自然杀伤细胞表面获取 HLA-G1抗原机制研究

目的：自然杀伤细胞（ NK）不表达HLA-G抗原，将其与K562-G1细胞共培养，可检测到NK细胞表面表达HLA-G1蛋白，研究NK细胞表面获取HLA-G1抗原的机制。方法建立稳定表达HLA-G1抗原的K562细胞株；分别将K562-G1、K562、脱落的HLA-G1与NK-92MI细胞共培养，以及将HLA-G1与NK-92MI细胞上的HLA-G受体进行阻断后进行共培养，通过流式细胞术及荧光显微镜技术检测NK-92MI细胞对HLA-G1蛋白的获取情况。通过基于CD107a标记的流式细胞术，检测K562细胞表达HLA-G1前后对NK-92MI细胞杀伤活性的影响。结果 NK-92MI细胞能通过细胞间的相互接触转移快速获取K562-G1细胞表面的HLA-G1蛋白。 HLA-G特异性抗体87G阻断或其受体KIR2DL4特异性抗体＃33和ILT2受体特异性抗体阻断后，均不影响NK-92MI细胞对HLA-G1的获取。功能研究显示，HLA-G1能显著抑制NK细胞对K562细胞的杀伤活性（P＜0．01）。结论 NK细胞通过胞啃机制快速获取HLA-G1蛋白，其转移机制与受体配体间的亲和力、HLA-G1分子胞外结构域及非特异性的被动黏附作用无关。

《中华微生物学和免疫学杂志》征订启事

问号钩端螺旋体磷脂酶C鉴定及其诱导巨噬细胞凋亡机制

目的：确定问号钩端螺旋体（简称钩体） LB361基因产物磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C （ phosphatidylinositol phospholipase C ，L-PI-PLC）功能及其诱导巨噬细胞凋亡的作用与机制。方法采用生物信息学技术分析问号钩体赖型赖株LB361基因序列中PI-PLC结构功能域。采用原核表达系统表达该基因产物（ rL-PI-PLC）。采用IP3荧光偏振试验了解rL-PI-PLC水解PIP2底物产生IP3的活性。采用实时荧光定量RT-PCR及Western blot法分别检测问号钩体赖株感染人THP-1巨噬细胞时LB361基因转录、表达及分泌情况。构建LB361基因转染THP-1细胞株，分别采用激光共聚焦显微镜法和流式细胞术，检测LB361基因产物THP-1通过IP3引起内质网钙释放，从而导致细胞胞内游离钙离子浓度（[ Ca2＋] i）升高并诱导细胞凋亡的作用。结果 rL-PI-PLC能水解PIP2产生IP3，其Km和Kcat值分别为199μmol/L和8．566×10-5 S-1。问号钩体赖株感染THP-1细胞后，LB361-mRNA及L-PI-PLC蛋白表达水平显著升高并外分泌。与未转染正常细胞比较，LB361基因转染THP -1细胞中IP3浓度及[ Ca2＋] i明显升高，从而引起部分 THP-1细胞发生[ Ca2＋] i 依赖性凋亡。结论问号钩体LB361基因产物是磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C，该酶在问号钩体感染巨噬细胞过程中可引起[ Ca2＋] i升高而导致细胞凋亡。

