抗人P185erbB2 scFv-Fc-IL-2增强LAK样和ADCC杀伤作用及机制的实验研究

目的 将抗人P185erbB2 scFv-Fc-IL-2融合蛋白(HFI)分别作用于表达高、中、低3个水平erbB2受体的SKOV3、MCF-7、SGC-7901三株肿瘤细胞和健康人外周血单个核细胞(PBMC),探讨HFI调变肿瘤细胞表面分子,激活免疫效应细胞的机制;模拟体内肿瘤组织,将HFI-PBMC-肿瘤细胞混合培养,探讨HFI对分别表达高、中、低3个水平erbB2肿瘤细胞的淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)样和抗体依赖性细胞介导的细胞毒(ADCC)作用,为临床应用提供实验依据.方法 MTF法检测细胞增殖、杀伤活性;流式细胞术检测细胞表面分子的表达变化;应用非核素细胞毒试剂盒观察HFI介导ADCC杀伤作用.结果 HFI处理后SKOV3细胞表面杀伤相关分子细胞间黏附分子-1(ICAM-1)、Fas表达水平分别由24.85%、0.53%增高到85.36%、59.19%;SKOV3、MCF-7、SGC-7901三株肿瘤细胞erbB2表达水平分别由98.48%、42.60%、36.66%下降到94.01%、30.95%、12.36%.HFI刺激后人PBMC的增殖活性显著增强,呈时间依赖效应,CD3+ CD8+ T细胞和CD3- CD16+ CD56+NK细胞分别由24.37%、6.90%提高到38.80%、13.45%,CD25、淋巴细胞功能抗原-1(LFA-1)、FasL表达水平分别由3.99%、86.52%、5.02%提高到12.96%、99.06%、16.19%.HFI活化的人PBMC对不同erbB2表达水平肿瘤细胞的LAK样杀伤活性,在各效靶比均比对照组明显提高.HFI能够介导和增强人PBMC对表达erbB2肿瘤细胞的ADCC杀伤作用.结论 HFI上调SKOV3细胞表面杀伤相关分子ICAM-1、Fas表达,下调肿瘤细胞表面erbB2表达.HFI对人PBMC具有明显的激活增殖作用,活化的人PBMC对表达不同水平erbB2肿瘤细胞的LAK样杀伤作用均显著增强.HFI能够介导和增强人PBMC对肿瘤细胞的ADCC杀伤作用,且杀伤活性的高低与肿瘤细胞表面erbB2表达水平的高低呈平行关系.

Jagged1在树突状细胞介导淋巴细胞诱导免疫耐受中的作用

Jagged1是哺乳动物细胞膜上Notch受体的主要配体之一,在抗原提呈细胞(APC)表面表达丰富,介导树突状细胞(DC)成熟和分化.Jagged1与其受体结合后,激活Notch信号通路,能够诱导外周成熟T淋巴细胞分化成为产生高水平IL-10的1型调节性T细胞(regulatory T cell 1,Treg 1)或产生高水平TGF-β的TH3细胞,在诱导免疫耐受中发挥着重要作用.

HLA-B27等位基因的相关性研究

HLA-B27基因在随机人群中阳性率约为3%～7%,而在强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis,AS)患者中则高达96%.由于AS与HLA-B27基因具有关联性,HLA-B27抗原或基因检测已经作为临床诊断AS的常规检测项目.

