反义脱氧寡核苷酸静脉输注抑制小鼠MD-1表达延长皮肤移植物存活时间的研究

目的静脉输注反义脱氧寡核苷酸(简称反义核酸,AS-ODN)抑制小鼠MD-1表达,并初步探讨MD-1用于排斥反应诊断的前景.方法实验组(组1和组2)和阳性对照组(组3)行C57BL/6-BALB/c同种皮肤移植,阴性对照组(组4)行BALB/c-BALB/c同基因皮肤移植后,分别静脉输注小鼠MD-1 AS-ODN(组1)、随机序列脱氧寡核苷酸(组2)或生理盐水(组3和组4).于术后第11天留样检测脾细胞MD-1表达水平(FACS)、脾细胞增殖反应强度(AlamarBlue还原率)、血清IL-2和IL-10水平(ELISA)以及皮肤移植物组织学改变(组织病理学检查),并记录移植物存活时间.结果静脉输注小鼠MD-1 AS-ODN能明显减少BALB/c小鼠脾细胞中MD-1阳性细胞百分数,降低脾细胞对特异性和非特异性刺激的增殖反应强度,下调血清IL-2水平和上调IL-10水平,减少移植物局部淋巴细胞浸润,并显著延长同种皮肤移植物存活时间.结论静脉输注MD-1 AS-ODN特异性抑制小鼠MD-1表达可显著延长皮肤移植物的存活时间.MD-1表达水平对排斥反应的发生具有一定的指示作用.

中性粒细胞弹性蛋白酶和IL-8在大鼠哮喘中的作用及地塞米松调控

目的观察中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)和IL-8在大鼠哮喘中的作用及地塞米松(DM)对其功能的影响.方法采用大鼠哮喘模型,随机分成哮喘组(A组)、正常对照组(B组)、地塞米松治疗组(C组),对周围血内中性粒细胞(PMN)进行分离纯化,ELJSA法检测血PMN和支气管肺泡灌洗液(BALF)中NE和IL-8的表达水平.结果A组血PMN和BALF中NE、IL-8表达水平均显著高于B组(P＜0.01),C组均显著低于A组(P＜0.01).C组血PMN中NE的表达水平显著高于B组(p＜0.05),而BALF中则无显著性差异(P＞0.05).C组血PMN和BALF中IL-8的表达水平与B组相比差异均无统计学意义(P＞0.05).BALF和肺组织中PMN计数A组显著高于B组(P＜0.01),肺组织中PMN计数C组显著高于A组(P＜0.01),而两组BALF中PMN占细胞总数的百分比差异无统计学意义(P＞0.05).BALF中PMN计数和IL-8呈显著正相关(P＜0.05).结论PMN、NE和IL-8参与了哮喘的炎症过程,PMN可能通过合成IL-8、NE起作用,其合成功能可以被地塞米松所抑制.IL-8与PMN在BALF中浸润密切相关.

变异链球菌临床株乳酸脱氢酶mRNA水平的表达研究

目的分析来自不同龋敏感人群变异链球菌不同基因型乳酸脱氢酶(LDH)的基因表达差异,探讨mRNA水平上基因表达与蛋白生物学功能及细菌致龋性的关系.方法应用半定量RT-PCR两步法和凝胶成像系统定量软件分析,分别对20株来自不同基因型的LDH进行基因表达水平差异的评价和比较.结果两种不同基因型LDH的mRNA表达水平不同(P＜0.05),表现为低酶活性的B基因型ldh表达高;高龋和无龋菌株ldh表达的差异无统计学意义(P＞0.05).结论变异链球菌乳酸脱氢酶基因表达水平具有遗传异质性,产酸因子ldh基因表达高低与龋病活跃性不呈正相关关系.