伊伐布雷定对病毒性心肌炎小鼠心肌炎症细胞因子的影响

目的：对比研究单纯降低心率药物伊伐布雷定和β受体阻断剂卡维地洛对柯萨奇B3（ CVB3）病毒性心肌炎小鼠的作用，探讨伊伐布雷定和卡维地洛对急性病毒性心肌炎小鼠心肌炎症因子的影响。方法随机将150只雄性BALB/c小鼠分为4组：空白对照组（ n＝30），心肌炎组（ n＝40），伊伐布雷定组（n＝40），卡维地洛组（n＝40）。后3组经腹腔接种CVB3诱发急性病毒性心肌炎，空白组腹腔注射磷酸缓冲液，接种当天记为第0天，24 h后伊伐布雷定组和卡维地洛组每日灌胃分别给予伊伐布雷定10 mg/kg、卡维地洛10 mg/kg，空白组给予磷酸盐缓冲液灌胃，直至第14天末。于接种第4天、7天、14天随机从各组抽取小鼠测心率后处死取心脏。小鼠心肌病理切片HE染色观察炎症病理改变，半定量RT-PCR检测心肌病毒RNA，半定量RT-PCR和ELISA法检测心肌组织MCP-1、IL-6及TNF-αmRNA和蛋白水平。结果与心肌炎组比较，7 d、14 d伊伐布雷定和卡维地洛组心肌病理损伤明显减轻。与空白组比较，心肌炎组在第4天、7天心肌MCP-1、IL-6及TNF-α的转录水平明显上调，与心肌炎组比较，第4天伊伐布雷定组和卡维地洛组心肌TNF-α转录均下调，第7天两者IL-6的转录下调，仅伊伐布雷定组MCP-1转录下调。蛋白水平改变和mRNA基本一致。结论伊伐布雷定具有和卡维地洛相似地减轻心肌炎小鼠的心肌炎症损害的作用，其显著下调TNF-α和IL-6 mRNA及蛋白水平，效果与卡维地洛相似，此外，伊伐布雷定还能显著下调MCP-1的mRNA和蛋白水平。

小球藻兔防御素 NP-1抗菌机制初探

目的：初步探讨小球藻表达的兔防御素NP-1的抗菌机制。方法通过液体培养抑制测定法、阳离子中和试验和扫描电镜技术，分别测定小球藻表达的兔防御素NP-1对临床分离的1株耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（ MRSA）和1株多重耐药铜绿假单胞菌（ MDR-PA）的抑菌动力学作用、明确正电荷在NP-1抗菌作用中的重要性，以及NP-1对细菌形态结构的影响。结果小球藻表达的兔防御素NP-1对MRSA和MDR-PA的抑菌率在3 h达到80％以上，其中对MRSA的抗菌作用具有浓度依赖性；带有正电荷的精氨酸（0．25％～0．50％）能有效抑制NP-1的抗菌作用；此外，扫描电镜观察到NP-1可分别导致菌体出现孔洞（ MRSA）或变形塌陷（ MDR-PA）。结论小球藻兔防御素NP-1对耐药的革兰阳性菌和革兰阴性菌均有良好的抗菌作用；一定浓度的精氨酸能够竞争性抑制NP-1的抗菌作用；NP-1对MRSA的抗菌机制可能属于“孔洞”学说。

广东地区羊种3型布鲁氏菌基因多态性研究

目的：应用多位点可变数目串联重复序列分型（ multiple locus variable number tandem repeat analysis ， MLVA）技术，初步探讨广东地区羊种3型布鲁氏菌的基因多态性特征分布。方法采用MLVA-16分型技术对广东地区患者分离的羊种3型布鲁氏菌株进行PCR 扩增、琼脂糖凝胶电泳和毛细管电泳等技术，并应用Bio Numerics（Version 5．0）软件进行布鲁氏菌基因多态性研究。结果43株布鲁氏菌菌株间的MLVA分型相似值介于68．2％～100％，在100％的水平上分成32种基因型别，其中27株（62．8％）为单一基因型，另外16株（37．2％）分属于其他5种基因型，各基因型分别含2～5株菌。结论广东地区羊种3型布鲁氏菌MLVA基因型呈现多态性分布特征，没有出现优势基因型别，单一特有基因型占了62．8％。

