Imiquimod 以 TLR7非依赖途径诱导THP-1来源的巨噬细胞凋亡

目的：探讨TLR7在imiquimod引起的THP-1来源的巨噬细胞凋亡中的作用。方法选择TLR7表达强度不同的细胞系（ THP-1巨噬细胞、MDCK细胞和HUVEC细胞），通过MTT法分别检测经不同浓度imiquimod处理后细胞的存活率。酶联免疫吸附试验检测通过TLR7抑制剂氯喹、TLR7-siRNA处理减少TLR7表达后，细胞上清液中IL-6的水平。流式细胞术进一步检测抑制TLR7表达后，imiquimod对THP-1巨噬细胞凋亡的影响。结果 Imiquimod能引起THP-1巨噬细胞、MDCK细胞和HUVEC细胞这3种细胞的凋亡。氯喹和TLR7-siRNA处理减少TLR7表达后，能显著降低IL-6的水平，但不影响imiquimod引起的THP-1巨噬细胞凋亡。结论 Imiquimod可通过TLR7非依赖方式引起细胞凋亡。

人胶质瘤细胞系 SU3与小鼠巨噬细胞共培养产生的融合细胞具有恶性转化的特点

目的：通过胶质瘤细胞（SU3）与巨噬细胞（macrophage，Mφ）共培养来证明胶质瘤间质中的Mφ恶性转化是SU3与Mφ融合导致的。方法将转有红色荧光蛋白基因（ RFP）的SU3与表达增强型绿色荧光蛋白（ EGFP ）的小鼠腹腔冲洗出的Mφ进行体外共培养；用单克隆方法建立表达RFP＋/GFP＋双色荧光（黄色）的细胞系，然后进行癌细胞相关表型分析、致瘤性试验、鼠巨噬细胞标记物检测。结果（1）这两种细胞共培养后，细胞群中出现为数不多的黄色细胞，并成功单克隆到C3、C4和C12三株细胞。（2） C12继续传代培养后分化出RFP＋、EGFP＋和RFP＋/EGFP＋三种类型细胞，但随着传代次数增多，EGFP＋（绿色）细胞比例逐渐升高而成为主体，RFP＋/EGFP＋（黄色）细胞比例逐渐下降并维持在较低水平，而RFP＋（红色）细胞基本消失。（3） C12细胞株中的EGFP＋细胞具有以下特点：生长接触抑制消失、增殖速度快、染色体异倍体等癌细胞特征；在裸小鼠体内具有高致瘤率（5/5）；表达巨噬细胞特异性标记CD68，大部分染色体为鼠端着丝粒。结论本实验用体外模型证明我们先前在实体瘤中观察到的人脑胶质瘤细胞诱导宿主巨噬细胞恶性转化是通过细胞融合途径实现的。本实验与我们先前从荷瘤鼠实体瘤组织中克隆到恶性转化的巨噬细胞株（ ihCTC）的体内实验一起，相互印证了肿瘤微环境中宿主巨噬细胞恶性转化是客观存在的。宿主细胞与肿瘤细胞融合后发生的恶变既为肿瘤恶性进展和肿瘤异质性增添了新的内涵；又为肿瘤靶向治疗增加了新的靶标。

Galectin-9基因转导干预呼吸道合胞病毒感染小鼠外周血 Th17细胞的研究

目的：观察重组9型腺相关病毒（rAAV9）携带Galectin-9基因转染小鼠外周血单个核细胞（PBMCs）的可行性，探讨Galectin-9对呼吸道合胞病毒（RSV）感染后辅助性T细胞（Th17）分化的影响。方法建立RSV感染小鼠模型，HE及PAS染色观察RSV感染小鼠肺炎症反应。分离小鼠PBMCs，利用携带Galectin-9基因的 rAAV9载体转染 PBMCs，荧光显微镜观察转染效率；real-time PCR 检测RORγt mRNA的表达；流式细胞分析技术（ FACS）检测Th17和Treg的比例；ELISA检测细胞培养上清液中IL-10、IL-17及TGF-β1蛋白水平。结果与正常对照组相比，RSV感染组RORγt mRNA、Th17及IL-17的表达均明显升高（ P 均＜0．05）， Treg 及 IL-10的表达均明显降低（ P 均＜0．05）；使用 rAAV9-Galectin-9干预PBMCs后，RSV＋Galectin-9组中RORγt mRNA、Th17及IL-17的表达较RSV 组均显著下降（P均＜0．05），Treg及IL-10的表达均显著升高（P均＜0．05）。结论 rAAV9-Galectin-9成功转染PBMCs，可以通过调控Galectin-9通路影响RSV感染Th17免疫应答。