含有RU486调控系统的质粒DNA介导的可诱导的IL-12基因在小鼠体内表达

目的 评价含有RU486调控系统的质粒DNA诱导目的 基因表达的能力.方法 将编码LacZ的pRS-LaeZ和编码小鼠IL-12的pRS22体外转染细胞或静脉快速注射入小鼠体内.X-gal染色检测培养细胞和组织中LacZ基因的表达.ELISA法检测培养细胞上清和血清中IL-12的表达水平.结果 加入RU486诱导后,在肝脏来源的HepG2细胞中约30%被染成蓝色;而不加RU486时,仅有不到1%的细胞蓝染.在其他非肝脏来源的细胞中,无论是否加入RU486诱导,都只有不到0.5%的细胞蓝染.转染pRS22的HepG2细胞,培养细胞上清中IL-12表达水平随RU486浓度的升高而增加.静脉注射pRS-LacZ后,用RU486诱导时,仅在肝脏组织中见到蓝染细胞.静脉注射pRS22后,血清中IL-12表达水平与质粒及RU486的剂量有关.结论 含有RU486调节系统的质粒DNA可以通过加入或取消RU486来开启或关闭IL-12基因的表达,而且可以通过改变质粒或RU486的剂量来调控IL-12基因的表达水平.

伯氏疏螺旋体活体成像动物模型穿梭载体的构建

莱姆病是由伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi,又称莱姆病螺旋体)引起的重要的动物疫源性疾病.伯氏疏螺旋体的分子遗传学研究缺乏相关载体,遗传学转化异常困难,因此对于伯氏疏螺旋体致病因子的研究进展缓慢.

炭疽毒素保护性抗原和LFn介导的增强型绿色荧光蛋白进入HeLa细胞的研究

目的 研究炭疽毒素保护性抗原(protective antigen,PA)和致死因子(lethal factor,LF)N端254个氨基酸(LFn)在辅助增强型绿包荧光蛋白(EGFP)进入细胞中的作用.方法 分别扩增炭疽毒素的基因片段和EGFP的基因全长,将两片段先后克隆至pET-21a(+),构建成重组表达质粒pET-LFn-EGFP,在大肠杆菌中诱导表达,并对融合蛋白LFn-EGFP进行纯化.利用荧光共聚焦显微镜和流式细胞术研究LFn-EGFP融合蛋白进入细胞的情况.结果 获得较高纯度的融合蛋白LFn-EGFP,纯度可达90%以上,体外实验显示该融合蛋白保留了LFn与PA结合的活性,并且能够进入到HeLa细胞中.结论 LFn-EGFP蛋白本身也会以未知的机制进入细胞,在PA辅助时,LFn-EGFP进入细胞的效率会有所增加.

hCEACAM1介导淋病奈瑟菌对COS-1细胞的黏附

目的 研究人癌胚抗原相关细胞黏附因子1(hCEACAM1)在淋病奈瑟菌黏附宿主细胞过程中的作用.方法 将hCEACAM1 cDNA置于hCD46启动子和兔β-球蛋白第2内含子之后,构建重组真核表达载体pCDPGICEA1.转染COS-1细胞,G418筛选和流式细胞术分选稳定表达hCEACAM1的基因转染细胞.细菌黏附实验检测淋病奈瑟菌对基因转染COS-1细胞的黏附.结果 在hCD46启动子和兔β-球蛋白第2内含子的作用下,hCEACAM1 cDNA在COS-1细胞获得高效表达,淋病奈瑟菌可以黏附表达hCEACAM1的COS-1细胞.结论 hCEACAM1可以介导淋病奈瑟菌对动物细胞的黏附,可能是淋病奈瑟菌特异性感染人体的一种重要受体,可用来制备淋病奈瑟菌感染的相应转基因动物模型.