《中华微生物学和免疫学杂志》书写规范

重组创伤弧菌溶细胞素诱导 THP-1细胞损伤的机制研究

目的：研究重组创伤弧菌溶细胞素（rVvhA）对人单核细胞白血病细胞（THP-1）的损伤机制及其钙离子通道的研究。方法采用倒置显微镜、CCK-8法、Fluo3/AM法、caspase 活性检测等方法测定rVvhA对THP-1细胞的影响，并研究胞外Ca2＋的内流途径。结果 rVvhA作用后细胞形态学变化明显，细胞皱缩、变形甚至裂解，且呈剂量依赖性。12μg/ml rVvhA 作用THP-1细胞1 h后胞外K＋浓度升高，作用6 h后胞外LDH浓度显著升高。 Verapamil、Mibefradil和SKF-96365均不能抑制rVvhA引起的Ca2＋内流。同时rVvhA可导致THP-1细胞的caspase-3和caspase-9活性升高，并呈时间依赖性。结论 rVvhA对THP-1细胞具有明显的损伤作用，且可能通过caspase-9/3途径诱导细胞凋亡，并能引起细胞内Ca2＋浓度升高，升高的Ca2＋可能通过细胞膜上形成的孔道被动入胞。

利用双层固体平板法进行疏螺旋体单菌落分离的研究

疏螺旋体属包括多个人类的致病菌，如引起莱姆病的伯氏疏螺旋体（ Bor-relia burgdorferi）。疏螺旋体的基因组结构特殊，包括染色体和约20个大小不等的质粒。一些质粒在传代培养过程容易丢失，然而却是维持病原菌感染性所必需的。疏螺旋体的单菌落分离及纯培养不能按照常规的微生物学方法进行，因为该菌株只能在复杂的 BSK （ Barbour-Stoenner-Kelly）培养基中缓慢生长。疏螺旋体是一种不好氧的细菌，常规的涂布平板法和平板划线法不利于菌株的生长。本研究利用双层琼脂平板的方法进行疏螺旋体的单菌落分离及纯化，操作简单快速，便于获得遗传背景单一的单克隆菌株。

产IMP-4和KPC-2碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌PMQR基因检测及分子流行病学研究

产碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌是近些年来导致医院内感染常见的条件致病菌之一，其耐药特征、产生碳青霉烯酶的基因型、质粒介导喹诺酮耐药基因（ PMQR）的分布及流行的克隆株等会随地域的差异而不同。我们研究发现本地区24株碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌中均携带 KPC-2基因，还有5株携带IMP-4基因，且24株产酶菌株中均携带PMQR，包括 qnrS112株， qnrA111株， qnrB411株，其中3株同时携带有包括qnrS1、qnrA1、qnrB4基因，1株同时携带qnrS1、qnrA1、qnrB4、acc （6′）-cr 基因；另外17株携带有acc（6′）-Ib基因，其中9株为acc（6′）-Ib-cr基因，7株为acc（6′）-Ib-suzhou基因，1株为acc（6′）-Ib基因野生型。不携带碳青霉烯类酶基因肺炎克雷伯菌的携带1种PMQR基因以上的阳性率（23．7％）显著低于携带碳青霉烯类酶基因菌株（91．7％），差异有统计学意义（χ2＝62．00，P＜0．01）。