人白细胞抗原 B（HLA-B）携带 Bw4对急性HIV-1感染者 Gag-特异性T 细胞应答的影响

目的：研究人白细胞抗原HLA-B携带Bw4是否对急性HIV-1感染者Gag-特异的T细胞应答产生影响。方法用HIV-1 CRF01_A/E Gag多肽刺激36例HIV-1感染者在急性感染6个月时的外周血单个核细胞（ PBMCs），并用ELISPOT技术检测HIV-1特异性T细胞应答。用序列特异性引物-聚合酶链反应（ SSP-PCR）技术检测HIV-1感染者HLA分型及HLA-B携带Bw4、Bw6的分型。结果（1）在36例急性HIV-1感染者中，18例HLA-B不携带Bw4的感染者病毒调定点是4．49±0．56，18例HLA-B携带Bw4的感染者病毒调定点是3．78±0．75，前者的病毒调定点高于后者（ P＝0．005）。（2）HLA-B不携带Bw4的急性HIV-1感染者中15例可对P24肽库产生应答，而HLA-B携带Bw4的急性HIV-1感染者只有11例可对P24肽库产生应答，但差异无统计学意义。 HLA-B不携带Bw4的急性HIV-1感染者P24-特异的T细胞应答强度是（1317．8±1238．0） SFC/106 PBMCs，强于HLA-B携带 Bw4的急性 HIV-1感染者 P24-特异的 T 细胞应答强度[（549．9±778．5） SFC/106 PBMCs]，差异有统计学意义（P＝0．032）。然而两组感染者诱导产生的P17、P15特异性T细胞应答强度相当。 HLA-B不携带Bw4的急性HIV-1感染者对28条P24单肽的应答宽度是2（0～5）条，大于HLA-B携带Bw4的急性HIV-1感染者，其应答宽度是1（0～4）条（ P＝0．080）。（3） HLA-B不携带Bw4的急性HIV-1感染者病毒载量与P24特异的T细胞应答强度呈负相关（rs＝-0．482，P＝0．043），且与P24单肽的应答宽度呈负相关（rs＝-0．496，P＝0．036）。然而HLA-B携带Bw4的急性HIV-1感染者P24特异的T细胞应答强度与病毒载量、CD4细胞计数均无关，而且P24单肽的应答宽度与病毒载量无关。结论与HLA-B不携带Bw4的急性HIV-1感染者比较，尽管HLA-B携带Bw4的急性HIV-1感染者病毒调定点低，但其产生的P24-特异性T细胞应答强度弱且对P24单肽的应答宽度窄。

肺结核患者外周血 CD4＋CD8＋T 细胞的检测及临床意义

目的：探讨结核病患者外周血中胸腺外CD4＋CD8＋T细胞（ CD4＋CD8＋double-positive T，DPT）的表达、抗结核功能和记忆表型。方法采用流式细胞术检测结核病患者和健康人外周血DPT细胞的表达，分析其与结核病发生发展以及转归的相关性；检测DPT细胞因子的分泌水平（ IFN-γ和TNF-α）、活化标记和记忆表型，分析DPT细胞的抗结核免疫应答能力。结果与健康对照组相比，结核病患者外周血中DPT细胞比例显著升高（P＜0．005），随着治疗时间逐渐下降，恢复至正常水平；DPT细胞表面活化受体CD25表达高于CD4＋T细胞和CD8＋T细胞（P＜0．005）；结核抗原肽刺激下细胞因子IFN-γ和TNF-α分泌能力均明显增加（ P＜0．005）；DPT细胞具有记忆T细胞表型特性。结论结核病患者外周血DPT细胞具有抗结核免疫能力，其比例变化反映抗结核治疗的疗效，监测外周血DPT细胞表达可以评估患者预后是否良好。