天然菌斑生物被膜中变形链球菌、远缘链球菌和血链球菌的荧光原位检测

目的 检测菌斑生物被膜初期形成过程中的变形链球菌(Streptpcoccus mutans)、远缘链球菌(Streptpcoccus sobrinus)和血链球菌(Streptpcoccus sanguis).方法 从植入釉质磨片表面获得完整的菌斑生物被膜标本,应用激光共聚焦扫描显微镜和荧光原位杂交技术相结合的方法,对天然菌斑生物被膜形成初期的变形链球菌、远缘链球菌和血链球菌进行原位的、实时的动态观察,通过连续断层扫描及三维重建,观察这3种菌在天然菌斑生物被膜中的空间分布,测量3种细菌的扫描厚度.实验中的扫描厚度结果采用方差分析方法进行统计处理,SPSS11.5统计软件辅助完成,α设在0.05.结果 在激光共聚焦扫描显微镜下观察生物被膜呈三维立体结构,形态多样,生物被膜内层和外层细菌较稀疏,中间层较密集,细菌之间可见许多黑色空隙,贯穿整个生物被膜.菌斑生物被膜变形链球菌、远缘链球菌和血链球菌在菌斑生物被膜形成初期的平均扫描厚度随时间延长而增加,1 h时平均扫描厚度分别为20.43、11.50、14.76 μm,到24 h时平均厚度大,分别为70.25、75.40、79.98 μm.结论 应用荧光原位杂交技术结合激光共聚焦扫描显微镜,可以快速、灵敏地检测出菌斑生物被膜变形链球菌、远缘链球菌和血链球菌.

使用生物纳米磁珠对低浓度目标细菌的磁捕获

磁性细菌(magnetic bacteria)体内一般有10～20颗生物纳米磁珠.生物纳米磁珠中心部分的主要成分为磁性Fe3O4,外层为有机生物膜.

临床病毒性脑炎标本的博尔纳病病毒核酸检测

目的 探讨临床病毒性脑炎(viral encephalitis,VE)患者与博尔纳病病毒(Borna disease virus,BDV)感染的关系,分析BDV感染的病毒性脑炎患者临床特征.方法 用荧光定量巢式逆转录聚合酶链反应(FQ-nRT-PCR)方法检测病毒性脑炎患者及非感染性疾病施行蛛网膜下腔阻滞麻醉的手术患者脑脊液单个核细胞(cerebrospinal fluid mononuclear cell,CSFMC)中BDV p24基因片段,同时用β-肌动蛋白(β-actin)作为内参照,脑脊液(CSF)阳性标本基因测序分析并总结出临床特征.结果 32例病毒性脑炎脑脊液标本BDV p24基因片段检出率为12.5%(4/32),拷贝数＞102/μl.对其中一份CSF阳性标本测序后,与BDV标准病毒株Ⅴ和马源的BDV病毒株H1766序列比较同源性分别为95.35%和98.84%.在4个位点出现基因突变(nt1649 T→C、nt1656 G→A、nt1670 C→T、nt1676 C→T).该目的基因片段与马源的BDV病毒株亲缘关系近.阳性脑炎患者主要以精神行为异常为临床特征.结论 贵州省遵义市部分病毒性脑炎的发生与BDV感染有关,主要以精神行为异常为临床特征.

用8质粒病毒拯救系统产生冷适应减毒的重组A型人流感病毒的研究

目的 利用流感病毒8质粒病毒拯救系统,产生冷适应减毒的重组A型人流感病毒,建立以冷适应流感病毒株为拯救骨架的反向遗传学技术平台.方法 以冷适应、温度敏感、减毒的A/Ann Arbor/6/60(H2N2)流感病毒株作为拯救病毒的骨架,人工合成了该病毒株的6个内部基因片段,即PB2、PB1、PA、NP、M和NS,同时引入5个氨基酸突变作为标签.6个基因片段通过与改造后的转录载体pAD3000连接,构建6个基因的拯救载体,经测序获得序列准确的拯救质粒:pMDV-A-PB2、pMDV-A-PB1、pMDV-A-PA、pMDV-A-NP、pMDV-A-M、pMDV-A-NS.结果 6质粒与PR8的表面基因HA和NA进行"6+2"组合的病毒拯救,8个重组质粒共转染COS-1细胞,成功拯救出了具有血凝活性的冷适应减毒的重组A型人流感病毒,命名为rMDV-A.鸡胚尿囊液中重组病毒的血凝(HA)效价为1∶2 9～1∶2 10.结论 构建的A/Ann Arbor/6/60的6个内部基因的病毒骨架拯救系统,为深入研究冷适应减毒人流感病毒的基因功能和新型疫苗研发提供了试验材料.