大鼠铜绿假单胞菌慢性肺部感染生物被膜的致病作用研究

目的建立慢性铜绿假单胞菌(P.aeruginosa,Pa)生物被膜(biofilm,BF)肺部感染的大鼠模型,探讨Pa生物被膜的致病作用特点.方法体外测定左旋氧氟沙星(levofloxacin,LFX)及头孢他啶(ceftazidime,CAZ)对藻酸盐包裹的PAO579及浮游PAO579的低抑菌浓度(MIC)、低杀菌浓度(MBC).从大鼠切开的气管内注入0.1ml 109CFU/ml藻酸盐包裹的PAO579或浮游PAO579,术后第3、7、14天观察大鼠肺部的细菌学、病理学特点及TNF-α反应.结果体外LFX、CAZ对藻酸盐包裹的PAO579的MIC、MBC均高于浮游PAO579.体内藻酸盐珠组的细菌形成单位(CFU)显著高于浮游菌组(P=0.002,P=0.004,P=0.002);肺大体病理及炎症反应程度均较浮游菌组严重;肺TNF-α水平均高于浮游菌组(P=0.002,P=0.002,P=0.022).相关分析表明,TNF-α水平与大体病理有明显相关性.结论Pa生物被膜有保护细菌抵御抗菌药物杀伤的作用,同时有介导肺免疫损伤及保护细菌逃避宿主免疫防御作用.

64株大肠埃希菌对氨基糖苷类抗生素的耐药表型与钝化酶基因型的分析

目的调查2004年北京地区临床收集的耐庆大霉素大肠埃希菌对氨基糖苷类抗生素的敏感性和氨基糖苷类钝化酶基因的流行状况.方法采用微量肉汤稀释法检测64株大肠埃希菌对16种氨基糖苷类抗生素的低抑菌浓度(MIC)值;利用巢式PCR方法对其可能含有的7种氨基糖苷类钝化酶基因进行检测和确证.结果临床大肠埃希菌的耐药表型较为复杂,与钝化酶基因表达有关.测试菌株中存在aac(3)-Ⅱc、aac(6')-Ⅰ b、ant(2")-Ⅰ a和ant(3")-Ⅰ a 4种耐药基因,aac(3)-Ⅱc和aac(6')-Ⅰ b是主要的产酶基因.约40%的耐药菌中存在2种或2种以上的钝化酶基因.结论产生氨基糖苷类钝化酶是临床分离的大肠埃希菌对氨基糖苷类抗生素主要的耐药机制.采用巢式PCR方法检测耐药基因,特别是在缺少阳性对照菌株的情况下,可以保障检测结果的特异性和准确性.临床菌的耐药表型和钝化酶基因关系较为复杂,这可能与耐药菌中尚存在其他耐药基因有关.

一株产SHV-5α型超广谱β-内酰胺酶的阴沟肠杆菌检测

质粒介导的超广谱β-内酰胺酶(ESBL)的产生引起了肠杆菌科细菌的耐药,ESBL能够水解氧亚氨基β-内酰胺类抗生素和氨曲南,并可被β-内酰胺酶抑制剂所抑制.截止2005年4月11日,在全球范围内至少已发现200多种ESBL.大多数ESBL来源于广谱酶TEM-1、TEM-2和SHV-1,系这些酶活性部位1个或多个位点的氨基酸突变所致,使酶活性部位的空间结构发生改变而扩大了水解底物范围,从而增加了对氧亚氨基类抗生素的亲和力和水解能力.自Prinarakis于1996年首次报道了SHV-5α以来,这一β-内酰胺酶的相继报道不多.我们在研究蚌埠三院临床分离的产ESBL菌株时,从一株阴沟肠杆菌中检测到SHV-5α,现将结果报道如下.

SARS冠状病毒S1基因片段真核表达载体的构建及其活性测定

严重急性呼吸综合征(severe acute respiratory syndrome,SARS)病原体是SARS冠状病毒(SARSCoV),研究开发安全有效的SARS-CoV疫苗以控制SARS成为热点.经过对12株SARS冠状病毒基因序列比较,发现S蛋白的氨基酸突变率仅为0.23%,其较高的保守性为疫苗研究奠定了良好的基础,由此,S蛋白成为候选疫苗的重要靶位[1].pcDNA3.1(+)是一种高效率的质粒型真核表达载体.本研究将SARS-CoV的S1基因片段连至真核表达载体pcDNA3.1(+),构建重组pcDNA3.1(+)/S1并初步研究其免疫效果.