循环 miRNA 作为诊断结核病生物标志的研究

目的：检测血浆中microRNA（miR）-155-5p、miR-21-5p、miR-29a、miR-142-5p在健康对照组、活动性肺结核组以及潜伏结核感染组中的表达情况，探讨其作为诊断结核病生物标志的可能性。方法健康对照组60人、活动性肺结核组40人和潜伏结核感染组20人，利用反转录-荧光定量PCR检测其血浆中miR-155-5p、miR-21-5p、miR-29a、miR-142-5p的表达水平。结果与健康对照组相比，活动性肺结核组血浆中除miR-142-5p外，miR-155-5p、miR-21-5p和miR-29a都出现表达上调的现象，分别是健康对照组的10．13倍、7．34倍和2．74倍，差异有统计学意义（P＜0．05）；ROC曲线分析miR-155-5p、miR-21-5p和miR-29a，曲线下面积（AUC）分别为0．905、0．830和0．687。与健康对照组相比，潜伏结核感染组血浆中只有miR-155-5p表达上调，且是健康对照者的3．1倍，差异有统计学意义（P＜0．05），miR-21-5p、miR-29a和miR-142-5p表达无差异。与潜伏结核感染组相比，活动性肺结核组血浆中除miR-142-5p外，miR-155-5p、miR-21-5p和miR-29a均表达上调，分别是潜伏结核感染组的3．26倍、6．69倍和1．98倍，差异有统计学意义（ P＜0．05）。与活动性肺结核患者密切接触者中潜伏结核感染率为40．58％。结论 miR-155-5p、miR-21-5p和miR-29a在健康对照组和活动性肺结核组以及活动性肺结核组和潜伏结核感染组之间存在差异性表达，miR-142-5p在3组之间均无差异性表达。 miR-155-5p、miR-21-5p和miR-29a可能是潜在诊断活动性肺结核、潜伏结核感染的生物标志物。与活动性肺结核患者密切接触者中潜伏结核感染率较高。

固有淋巴细胞研究进展

人体内存在着数万亿的共生菌，免疫系统却似乎对它们视而不见，机体这种维持“免疫休战”状态的重要机制之一就与固有淋巴细胞（ innate lymphoid cells，ILCs）有关。固有淋巴细胞是一类新近定义的细胞家族，起源于共同淋巴样祖细胞（ CLP ），在形态学上类似于淋巴细胞，但不表达成熟淋巴细胞表面表达的由重排基因编码的特异性抗原受体［1］，其分化发育依赖转录因子Id2，表达IL-2受体γ链［2］，分泌一系列类似于Th细胞分泌的细胞因子：IL-5、IL-13、IL-17和／或IL-22等［3］，被认为是Th细胞的“镜像细胞”［1］。 ILCs的谱系分化、功能以及修复依赖于转录因子，不同转录因子的表达调节特有ILCs亚群的发育程序，赋予不同亚群特定的效应功能。根据表达特定的转录因子和细胞因子，ILCs分为3个亚群：（1） ILC1：表达 T-box 转录因子 T-bet 和／或Eomes，经 IL-12刺激后产生 IFN-γ。包括 cNK 细胞、NKp44＋CD103＋细胞等。（2） ILC2：在生长发育和功能作用的过程中依赖转录因子 GATA3和RORα，分泌2型细胞因子IL-5和IL-13，包括自然辅助免疫细胞（ natural helper cells， NH cells）、nuo-cytes、MPPtype2细胞或固有辅助细胞（ innate helper， ih2）。（3） ILC3：表达转录因子RORγt，分泌IL-22、IL-17A或IL-17F，也称为RORγt＋ILCs。 ILCs大量存在于黏膜组织中，在机体抗病原体固有免疫应答淋巴样组织形成组织重塑以及修复中发挥重要作用，组成抵抗入侵病原菌的第一道防线。本篇就IL-Cs的研究进展做一综述。