结核杆菌 PhoPR 双组分系统与广泛流行的耐药结核杆菌耐药性的相关性研究

目的：通过比较分析不同耐药的结核杆菌临床分离株PhoP基因和PhoR基因的表达水平差异，探讨研究结核杆菌PhoPR双组分系统与新疆地区广泛流行的耐药结核杆菌耐药性是否具有相关性。方法以新疆地区广泛流行的耐药结核杆菌临床分离株为研究对象，分别提取结核分枝杆菌临床分离药物敏感菌株、单纯耐异烟肼的结核杆菌临床分离株（ INH-MTB）、单纯耐利福平的结核杆菌临床分离株（ RFP-MTB）、单纯耐链霉素的结核杆菌临床分离株（ SM-MTB）、单纯耐乙胺丁醇的结核杆菌临床分离株（ EB-MTB）、耐多药结核杆菌临床分离株（ MDR）总RNA，并进行纯度鉴定，运用SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR的方法，分别检测各组结核杆菌菌株的PhoP基因和PhoR基因的表达，比较分析不同耐药的结核杆菌临床分离株PhoP基因和PhoR基因的表达水平的差异。结果与结核分枝杆菌临床分离药物敏感菌株相比，PhoP基因在RFP-MTB中的表达上调1．48倍，在MDR中的表达上调2．74倍，差异有统计学意义（P＜0．05）；与MDR相比，PhoP基因在INH-MTB、RFP-MTB、SM-MTB和EB-MTB中的表达下调0．70、0．50、0．25和0．21倍，差异有统计学意义（P＜0．05）。与结核分枝杆菌临床分离药物敏感菌株相比，PhoR基因在INH-MTB、RFP-MTB、SM-MTB和EB-MTB中的表达分别上调6．33、4．56、2．34和1．85倍，在MDR中的表达上调9．06倍，差异有统计学意义（ P＜0．05）；与 MDR相比，PhoR基因在INH-MTB、RFP-MTB、SM-MTB 和EB-MTB 中的表达下调0．36、0．54、0．35和0．19倍，差异有统计学意义（P＜0．05）。结论在结核分枝杆菌临床分离药物敏感菌株、INH-MTB、RFP-MTB、SM-MTB、EB-MTB和MDR中，结核杆菌PhoP和PhoR基因的表达有差异，结核杆菌PhoPR双组分系统与新疆地区广泛流行的耐药结核杆菌的耐药性具有相关性。

急性期川崎病患儿调节性B细胞改变及意义初探

目的：探讨调节性B细胞（ Breg）在川崎病（ KD）免疫发病机制中的作用。方法急性期KD患儿28例，正常同年龄对照组28例，KD患儿分别于静脉丙种球蛋白（ IVIG）治疗前后直接取血备检。采用流式细胞术分别检测外周血CD19＋CD24 hi CD38 hi Breg、CD4＋CD25＋Foxp3＋调节性T细胞（ Treg）比例及Breg细胞表面共刺激分子CD80、CD86、PD-L1的表达；酶联免疫吸附实验检测培养上清中IL-10蛋白浓度；实时荧光定量PCR （real-time PCR）检测外周血B细胞中IL-10，CD4＋T细胞中Foxp3、CTLA-4和GITR mRNA的表达。结果（1）急性期KD患儿外周血CD19＋CD24hiCD38hi Breg细胞比例及B细胞IL-10表达均明显低于同年龄对照组（P＜0．05），经IVIG治疗后显著上升（P＜0．05）；经体外LPS刺激培养48 h后，急性期KD患儿B细胞培养上清中IL-10浓度仍明显低于同年龄正常对照组[（31．06±8．26） pg/ml vs （46．32±13．91） pg/ml， P＜0．05]；（2）急性期KD患儿CD19＋CD24hiCD38hi Breg细胞表面共刺激分子CD80、CD86、PD-L1表达明显下调（P＜0．05），经IVIG治疗后，CD80和CD86表达虽有所增加，但仍低于同年龄对照组（P＜0．05），PD-L1表达无明显改变（P＞0．05）；（3）急性期KD患儿外周血CD4＋CD25＋Treg细胞比例及相关分子Foxp3、CTLA-4和GITR基因转录水平明显低于正常对照组（P＜0．05），其中CD4＋CD25＋Treg细胞比例与CD19＋CD24hiCD38hi Breg细胞比例呈正相关关系（r＝0．62，P＜0．05），经IVIG治疗后显著上升（P＜0．05）。结论 Breg细胞数量及功能异常可能是导致急性期KD患儿免疫功能紊乱的重要原因之一。

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不同年龄人群接种甲型 H1 N1流感疫苗后1个月内抗体水平的变化