北京地区不同基因型Noro病毒的主要衣壳蛋白在大肠杆菌中的表达

目的 对北京地区的不同基因型Noro病毒的主要衣壳蛋白(VP1)进行表达,得到Noro病毒抗原,为对Noro病毒做进一步的深入研究打下基础.方法 用PCR分别从先前研究得到的含北京Noro病毒主要衣壳蛋白VP1编码基因的重组质粒pBST-CR2987(G Ⅱ-3)及pBST-CR2932(G Ⅱ-4)中扩增得到VP1全基因,然后将目的基因亚克隆到表达载体pET-30a(+)中,得到重组质粒,转化BL21(DE3)感受态细胞,利用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白表达.通过SDS-PAGE和Western blot检测蛋白的表达和抗原性,并对表达产物进行了纯化.结果 (1)双酶切和测序证明得到了VP1的重组表达载体.CR2987 VP1基因全长1647 bp,含编码549个氨基酸的单一的开放读码框架(ORF);CR2932 VP1基因全长1623 bp,含编码541个氨基酸的单一的ORF.(2)重组表达的VP1主要以包涵体的形式存在,在诱导后4～6 h表达量高.(3)重组表达的VP1能够被豚鼠抗Noro病毒VP1的特异性免疫血清及鼠抗His标签的抗体所识别.(4)纯化后的蛋白能够为人血清所识别.结论 GⅡ-3型及GⅡ-4型Noro病毒北京地方株的VP1在原核体系中获得表达,表达的VP1可以被特异性免疫血清及人血清所识别,说明其具有抗原活性.

汉坦病毒浙江分离株ZT71株的全基因核苷酸序列测定及分析

目的 为了获得浙江省汉坦病毒基因组更为详尽的资料,研究汉坦病毒的进化状况及变异程度,为疫苗病毒株的选择使用提供科学依据.方法 设计特异性引物,RT-PCR分段扩增ZT71株全长L、M和S片段,PCR产物纯化后克隆于T载体并进行序列测定.然后进行遗传进化分析.结果 汉坦病毒ZT71株L、M及S基因分别由6530、3651和1753个核苷酸组成,分别编码2151、1133和429个氨基酸.基因比较分析表明,ZT71株与SEO型汉坦病毒比较其L片段核苷酸同源性为95.5%～99.7%,氨基酸同源性为99.0%～99.3%;M片段核苷酸同源性为84.1%～99.6%,氨基酸同源性为95.3%～99.2%;S片段核苷酸同源性为88.7%～99.5%,氨基酸同源性为96.5%～99.1%;而与其他汉坦病毒同源性则较低.结论 测定了ZT71株的全基因核苷酸序列,其L、M和S片段具有和其他汉坦病毒L、M、S片段相似的核苷酸一级结构,但与SEO型更为接近,属于SEO型病毒.

机会性真菌感染中保护性抗体的研究进展

机会性真菌感染是因机体免疫力下降引发的严重的播散性真菌感染.近30年来,随着继发性免疫功能低下(如肿瘤、烧伤、器官移植、AIDS等)人群的增多、广谱抗生素的大量使用、导管置管的广泛开展等,机会性真菌感染日益增多,且死亡率很高,据报道已经超过50%.

赖型钩端螺旋体溶血素基因HlyX的真核表达及基因免疫

目的 在哺乳动物细胞中表达含有赖型钩端螺旋体溶血素基因HlyX的重组质粒,并检测其作为DNA疫苗诱导小鼠体液免疫应答的效果.方法 以赖型钩端螺旋体全基因组为模板,PCR扩增出目的基因HlyX,以质粒pcDNA3.1为载体,双酶切构建重组质粒,转化大肠杆菌DH5α,双酶切、PCR及测序鉴定重组质粒.将构建成功的重组质粒转染COS-7细胞,通过RT-PCR、Western blot鉴定目的基因的表达.将重组质粒免疫BALB/c小鼠,每两周1次,共3次,ELISA法检测小鼠的体液免疫应答水平.结果 扩增出全长约1100 bp的HlyX基因,重组质粒经双酶切、PCR及测序鉴定表明重组质粒构建成功.RT-PCR检测显示重组质粒转染组能扩增出约1100 bp的目的基因片段,Western blot分析可见在相对分子质量(Mr)40×103左右出现特异性的目的条带.DNA免疫后诱导小鼠产生了较高的抗体水平(1∶6561～1∶19 683).结论 赖型钩端螺旋体溶血素基因HlyX真核表达质粒能够诱导小鼠产生高滴度的特异性抗体,为其作为钩体DNA疫苗的研究和开发奠定了基础.