针对S基因的siRNA抑制HepG2 2.2.15细胞中HBV基因的表达

目的构建针对乙型肝炎病毒(HBV)S基因的siRNA(short interfering RNA)表达载体pSUPER-S1和pSUPER-S2,观察其对HepG2 2.2.15细胞中的HBV基因表达的影响.方法设计并合成针对HBV S区基因的siRNA寡核苷酸,经退火形成双链后克隆入pSUPER载体,构建成功的siRNA表达载体与pTK-Hyg质粒共转染稳定表达HBV的HepG2 2.2.15细胞,经200μg/ml潮霉素抗性筛选,4周后获得稳定细胞克隆,对所得细胞培养上清中的HBsAg和HBeAg进行定量检测,免疫荧光染色检测细胞内抗原的表达,同时用RT-PCR检测靶基因mRNA的抑制效果.结果成功构建了针对HBV S基因的siRNA表达载体pSUPER-S1和pSUPER-S2,两种siRNA均能明显抑制HepG2 2.2.15细胞的HBsAg和HBeAg分泌,抑制率分别为83%和78%,免疫荧光染色显示siRNA能抑制细胞内抗原的合成,RT-PCR结果证实HBV的mRNA表达降低,而无关序列的siRNA和对照则无此作用.结论载体产生的针对HBV S基因的siRNA能稳定、高效、特异地抑制HBV基因的表达.

人巨细胞病毒感染对体外培养成纤维细胞E2F1表达的时序性影响

目的研究人巨细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)感染对体外培养成纤维细胞E2F1表达的时序性影响,进一步揭示HCMV的致病机制.方法用高和低感染复数(multiplicity of infection,MOI)HCMV病毒感染体外培养的成纤维细胞,在不同时间点用Western blot法检测细胞E2F1蛋白表达水平.结果低MOI和高MOI感染都可时序性上调宿主细胞E2F1蛋白表达,均以感染后2h上调幅度高(2～3倍).高MOI感染的上调作用强于低MOI感染.结论HCMV在感染初期即可激发宿主细胞E2F1表达明显增加,并在24h内呈时序性上调,提示E2F1在病毒感染早期诱导宿主细胞向S期和G2/M期偏移,进而在营造有利于病毒复制微环境的机制中起关键作用.

SARS-CoV、HCoV-229E和OC43核衣壳蛋白的克隆表达及抗原相关性分析

目的克隆表达SARS冠状病毒(SARS-CoV)和人冠状病毒(HCoV-229E、HCoV-OC43)核衣壳(N)蛋白,并对其重组蛋白的抗原相关性进行探讨.方法RT-PCR扩增SARS-CoV、HCoV-229E和HCoV-OC43的N基因全长序列,克隆到原核表达载体pQE30,IPTG诱导表达重组蛋白,用Western blot和免疫荧光鉴定.结果获得SARS-CoV、HCoV-229E和HCoV-OC43 His-N融合蛋白的相对分子质量(Mr)分别约为47×103、44×103、50×103,与相应预测值相符,Western blot和免疫荧光证实,3种融合蛋白仅与相应的免疫血清特异性结合,3种蛋白的抗原性相互间无交叉反应.结论获得具有免疫原性的SARS-CoV、HCoV-229E和HCoV-OC43的核衣壳融合蛋白,其3种N蛋白抗原性在免疫动物血清中不存在交叉反应.

运用变性高效液相色谱对肺炎克雷伯菌产ESBL进行基因分型

目的通过运用变性高效液相色谱(DHPLC)技术对前期研究已确认产超广谱β-内酰胺酶(ESBL)的肺炎克雷伯菌临床分离株TEM型质粒进行基因分型,试图建立一种方便快捷的用于ESBL分子诊断及其流行病学监测的新方法.方法利用PCR技术从肺炎克雷伯菌临床分离株中扩增出TEM型质粒的编码序列,扩增产物运用DHPLC技术进行分析,分析提示,异常的样本通过测序确定其基因突变的类型,后通过比对确定其基因型.结果共分析了101例肺炎克雷伯菌临床分离株,全部样本均扩增出TEM型质粒的编码序列,经过DHPLC分析,52例(51.4%)样本表现为单一的洗脱峰,其形态与TEM-1标准菌株的峰型相一致,测序确定它们的碱基序列亦相一致,不存在变异,为TEM-1型;49例(48.6%)样本表现为异常的洗脱峰,它们均为双峰,形态一致,但异源双链峰的高度有差异,测序结果表明它们均存在四种相同的基因突变,在NCBI网站比对后确定为TEM-116;测序结果还提示,部分样本中TEM-1和TEM-116混合存在,其比例的不同表现为DHPLC时异源双链峰高度的差异;文献检索表明,本次确定的TEM-116为一新的基因亚型,为国内首次报道.结论DHPLC具有简便快捷、高通量和自动化的特点,重复性好,不仅可对已知突变作出即时诊断,还可发现新的基因亚型,不失为一种较好的ESBL分子诊断方法及其流行病学监测手段.