Ⅱ型成簇恒间隔短回文序列及相关蛋白系统（CRISPR／Cas）研究近况

1987年在大肠杆菌K12的碱性磷酸酶（ iap）基因的3′侧翼区首先发现了一类具有短回文特质的DNA重复序列［1］。2002年，这类结构被正式命名为成簇恒间隔短回文重复序列（CRISPR），CRISPR关联蛋白也同时得以命名［2］。2005年，3个研究课题组同时发现间隔序列可能源自于细菌染色体外的其他遗传物质，如噬菌体和接合质粒，并推论CRISPR／Cas系统可以抵制入侵的外源 DNA［3-5］。2007年，来源于侵染噬菌体的新的整合间隔序列得到实验验证；研究同时建立了新获得的间隔序列与细菌抵抗该噬菌体侵袭的直接关联关系，证明了CRISPR／Cas系统是抵抗噬菌体的获得性免疫系统［6］。 Marraffini和Sontheimer［7］证实CRISPR／Cas系统对于接合现象和质粒转化的干扰作用。近基于CRISPR／Cas作用机制的研究，发现了其在细菌毒力、致病性以及如何逃避宿主免疫系统等方面的相关作用［8］。

本刊启用稿件远程管理系统

为顺应当今期刊网络化、数字化的发展趋势，更好地为广大作者、读者提供高质量的服务，中华医学会杂志社开发了稿件远程管理系统。该系统根据中华医学会系列杂志稿件处理流程、编辑加工规范、审稿制度、管理规范等业务需求设计，采用先进的数据库及网络技术，具有强大的数据处理和分析能力。稿件远程管理系统将协助作者、编辑、审稿专家、编委、定稿会专家、总编等相关人员多位一体地进行稿件业务处理，解决编辑部对稿件网络化流程管理的需要，并实现各类查询功能。2009年9月，本刊正式启用稿件远程管理系统，访问中华医学会网站（ http：／／www．cma．org．cn）首页上方“业务中心”进行稿件处理操作。

《中华微生物学和免疫学杂志》书写规范

本刊使用的医学缩略语

为了精简文字，使文章读起来更简练易懂，现将本刊常用且基础医学领域中所熟知的专业名词缩略语公布如下（按英文首字母顺序排列），本刊在论文中将不再注释。

远程投稿系统作者常见问题

问题1：作者如何投稿？
　　（1）注册网站会员，邮箱获得登录名和密码；（2）申请成为杂志作者，需要给哪个杂志投稿，就申请成为哪个杂志的作者，一个作者可以同时申请成为多个杂志的投稿作者；（3）进入系统，点击左侧菜单栏【期刊管理系统】，点击之后系统会列出期刊系统作者的所有功能，点击【作者投稿】，按步骤一步步往下操作，后点击【投稿】，完成投稿操作。

2010-2012年青岛地区手足口病病原谱及柯萨奇 A10型的分子流行病学研究

目的：阐明2010-2012年青岛地区手足口病（ HFMD）病原谱及相关柯萨奇病毒A10（ CVA10）型基因特征。方法用荧光RT-PCR法对HFMD患者咽拭子标本进行总肠道病毒（ EV）、柯萨奇病毒A16（CVA16）型和肠道病毒71（EV71）型检测，然后用半巢式反转录PCR进行肠道病毒VP1基因部分序列扩增，再结合序列分析鉴定血清型；对CVA10阳性分离株进行VP1基因全长序列扩增及基因序列测定，用MEGA5．0软件进行系统发育分析及分子特征分析。结果2010-2012年间，共检测1919个手足口病门诊轻症病例和1336个住院重症病例；门诊轻症病例中，2010年和2012年以CVA16为主，各占轻症病例总阳性数的53％和73％，而2011年以EV71为主，占轻症病例总阳性数的78％；住院重症病例中，EV71为2010年和2011年主要病原，各占重症病例总阳性数的70％和86％；其他型别（非CVA16、非EV71）肠道病毒在2012年住院重症病例中成为主要病原，占重症病例总阳性数的44％；2010-2012年分别检出其他型别肠道病毒19株、16株和22株，其中CVA10检出率高；23株CVA10的VP1全长基因序列进化分析表明这23株CVA10病毒全部属于C基因型，它们VP1基因氨基酸序列同源性为97．3％～100．0％，与其他地区同期参考株相比无显著差异。结论2010-2012年间，CVA16和EV71是引起青岛地区手足口病流行的主要病原，同时伴有多种其他型别肠道病毒流行，其中C基因型CVA10分离率较高，它们相互间同源性较高，与其他地区同期参考株相似。