A、C群脑膜炎球菌结合疫苗免疫原性研究

目的 研究A、C群脑膜炎球菌结合疫苗的免疫原性,包括剂量、免疫记忆及抗原相容性.方法 将不同剂量的A、C群脑膜炎球菌结合疫苗分别免疫小鼠,末次免疫后14 d采集血清测定血清抗体滴度,确定佳免疫剂量后,再分别以单价A群和C群脑膜炎球菌结合疫苗及二价A、C群脑膜炎球菌结合疫苗同时对小鼠分别进行1、2、3针免疫,考察其针次效应和抗原相容性.结果 A、C群脑膜炎球菌结合疫苗中的A抗原和C抗原均以1.25 μg剂量免疫小鼠时,其免疫原性较好.A、C群脑膜炎球菌结合疫苗能够诱导小鼠产生免疫回忆应答,且在二价结合疫苗中的A群耦联物和C群耦联物配伍后无干扰作用,抗原相容性良好.结论 A、C群脑膜炎球菌结合疫苗具有较好的免疫原性和明显的免疫回忆应答,抗原相容性良好.

卡介苗联合Poly I:C接种对新生期小鼠脾脏T细胞的影响

目的 研究卡介苗(BCG)联合Poly I:C新生期接种对小鼠脾脏T细胞功能亚群发育的影响.方法 新生清洁级BALB/c小鼠32只,分4组:对照组、BCG组、Poly I:C组、BCG和Poly I:C联合接种组,新生期接种4周后取脾细胞用流式细胞仪检测CD3+ CD8+ IFN-γ+、CD3+ CD8- IFN-γ+、CD3+ CD8+ IL-4+ 、CD3+ CD8- IL-4+、CIM+ Foxp3+ T细胞的比例,其分别代表Tc1、TH1、Tc2、TH2和调节性T细胞(Treg)亚群.结果 BCG组、Poly I:C组、BCG和Poly I:C联合接种组TH1、Tc1细胞比例明显高于对照组(P＜0.05或P＜0.01),3个接种组间比较差异无统计学意义;Tc2、TH2和Treg比例各组间比较差异没有统计学意义;3个接种组TH1/TH2和总IFN-γ/IL-4比值明显高于对照组(P＜0.05或P＜0.01),联合接种组TH1/TH2比值高于BCG组(P＜0.05),Tc1/Tc2比值各组间差异没有统计学意义;CD4+ Foxp3+ T细胞比例各组间比较差异没有统计学意义.结论 新生期BCG和Poly I:C接种均能促进TH1、Tc1细胞亚群的发育,提高TH1/TH2比值,其联合接种在TH1/TH2水平可能具有一定的协同作用,但不能影响CD4+ Foxp3+ Treg细胞的比例.