差异显示技术对变异链球菌生物膜基因表达差异的分析

目的对生物膜和浮游状态下的变异链球菌细胞进行比较研究,采用限制性酶切差异显示技术比较分析两者的基因表达谱.方法分别收集变异链球菌浮游菌细胞与贴壁的生物膜细胞,分离纯化总RNA,对于逆转录获得的cDNA进行限制性酶切差异显示PCR技术(RFDD-PCR)比较分析两者的表达谱,对于获得的差异表达片段通过克隆测序并于BLAST比对获得这些片段的基因信息,进而推断其功能.结果通过对差异片段的分析,确证其中4条片段分属结构基.fruA、SMU.438c、SMU.751与adhB/C.结论限制性酶切差异显示技术可用于分析生物膜形成过程中基因表达的差异.

重组人白细胞介素10在毕赤酵母中的表达及生物学活性测定

目的在毕赤酵母中分泌表达具有生物学活性的重组人白细胞介素10(rhIL-10),用于IL-10的生理功能研究和动物试验.方法通过PCR扩增IL-10基因,插入到重组质粒α/pUC18的α因子信号序列的XhoⅠ和EcoRⅠ酶切位点处,再将融合基因αIL-10重组到表达质粒pPIC9K的BamHⅠ和EcoRⅠ之间,SalⅠ酶切线性化重组质粒IL-10/pPIC9K,电穿孔转化毕赤酵母,营养缺陷型培养基MD和G418筛选含高拷贝表达盒的酵母转化子,PCR鉴定是否含有目的基因IL-10,甲醇诱导rhIL-10的表达,SDS-PAGE和Western blot鉴定目的蛋白,用ELISA定量测定及MC/9细胞分析IL-10生物学活性.结果成功构建了重组表达质粒IL-10/pPIC9K,获得了4个含IL-10基因的高拷贝毕赤酵母转化子,甲醇诱导后,在摇瓶水平的IL-10表达量为(0.627±0.09)mg/L,比活性为1.5×105U/mg.结论毕赤酵母分泌表达的IL-10具有良好的生物学活性.

青蒿花粉变应原Art a1基因的克隆、表达及特性鉴定

目的克隆、表达和鉴定青蒿花粉变应原Art al.方法在成功构建青蒿花粉cDNA文库的基础上,用蒿属花粉过敏患者的阳性混合血清进行免疫学筛选,所获阳性克隆亚克隆入pET24a(+),经IPTG诱导表达后,通过Ni2+亲和层析柱对重组变应原进行纯化,并采用Western blot和ELISA检测其IgE结合活性.结果选用阳性血清从青蒿花粉cDNA文库中筛选到1个阳性克隆,经序列测定,该基因与GenBank中已知基因无明显同源性,含有长度为609 bp的开放阅读框,编码203个氨基酸,命名为Art al;该重组变应原在大肠杆菌中高效表达为相对分子质量(Mr)为22.7×103蛋白,进一步在Ni2+亲和层析柱得到高度纯化;免疫学分析表明重组变应原有良好的IgE结合活性.结论本研究克隆和鉴定了一个青蒿花粉主要变应原Art al(登录号为:CK700713),为花粉过敏性疾病的诊断和免疫治疗及进一步的实验研究奠定基础.