目的：探讨不同年龄人群接种单剂15μg无佐剂甲型H1 N1流行性感冒（流感）病毒裂解疫苗（pandemic A /H1N1 influenza vaccine， A/H1N1InfV）（甲流疫苗）后1个月之内的抗体水平变化规律，为免疫方案的制定提供依据。方法采用血凝抑制试验测定受种者的血凝抑制抗体，比较每一年龄组人群在甲流疫苗接种后3、7、14、30 d的甲流抗体几何平均滴度（ geometric mean titer ，GMT）及增长倍数（ geometric mean increase ， GMI）、阳转率、保护率。结果961人接种了甲流疫苗。其中3，～11岁组在接种甲流疫苗后14 d抗体水平达到高峰，但14、30 d的保护率95％可信区间下限达不到FDA的要求；12～60岁人群在14 d达到高峰，且GMI、阳转率、保护率达到EMEA和美国FDA标准；＞60岁人群在30 d达到高峰，且GMI、阳转率、保护率达到EMEA和美国FDA标准。结论接种1剂甲流疫苗后，12～60岁人群在接种后14 d、＞60岁人群在接种后30 d均能获得有效保护；而3～11岁免前阴性人群在第14、30天达不到FDA关于保护率95％可信区间下限≥70％的要求。

结核分枝杆菌毒素-抗毒素系统的研究进展

毒素-抗毒素系统（toxin-antitoxin system， TAS）早是作为质粒的稳定系统而发现的，这一系统依赖不稳定的抗毒素阻止活性毒素从亲和性蛋白复合物中释放出来。在应激条件下，抗毒素被蛋白酶降解或者消耗，毒素释放后干扰或改变细胞的DNA复制、ATP和细胞壁合成，介导细胞死亡或耐药持久性的形成［1］，毒素也可以作为一种抗防御蛋白进而中和细菌中质粒的抗性［2］。细菌染色体上的TAS与细胞持久化的形成、噬菌体防御、压力调节和程序性细胞增长阻滞相关［3］。根据毒素与抗毒素所形成的亲和性复合物之间的相互作用不同，将TAS分为5种类型，在Ⅰ型 TAS 中，抗毒素是一种小分子RNA，可以抑制毒素的 mRNA，进而抑制毒素的合成。在Ⅱ型TAS中，毒素和抗毒素通过形成蛋白复合物来抑制毒素的毒性。在Ⅲ型TAS中，抗毒素是一种包含RNA的假结体，该假结体可以直接和毒素蛋白结合［4］。在Ⅳ型TAS中，抗毒素蛋白通过与毒素的靶位结合来干扰毒素的毒性。而在Ⅴ型TAS中，抗毒素蛋白裂解编码毒素的mRNA［5］。

分子流行病学在细菌耐药性研究中的应用

流行病学方法在细菌耐药现象研究传统意义上的应用是通过监测、观察以及分析和实验研究等方法来明确耐药细菌分布的规律及其影响因素，借以探讨耐药细菌的流行与传播规律，并为制订预防和控制措施提供科学依据。尽管存在一些不足，此类研究结果在帮助人们认识耐药细菌的传播与流行规律中仍发挥了重要作用［1-2］。与此同时，还有许多研究探讨了不同分子型别耐药细菌以及与细菌耐药性相关的各种因子（如耐药质粒、耐药基因、相关基因组件等）的分布、作用方式与程度、传播规律及其影响因素等问题，即有关细菌耐药性的各种问题。此类研究能够揭示细菌耐药性在耐药细菌中（或间）的存在现状、发生发展和相互传播的规律。将此类研究与耐药细菌流行病学研究（细菌耐药监测和耐药细菌传播相关因素分析等）相结合可构成有关细菌耐药现象的多层次流行病学（ multilevel epidemiol-ogy），涵盖相关的人群特征、细菌群个体或克隆特征、耐药质粒、耐药基因以及相关的移动组件特征等［3-4］。有关细菌耐药性的流行病学研究按照研究内容可分为两大类：一类是通过各种分子分型方法对耐药细菌的分布、传播规律等问题进行流行病学分析，通常被称为耐药细菌的分子流行病学研究［5］。另一类是研究与细菌耐药性相关的各种分子（如质粒、耐药基因以及与其相关的调控基因等）的分布及其与细菌耐药性发生发展过程的关系和影响因素，也就是对与细菌耐药性相关的各种分子进行分布与传播规律等方面的流行病学研究［6］。本研究尝试就以上两类研究进行简单综述，借以与相关领域内的同行们进行探讨。