巨细胞病毒特异性免疫应答体外检测系统的建立

目的 以巨细胞病毒(CMV)感染的成纤维母细胞为抗原提呈细胞,建立CMV特异性细胞免疫应答的体外检测模型.方法 将CMV-AD169、RV-TB40E-4突变株分别感染人胚肺成纤维母细胞(HELF),流式细胞仪(FCM)检测感染细胞HLA-A * 0201表达强度;将感染的HELF、荷载外源性多肽的自身外周血单个核细胞(PBMC)以及未感染的HELF分别与PBMC共同孵育,FCM检测CD8+ T细胞内IFN-γ的表达作为应答指标.结果 CMV-AD169感染细胞HLA-A * 0201表达强度较未感染组降低78.24%±19.72%,而突变株病毒不影响其表达,而且对AD169感染的HELF无应答的PBMC却对突变株病毒感染的细胞显示出了强阳性应答.AD169感染并荷载外源性多肽的HELF产生的刺激应答率,是感染的HELF和荷载多肽的未感染HELF所诱导应答比率的总和.结论 CMV-AD169下调MHG Ⅰ分子表达,但不减弱细胞提呈外源多肽的能力.RV-TB40E-4是US2-6/US11基因被删除的CMV突变株,不抑制MHC Ⅰ分子表达,从而代表了一种更适宜研究CMV特异性免疫应答的工具.

一种鉴定结核分枝杆菌"北京家族"菌株的新方法

目的 研究结核分枝杆菌"北京家族"菌株鉴定的新方法——RD105缺失检测的可行性.方法 分别应用间隙寡核苷酸分型(Spoligotyping)和RD105缺失检测两种方法对结核分枝杆菌进行"北京家族"的鉴定,比较分析两种方法进行菌株鉴定结果的差异.结果 共对来自北京、福建、新疆和吉林的342株结核分枝杆菌临床分离菌株进行了鉴定,"北京家族"菌株261株,占76.32%.非"北京家族"菌株81株,占23.68%.两种方法鉴定结果的符合度达100%.结论 简单、快速的新方法——RD105缺失检测可替代原始经典方法Spoligotyping用于结核分枝杆菌"北京家族"菌株的鉴定.

美洲大蠊低致敏变应原的制备及抗原性分析

从酶学的角度出发,研究多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)与美洲大蠊变应原粗提液的相互作用及其对变应原粗提液变应原活性的影响,以探索制备美洲大蠊低致敏变应原的方法.

SELEX技术筛选结核分枝杆菌MPT64蛋白DNA适配子方法学研究

目的 利用指数富集配体系统进化(SELEX)技术筛选能与结核分枝杆菌MPT64蛋白特异结合的寡核苷酸适配子.方法 体外合成长度为78个核苷酸的随机ssDNA文库,利用SEL-EX技术筛选,以MPT64蛋白为靶物质进行12轮筛选,利用生物素-亲和素显色系统检测寡核苷酸与蛋白的结合性.结果 SELEX技术筛选MPT64蛋白适配子的技术体系:PCR扩增的佳退火温度为65℃;文库优化时,佳Mg2+的浓度为1.5 mmol/L;不对称PCR法制备ssDNA时,Mg2+的浓度为0.75 mmol/L;以酶联板为介质筛选时,在10轮后筛选达到饱和,且随着筛选轮数的增加,PCR扩增产物的电泳条带逐渐单一、致密,亲和性检测显示第10轮获得的适配子库,比初始的文库亲和性吸光度(A)值增加了9.18倍.将适配子库克隆,随机挑取10个单克隆子,利用混合夹心法检测其与MPT64的亲和性,亲和性范围分布在0.572～1.606之间.结论 已初步筛选到与MPT64蛋白高亲和性结合的DNA适配子.

联合检测AKA、RF及CCP抗体在类风湿诊断中的应用

类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是自身免疫性疾病,可导致关节畸形和运动功能丧失,因此,早期诊断具有重大意义.目前,RA的诊断主要依靠临床表现、自身抗体及X线检查,但不典型、早期RA常被误诊或漏诊.我们联合检测角蛋白(AKA)抗体、类风湿因子(RF)及环瓜氨酸肽(CCP)抗体,有助于提高RA的早期诊断.