PKC信号传导对ITP患儿T淋巴细胞增殖与凋亡的调控研究

经确诊的35例特发性血小板减少性紫癜(ITP)患儿为观测对象,男15例,女20例,年龄1岁～14岁,中位年龄5.3岁.正常对照30例为健康儿童,排除ITP及其它自身免疫性疾病,其中男13例,女17例,年龄1.5岁～12岁,中位年龄4.5岁.收集ITP患儿及健康儿童外周抗凝静脉血,分离纯化T细胞.以20%小牛血清RPMI 1640培养液调整T细胞浓度至106/ml,接种于24孔培养板中,每份标本接种6孔,编为3组,每组2孔.第1组为空白对照组、第2组加入蛋白激酶C(PKC)激动剂PMA、第3组同时加入激动剂PMA和抑制剂H-7,于37℃,5%Co2培养24、72h,采用CCK-8法检测T细胞的增殖能力,运用AnnexinFITC及PI荧光染液作双色流式细胞术检测T细胞的凋亡率.计算各组均数与标准差,用x±s表示,全部数据均经SAS8.22统计软件分析,组间差异的显著性用方差分析的q检验,P＜0.05为差异有统计学意义.

HSP70BCG修饰的DC抗肿瘤作用的机制研究

近年来发现Toll样受体(TLR)是结合病原微生物的受体,参与固有免疫及适应性免疫,在DC上有所表达.结核杆菌中有多种抗原物质可激活细胞免疫功能,并对多种肿瘤细胞株有细胞毒作用.在上述研究的基础上,本文应用卡介苗来源的热休克蛋白70(HSP70BCG)修饰小鼠骨髓DC及经抗-TLR4抗体封闭TLR4后的小鼠骨髓DC,观察其抑瘤效果及TLR4的作用.

CD80/IgG融合基因重组表达载体的构建及在CHO细胞中功能性表达的研究

目的构建CD80/IgG真核表达载体,使其在中国地仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovurm,CHO)中功能性表达,寻找消除白血病细胞免疫逃逸的有效方法.方法采用定向分子克隆技术将小鼠CD80胞外段和IgG1 Fc段的cDNA串联至真核表达载体pcDNA3.0中,运用脂质体将所得的重组子转染CHO细胞,经免疫印迹、斑点ELISA检测其表达,免疫亲和层析法纯化其表达产物,用流式细胞术、MTT比色法及ELISA在体外检测该产物的生物学活性.结果两段目的基因按预期设想克隆入空载体中并得到了表达,亲和层析纯化获得了高纯度目的蛋白,该蛋白能够将白血病细胞表面CD80分子密度提高5倍,并可显著增强同种异体小鼠淋巴细胞的增殖、对白血病细胞的杀伤以及Ⅱ-2的分泌.结论成功构建了融合基因真核表达载体,其表达产物在体外具有相应的生物学功能,有希望成为消除白血病细胞免疫逃逸的有力工具.

射频热疗荷H22肝癌小鼠后脾淋巴细胞增殖及细胞毒性的动态变化

已有的少量研究表明,射频治疗原发性肝癌后患者外周血CD4+T淋巴细胞数目增加,CD8+T淋巴细胞数目减少,CD4+/CD8+比值升高.这些研究没有以手术组为对照,不能证明免疫变化为射频治疗所特有;同一表型T细胞可能具有不同功能,仅测定CD4+和CD8+T细胞表型,不能充分说明体内T细胞的功能状态,没有从淋巴细胞功能角度来动态研究射频治疗对机体细胞免疫功能的影响.淋巴细胞增殖及其细胞毒性检测是评价淋巴细胞功能的重要指标,本研究通过该两项指标的测定评价射频治疗荷H22肝癌小鼠后脾淋巴细胞免疫功能的动态变化,观察射频治疗对机体免疫功能的影响.

人防御素-α克隆表达纯化及生物活性初步检测

防御素(Defensin)是一类阳离子大环形多肽,在人体多种器官和组织广泛存在,起着重要的屏障防御作用,对G+/-菌、真菌及病毒都有杀灭作用.临床观察表明,测定血浆及各种体液中防御素的改变有助于某些炎症性疾患的诊断,如脓毒症、细菌感染及早产等.此外,提纯或重组防御素作为"超级抗生素"来取代传统的抗生素已成为药学界的研究热点.本研究拟在大肠杆菌中表达人防御素-α,建立稳定表达的工程菌和纯化、复性技术途径,获得活性蛋白,为进一步研究提供材料.