肺炎链球菌分子分型方法研究进展

肺炎多糖疫苗和结合疫苗的问世，可有效保护一定人群免遭肺炎链球菌的感染侵袭，但目前在世界上很多国家，肺炎链球菌感染仍是一个非常严重的公共卫生问题。按照世界卫生组织（ WHO ）统计资料估计，全世界每年有160万人死于肺炎链球菌感染，其中包括70～100万5岁以下儿童，尤其是2岁以下儿童的死亡率高，这些死亡儿童绝大多数生活在不发达国家和发展中国家［1］。即使在欧美等发达国家，肺炎链球菌也是常见的成年人社区获得性细菌性肺炎的病原体。在这些地区，肺炎链球菌侵袭性疾病的年发病率为10～100／10万人口，因此肺炎链球菌感染的研究越来越引起人们的重视［2-3］。

人血清抗肺炎链球菌荚膜多糖抗体 IgG 定量ELISA 方法的建立与验证

目的：建立WHO推荐的检测人血清抗肺炎链球菌（ Streptococcus pneumoniae）荚膜多糖抗体IgG定量ELISA（Pn PS ELISA）。方法依照WHO推荐的Pn PS ELISA标准操作要求，优化荚膜多糖的包被浓度，筛选合格的ELISA板和二抗；在检测WHO参考实验室提供的质量控制血清验证实验条件的基础上，分别在WHO参考实验室和兰州生物制品研究所有限责任公司（ LIBP）实验室检测16份由LIBP制备的质控血清中抗13种肺炎链球菌血清型（1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、23F）的荚膜多糖IgG抗体浓度。同时，在LIBP 实验室建立了实验室内部质控血清907的检测范围，并评价了LIBP实验室实验间检测值的精确度。结果在WHO参考实验室和LIBP实验室分别检测的16份LIBP质控血清的抗13种肺炎链球菌血清型荚膜多糖IgG抗体浓度具有良好的相关关系（slope＝0．94，r＝0．97， P＜0．05）。 LIBP实验室的检测值有81％落在WHO参考实验检测值±40％范围内，符合评价实验室之间所用方法的75％的数据在±40％的检测值范围内的标准。建立了LIBP实验室内部质控血清907的抗13种肺炎链球菌血清型荚膜多糖抗体IgG的检测值范围。 LIBP实验室质控血清的各血清型IgG抗体浓度的实验间检测值的变异系数（ CV）均＜30％。结论 LIBP实验室成功建立了WHO推荐的检测人血清中抗肺炎链球菌荚膜多糖抗体IgG定量ELISA方法，并确定了LIBP 实验室日常用质控血清907的检测值范围。

同亚型抗血清参考品在甲型 H7 N9禽流感病毒血凝素含量检测中的适用性研究

目的：在无甲型H7 N9禽流感病毒特异性抗血清的情况下，研究现有的H7亚型抗血清用于单向免疫扩散试验（ SRID）的适用性，以建立应急情况下检测抗原含量的方法。方法获得英国国家生物制品检定所（NIBSC）已有的4种H7亚型抗血清参考品，对其制备用毒株与H7N9毒株的血凝素序列进行对比，之后通过双向免疫扩散试验比较其效价，根据同源性比对结果及双扩效价确定适用的抗血清，并以SRID方法验证检测H7N9抗原的可行性。结果 NIBSC 07/278号参考品制备使用的毒株（H7N3亚型）与H7N9血凝素氨基酸序列同源性高，为97．14％；与H7N9抗原的双扩效价达到1∶8。以此抗血清进行SRID试验，H7N9抗原浓度10～40μg/ml时，能够形成清晰的沉淀环，回归曲线线性R2＞0．99。结论在无H7N9特异性抗血清的情况下，NIBSC 07/278编号抗血清能够用于H7 N9疫苗的血凝素含量的应急检测。

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