功能还体现在生物膜、鞭毛及孢子形成、遗传转化能力、蛋白分泌及自我溶解等方面，与细菌的致病力密切相关［1，3］。本文就自溶素的结构、基因功能和调控机制进行综述，旨在为自溶素功能研究提供参考。 -
肺炎链球菌菌体蛋白LytA和CbpA对感染小鼠的诊断价值
目的 通过基因工程技术获取肺炎链球菌自溶素(autolysin,LytA)和胆碱结合蛋白A(choline binding protein A,CbpA),探讨其对肺炎链球菌感染小鼠的血清学诊断价值.方法 根据GenBank中lytA和cbpA基因保守序列设计合成特异性引物,采用PCR技术从肺炎链球菌基因组中扩增lytA和cbpA保守序列片段;经由IPTG诱导并通过等电点洗脱方法获取纯化的重组蛋白LytA和CbpA;Western blot测定表达蛋白的抗体结合活性.以LytA和CbpA为抗原,建市ELISA反应模式测定感染小鼠血清中相应的IgG和IgM抗体,评价诊断价值.结果 成功构建了原核表达载体pET-32a(+)/lytA和pET-32a(+)/cbpA,表达的重组蛋白LytA和CbpA具有较好的抗体结合活性.实验组小鼠(肺炎链球菌感染组)IgM和IgG类抗LytA抗体滴度高于对照组(止常对照组和乙型链球菌感染对照组),差异有统计学意义(P<0.05),CbpA抗体与正常对照组差异有统计学意义,与乙型链球菌感染组差异无统计学意义(P>0.05).CbpA蛋白对感染小鼠诊断的敏感性较高(IgG:83.3%;lgM:75.0%),而LytA特异性较高(IgG:100%;IgM:100%).结论 协同利用重组蛋白CbpA诊断敏感性及LytA的特异性,对肺炎链球菌感染小鼠的血清学诊断具有一定价值,为进一步用于临床检验奠定基础.
-
肺炎链球菌自溶素基因的克隆表达及免疫印迹检测
肺炎链球菌(streptococcus pneumoniae)可引起肺炎、脑膜炎、中耳炎、鼻窦炎及菌血症等多种严重疾病.肺炎链球菌引起的疾病在2岁以下儿童和65岁以上老年人中发病率高.肺炎链球菌的主要致病因子除荚膜外,自溶素(autolysins)也是其中一种重要的致病因子.
-
金黄色葡萄球菌重组蛋白AtlG体外抗菌效应探讨
目的 通过基因原核表达技术获取金黄色葡萄球菌(ATCC25923)自溶素片段AtlG重组蛋白,初步探讨其体外抗菌效应.方法 根据GenBank中的atlG基因序列设计合成特异引物,采用PCR技术以金黄色葡萄球菌的基因组为模板扩增相应atlG基因序列；分别构建克隆载体PMD19-T-atlG和表达载体pET-32a(+)/atlG;构建的表达载体经由IPTG诱导后通过等电点洗脱技术获取纯化的重组蛋白AtlG；采用微量肉汤稀释法测定AtlG对金黄色葡萄球菌及其苯唑西林耐药株的低抑菌浓度(MIC),动态测定金黄色葡萄球菌及其耐药株对AtlG的药物敏感性,初步探讨重组蛋白AtlG的体外抗菌活性.结果 成功构建了原核表达载体pET-32a(+)/atlG,表达的重组蛋白AtlG对金黄色葡萄球菌标准株和苯唑西林耐药株的MIC分别为16 μg/ml和64 μg/ml;相比于未加药物的对照组,rAtlG对标准株作用1h后细菌数显著降低(P=0.045),抑菌效果持续到5h测定点(P=0.006)；对苯唑西林耐药株作用3h后显示出抑菌效果(P=0.003),5h后与对照组相比差异无统计学意义.结论 50μg/ml的rAtlG对金黄色葡萄球菌标准株抑菌作用发生快、持续时间长,对苯唑西林耐药株也有一定的抑菌作用,具有作为抗菌药物的可能性.