耻垢分枝杆菌作为免疫调节剂的研究

目的探讨耻垢分枝杆菌制剂对不同免疫状态动物的免疫调节作用.方法注射环磷酰胺建立免疫功能低下的动物模型,以结核分枝杆菌感染(早期)或猪血清致敏建立免疫功能亢进的动物模型,然后将耻垢分枝杆菌制剂分别注射于正常、免疫功能低下和免疫功能亢进的动物,研究耻垢分枝杆菌制剂对不同模型动物T淋巴细胞增殖反应、迟发型超敏反应或速发型超敏反应的影响.结果耻垢分枝杆菌制剂可增强正常动物的T淋巴细胞增殖反应和迟发型超敏反应,促进免疫功能低下小鼠T淋巴细胞增殖功能的恢复,抑制免疫功能亢进豚鼠的迟发型超敏反应和猪血清致敏小鼠的速发型超敏反应.结论耻垢分枝杆菌制剂具有双向免疫调节作用.

去唾液酸糖蛋白受体H1亚单位的表达、纯化及其单链抗体的筛选与鉴定

目的去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)H1亚单位的重组、表达、纯化及其单链抗体的筛选与鉴定.方法将ASGPR H1亚单位糖识别区基因(CRDH1)定向克隆至原核表达载体pET-32c经IPTG诱导表达,表达产物用Ni2+螯合柱亲和纯化,免疫印迹技术(WB)检测;用纯化的CRDH1对人源噬菌体抗体库进行4轮固相筛选,阳性克隆用表达标记(Trx-His-s tag)进行差异筛选.取阳性噬菌体C3感染宿主菌HB2151,37℃振荡培养过夜,终浓度为1 mmol/L的IPTG诱导表达,12%SDS-PAGE与Western blot鉴定以及免疫组化鉴定纯化的单链抗体C3与肝细胞结合的特性.结果CRDH1/pET-32c在原核系统经诱导表达出相对分子质量(Mr)约35×103大小的融合蛋白,以包涵体的形式存在;通过Ni2+亲和柱纯化获得CRDH1融合蛋白;经4轮筛选和差异筛选后,有2株可分泌性表达与CRDH1特异性结合的单链抗体,DNA序列分析表明单链抗体重链基因和轻链基因分别属于人免疫球蛋白VH3家族和VKI家族.噬菌体C3经诱导表达出Mr约28×103大小的融合蛋白,可溶性分泌表达于培养基中;通过Ni2+亲和柱纯化获得单链抗体,ELISA、Western blot表明单链抗体C3能较好结合rCRDH1,免疫组化显示该单链抗体可与肝癌细胞、肝细胞特异结合.结论成功表达ASGPR并筛选出其人源单链抗体.该单链抗体可与表达的rCRDH1以及肝细胞和肝癌细胞特异性结合,提示对肝脏疾病的靶向治疗有潜在的应用价值.

第八届全国生物制品学术研讨会通知(第二轮)

免疫组学:21世纪免疫学家的新挑战

编者按随着人类基因组计划的完成,诞生了新的免疫学前沿分支学科--免疫组学(Immunomics),为免疫学的快速发展发挥了重要作用.免疫组学重点研究免疫相关的全套分子、它们的作用靶分子及其功能.免疫组学包括了免疫基因组学(Immunogenomics)、免疫蛋白质组学(Immunoproteomics)和免疫信息学(Immunoinformatics)三方面的研究,特别强调在基因组学和蛋白质组学研究的基础上,充分利用生物信息学、生物芯片、系统生物学、结构生物学、高通量筛选等技术,大规模开展免疫系统和免疫应答分子机理研究,发现新免疫相关分子的功能,为全面系统了解免疫系统和免疫应答提供基础.作者对上述方面作了有重点的论述,我们刊登此文,希望我国免疫学工作者重视免疫组学研究,抓住机遇,发挥各自的优势,开展具有我国特色的各项研究,为免疫组学的研究与开发做出贡献.