广东省2008-2013年柯萨奇 A6型肠道病毒的流行及其基因特征分析

目的：了解柯萨奇A6型肠道病毒（ CVA6）在广东省的流行特点及其基因特征。方法对2008-2013年收集的手足口病非肠道病毒71型（ EV71）非CVA16肠道病毒阳性标本进行CVA6荧光定量PCR检测，选取 CVA6阳性标本进行 VP1全长序列扩增与测序，运用 DNAStar6．0和MEGA5．2软件对获取序列与从 GenBank 下载的 CVA6 VP1全长序列进行遗传进化分析。结果2008-2013年广东省手足口病非 EV71非 CVA16肠道病毒阳性标本中 CVA6占61．4％（1026/1672），每年分别占10．5％（4/38）、66．7％（34/51）、36．2％（81/224）、63．0％（182/289）、62．3％（325/522）和73．0％（400/548），CVA6在2008-2013年各年份非EV71非CVA16肠道病毒中的构成比差异有统计学意义（χ2＝133．79， P＜0．01）；CVA6在系统进化树中形成4个分支，各分支核苷酸差异为15．5％～23．1％，可分为A、B、C、D等4个基因群，D基因群可分为D1～D3等3个基因亚群；2008-2013年广东省CVA6流行株的核苷酸和氨基酸同源性分别为88．7％～100．0％和95．7％～100．0％，存在D2和D3亚群的流行，其中D2亚群流行于2008-2012年，D3亚群流行于2009-2013年。结论2008-2013年广东省手足口病非EV71非CVA16肠道病毒以CVA6为主。基于VP1序列分析，CVA6可分为A、B、C、D等4个基因群，D基因群的D2和D3亚群在广东省存在流行，其中D3亚群是优势流行株。

2012-2013年深圳市呼吸道合胞病毒流行规律及分子变异分析

目的：初步了解深圳市呼吸道合胞病毒的流行规律及分子变异特点。方法荧光RT-PCR对流感样病例样本进行初筛后，通过巢式RT-PCR对病毒G蛋白基因C端的可变区进行扩增，利用MEGA等软件进行分子变异分析。结果呼吸道合胞病毒在深圳的流行较为普遍，流行高峰一般出现在春季和夏秋季；流行的病毒有A、B两个亚型， NA1和BAⅨ分别是其流行株系的基因型；病毒G蛋白C端的变异位点较为散乱，少数变异导致了病毒糖基化位点消失。一株包含24个氨基酸插入序列的新型重组毒株出现在2013年，此重组株很有可能是由国外传入我国。结论呼吸道合胞病毒在深圳存在持续而广泛的流行，而且病毒仍处在不断的进化和变异之中。

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尿道分离产blaKPC-9型碳青霉烯酶大肠埃希菌的耐药基因研究

大肠埃希菌是医院感染的重要病原菌，该菌可产生多种β-内酰胺酶，包括KPC-2、KPC-3及 KPC-9型碳青霉烯酶类，此酶可在质粒间传播。目前产blaKPC-9型大肠埃希菌株国内尚未见文献报道。我们在1株大肠埃希菌中检测到KPC-9型碳青霉烯酶，现报道如下。