-
肺炎链球菌自溶素对感染性肺炎的诊断价值
目的 通过基因原核表达技术获取肺炎链球菌自溶素LytA重组蛋白(rLytA) ,探讨其对感染性肺炎患者的血清学诊断价值.方法 根据Genbank中肺炎链球菌 M66菌株 lytA基因序列(FN549899 .1)设计合成特异性引物 ;采用PCR技术以肺炎链球菌基因组DNA为模板扩增 lytA基因序列 ;构建重组表达质粒pET32a(+ )/lytA ,经由IPTG诱导后通过等电点洗脱方法获取纯化的重组蛋白LytA ;Western blot测定表达蛋白的抗体结合活性 ;以rLytA为抗原 ,建立ELISA反应模式 ,测定2013年3-6月36例临床诊断为CAP并经细菌学确定的患者血清标本中相应IgG和IgM抗体 ,评价对肺炎链球菌感染性肺炎的诊断价值.结果 成功构建原核表达质粒pET32a(+ )/lytA ,表达的rLytA具有较好的抗体结合活性;CAP患者血清IgM和IgG类抗LytA的抗体滴度均高于健康对照组 ,差异有统计学意义(P<0 .05) ,其诊断的敏感性均高于常规的痰培养和血培养(P< 0 .01).结论 以重组蛋白LytA为抗原建立ELISA反应模式可用于肺炎链球菌感染的血清学诊断 ,快速、客观 ,具有一定的应用价值.
-
细菌自溶素的研究进展
细菌自溶素参与细菌很多重要的生理活动,如细胞分裂、孢子形成等.综述了自溶素参与的细菌生理功能、调控网络,及其在病原菌检测、新型抗菌制剂开发等方面的应用.
-
肺炎链球菌lytA和ply基因PCR方法检测
肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae,S.p)在世界范围内仍然是一种重要的病原体,可引起肺炎、脑膜炎、中耳炎、鼻窦炎及菌血症等多种严重疾病[1-2].为了及时准确地检测出疑似病例是否为肺炎链球菌感染,需要有灵敏特异的检测方法.虽然从样本中分离到肺炎链球菌被公认为是金标准,但实际在肺炎链球菌性肺炎的成人病例中,能够分离到菌株的只占20%-30%,在儿童病例中＜10%.通常用于检测肺炎链球菌抗原和抗体的血清学方法 ,均缺乏一定的灵敏度和特异度[3].与培养方法 相比,PCR方法 有很多优越性,敏感性高;能够扩增很多与链球菌相关的基因序列;可以从死亡的微生物或污染的样本中检测出细菌DNA[3-4].本研究采用PCR扩增方法对自溶素基因(lytA)和溶血素基因(ply)进行检测,探讨对肺炎链球菌性感染病例检出的灵敏度和特异度.
-
脂磷壁酸相关新研究进展
脂磷壁酸(LTA)是革兰阳性细菌特征性的膜结合聚合物,是由16～40个磷酸二酯键连接的磷酸甘油残基与1个膜载体(通常为一种糖脂或糖磷酸酯)共价连接的线性聚合物.LTA的基本生理功能为调节自溶素的活性,清除二价阳离子(如镁离子),改变细胞壁的电荷性质从而影响细菌与宿主细胞间的相互作用.以往对LTA的研究已证实其除了具有抗微生物、抑制肿瘤细胞(尤其是胃肠道肿瘤)、免疫调节、抗氧化、抗衰老等积极作用外,也具有一定的消极作用,但相关的机制尚不明确,对其相关疾病的研究亦较少.近年来,国内外学者对LTA进行研究,以下对此作一综述.
-
反向斑点杂交快速检测肺炎链球菌
目的:建立一种利用DNA探针快速检测肺炎链球菌的反向斑点杂交方法.方法:在肺炎链球菌特异的自溶素基因序列内设计引物,聚合酶链反应合成1段263 bp的DNA探针,然后用生物素标记的细菌DNA与该探针行反向斑点杂交,并将该方法应用于痰样本的检测.结果:所合成的探针具有高度特异性,与其他细菌间无交叉反应,该方法能检测出10 ng细菌DNA.50份痰标本肺炎链球菌培养阳性者8份,杂交阳性者12份,PCR阳性者18份.结论:反向斑点杂交具有快速、敏感、特异的优点,对肺炎链球菌的快速诊断有重要意义.
-
金黄色葡萄球菌酚溶调控蛋白α小肽敲除对自溶素AtlA蛋白表达的影响
目的 利用同源重组技术构建金黄色葡萄球菌Newman psmα基因缺失突变株,探究psmα缺失对金黄色葡萄球菌蛋白表达的影响.方法 分别扩增psmα基因的上下游同源臂,根据同源重组原理,构建pBT2基因打靶载体,利用同源重组技术,构建psmα缺失的Newman突变株.并对野生株和突变株培养上清蛋白进行研究.结果 突变株培养上清中一个相对分子质量约为135×103的蛋白表达水平较野生株明显减少甚至缺失;质谱分析提示该蛋白为金黄色葡萄球菌atlA基因编码的双功能自溶素前体蛋白(AtlA蛋白);实时荧光定量PCR结果显示psmα基因敲除株atlA基因的转录水平较野生株显著降低.结论 psmα缺失后能够降低atlA基因的转录表达水平.