分枝杆菌噬菌体D29气溶胶特性的研究

目的 为了研究噬菌体D29气溶胶吸入治疗结核分枝杆菌的可行性,测试了噬菌体D29耐雾化能力、喷雾量、气溶胶粒径等气溶胶特性参数.方法 负压实验室气雾柜内发生噬菌体D29气溶胶,TSI3321气溶胶粒径分析仪测试了气溶胶空气动力学直径.Anderson六级空气微生物采样器测试了生物粒子气溶胶中值直径.据雾化前后噬菌体D29的浓度变化及体积变化得到噬菌体D29的雾化时间存活率和雾化量.结果 噬菌体D29气溶胶空气动力学直径为0.872 μm,生物粒子气溶胶中值直径为2.21 μm.噬菌体D29在雾化5、15、30、45、60 min后的存活率分别为89.78%、77.19%、48.86%、33.99%、30.12%.气溶胶的雾化量为232 μl/min.结论 噬菌体D29气溶胶粒径、耐雾化能力及喷雾量等气溶胶参数可以进一步进行动物气溶胶吸入治疗结核分枝杆菌感染方面的研究.

酵母-β-1,3-D-葡聚糖对荷瘤小鼠免疫功能的影响

葡聚糖是具有生理活性的一类多糖.酵母-β-1,3-D-葡聚糖是利用生物酶法从酵母细胞壁中提取并精制而成的纯天然活性免疫调节剂,本文以荷瘤小鼠为模型研究酵母-β-1,3-D-葡聚糖对小鼠免疫功能的影响.

肺癌靶向通用载体hu3D3/cSA融合蛋白的制备和活性分析

目的 制备一种新型的肺癌靶向通用载体hu3D3与核心链霉亲和素(core-streptavidin,cSA)的融合蛋白hu3D3/cSA,并鉴定其活性.方法 PCR扩增cSA基因,克隆至质粒hu3D3/pET-22b(+)而获得表达载体hu3D3/cSA/pET-22b(+),并在E. coli BL21(DE3)中表达,镍亲和层析柱纯化hu3D3/cSA融合蛋白,采用TEA缓冲液进行复性.SDS-PAGE和Western blot鉴定融合蛋白四聚体的形成.FITC标记hu3D3/cSA,通过荧光显微镜分析hu3D3组分的抗原反应性和特异性,流式细胞术比较hu3D3/cSA和hu3D3与靶点的结合能力;ELISA和Western blot鉴定cSA组分结合生物素(biotin)的能力.结果 获得序列正确的hu3D3/cSA/pET-22b(+)重组子,融合基因在E.coli BL21(DE3)中主要以包涵体的形式表达.纯化复性后的融合蛋白能够形成四聚体复合物,保留了cSA结合生物素的活性,hu3D3组分能与肺癌细胞表面抗原结合,且结合能力与单体hu3D3相比有明显增强.结论 成功制备了具有结合靶抗原和生物素活性的hu3D3/cSA融合蛋白,同时改善了hu3D3组分结合其靶点的亲合力(avidity).因此,hu3D3/cSA可以作为一个通用的肺癌靶向载体,与多种生物素化的抗肿瘤药物或试剂联用,有望为多药物联合靶向治疗肺癌提供一种可行的方法.

丙型肝炎病毒蛋白酶抑制肽构建及活性的初步鉴定

目的 根据丙型肝炎病毒(HCV)丝氨酸蛋白酶4个多肽底物切点的氨基酸序列特异性,设计1个多位点的竞争性抑制多肽序列.方法 采用中心模板法PCR合成多肽基因;利用原核高效表达载体pBVIL1在大肠杆菌HB101中,表达目的多肽;提取包涵体,用离子交换层析纯化蛋白;在体外添加到蛋白酶和NS5A-B片段构建的反应系统中,用SDS-PAGE鉴定多肽对病毒蛋白酶的抑制活性.结果 正确合成了多肽基因,重组载体pBVIL1/IP在HB101中表达了目的多肽;纯化后,获得电泳纯多肽;体外初步测定证实,随多肽浓度增加,蛋白酶底物降解受到抑制.结论 原核表达的重组抑制多肽,体外对HCV蛋白酶活性具有抑制作用.

《中华微生物学和免疫学杂志》书写规范