柯萨奇病毒 A2型深圳株 SHZH13-01全基因组序列特征分析

目的：了解深圳地区柯萨奇病毒A2型（ CVA2） SHZH13-01株的基因特征，研究CVA2的进化及变异状况。方法应用RT-PCR法扩增SHZH13-01株全基因组，PCR产物纯化后进行序列测定和基因进化分析。结果 CVA2-SHZH13-01株的全基因组由7400个核苷酸组成，编码2191个氨基酸。病毒的5′非编码区（UTR）、P1（VP1～VP4）、P2、P3、3′非编码区和全基因组的核苷酸与近年香港分离的新型重组CVA2-HK（431306）序列同源性高，分别为98．3％、98．8％、99．0％、99．2％、98．8％，98．9％。而与其他肠道病毒相比，SHZH13-01在结构蛋白P1区与CVA2国际原型株Fleet-wood同源性高，达81．6％，而在非结构蛋白区P2、P3与EV71病毒来自同一分支，同源性达82．8％～88．7％。根据系统进化分析，深圳SHZH13-01病毒株属于CVA2-HK（431306）病毒变异株。通过与CVA2-HK（431306）衣壳区氨基酸比对，CVA2-SHZH13-01的变异位点变化情况为： aa5L→F， aa666S→G， aa671T→I。结论柯萨奇病毒A2型深圳株SHZH13-01属于香港新型重组CVA2-HK（431306株）的变异株。

中东呼吸综合征冠状病毒N蛋白的原核表达、纯化和鉴定

目的：对中东呼吸综合征冠状病毒（ middle east respiratory syndrome coronavirus， MERS-CoV）的核衣壳蛋白（ nucleocapsid，N）进行原核表达、纯化和鉴定，了解其免疫原性。方法通过人工合成N基因，构建重组质粒pET30a-MERS-CoV-N，然后转化E．coli BL21（DE3），利用 IPTG进行诱导表达，并优化确定表达条件；采用镍柱亲和层析纯化，SDS-PAGE和Western blot验证。结果原核表达成功并纯化获得与预期大小（46×103）一致的高纯度可溶性N蛋白。 Western blot表明重组蛋白可与免疫阳性兔血清及His标签抗体发生特异性反应，但与北京地区2008年收集的30份成人血清无反应。结论 MERS-CoV的N蛋白成功在原核系统中实现表达并纯化、鉴定，为MERS-CoV的免疫学诊断和免疫原性研究奠定了基础。

粘质沙雷菌碳青霉烯类耐药机制研究

目的：了解临床分离的粘质沙雷菌碳青霉烯类药物耐药机制及流行特点。方法收集温州医科大学附属第一医院2006-2012年临床分离的147株粘质沙雷菌，用Vitek2 Compact及配套革兰阴性细菌药敏卡检测其药敏情况；筛选出的11株碳青霉烯类耐药的粘质沙雷菌，用琼脂稀释法测定其对10种常见抗菌药物的MIC值；改良Hodge试验进行碳青霉烯酶表型检测；PCR检测碳青霉烯酶、AmpC酶、外排泵及外膜蛋白基因的携带情况；琼脂稀释法测定加入外排泵抑制剂CCCP前后碳青霉烯类药物MIC值的变化；SDS-PAGE分析菌株外膜蛋白有无缺失；对碳青霉烯耐药菌株进行接合转移试验，PCR扩增并测定接合子的MIC，PFGE分析菌株之间的同源性。结果11株粘质沙雷菌对青霉素类、头孢菌素类抗生素和厄他培南全部耐药，其中10株菌同时对亚胺培南和美罗培南耐药，但对氟喹诺酮类和氨基糖苷类药物有较好的敏感性；11株菌中10株携带blaKPC-2，1株携带blaIMP-1，8株菌同时携带blaEBC和blaMOX ，1株同时携带blaEBC和blaDHA ，1株菌同时携带blaEBC、blaMOX和blaDHA基因，其他基因未检出；加入CCCP后有7株菌对亚胺培南的MIC值降低4～64倍，有3株菌对厄他培南的MIC值降低8～256倍，而对美罗培南的MIC值没有变化；11株菌均未检出外膜蛋白缺失；有7株菌的blaKPC-2基因成功转移到受体菌，接合子与受体菌相比MIC值有不同程度提高；PFGE结果显示11株菌中有8株菌属于一个克隆型。结论产KPC-2碳青霉烯酶是本院粘质沙雷菌对碳青霉烯类耐药的主要原因，本研究表明KPC-2在温州地区存在克隆播散并且可以水平传播，故应引起高度重视。

《中华微生物学和免疫学杂志》征订启事